重组牛乳铁蛋白素在大肠杆菌中的表达

※生物工程 食 品 科 字 2007,VoL 28,No．01 221 重组牛乳铁蛋白素在大肠杆菌中的表达 邢芳芳1,2，印遇龙 1一，黄瑞林1，孔祥峰1，李铁军1，唐志如 1，张友明1,3 (1．中国科学院亚热带农业生态研究所，长沙 湖南 410125；2．中国科学院研究生院，北京 100039； 3．基因桥有限股份公司，德国 德累斯顿 01307) 摘 要：将牛乳铁蛋白素(1actoferricin B)基冈克隆到表达载体pET28a后，转化到BL21大肠杆菌表达系统，筛选 表达温度和诱导剂 IPTG的浓度，使其在原核表达系统中表达，将诱导表达的产物进行 Tricine．SDS．PAGE蛋白电泳 及抑菌活性检测，证明该表达产物是乳铁蛋白素。实验结果表明，Lactoferricin B基因能够在原核表达系统中表达， 表达量约占细菌总蛋白的 21％，而且表达的蛋白质具有生物学活性。 关键词：牛乳铁蛋白素基冈；原核表达系统；Tricine—SDS—PAGE；抑菌活性 Expression of Recombinant Lactoferricin B in E．coli XING Fang-fang ， ，YIN Yu-long ， ， HUANG Rui—lin ，KONG Xian g-feng ， LI Tie-jun ，TANG Zhi一1"11 ，ZHANG You-ming ， (1．Institute of Subtropical Agriculture，Chinese Academy of Sciences，Changsha 410125，China； 2．Graduate University of Chinese Academy of Sciences，Beijiing 100864，China； 3．Gene aridges GmbH，Dresden 01307，Germany) Abstract：After cloning into the expression vector pET28a，the lactoferricin B gene was tran sform ed into BL一21 E．coli prokaryoficexpression system．By selectingexpressiontemperatureandIPTG concentration．1actoferdcinBgenewasexpressed athilghlevelinprokaryotic cells．The expressionoflactoferdcinBWas detectedbytricine-SDS—PAGEprotein electrophoresis andfunctionaltest,anditWas proved tobethelactoferricin B．Th eresultalso showed thatthegeneoflactoferricinBcan behighly expressed in prokaryotic expression system，an dthe expressionproductaccountsforabout21％ of totalbacterialproteinswith biology activity． Key words：lactoferricin B gene)prokaryotic expression system；Tricine-SDS-PAGE)functional test 中图分类号：Q78 文献标识码：A 文章编号：1002．6630(2008)04—0221—04 乳铁蛋~t(1actoferrin，LF)是一种铁结合糖蛋白，存 在于哺乳动物外分泌液和多核淋巴细胞某些颗粒中，具 有抗菌、调节机体铁质转移、抗肿瘤及病毒等多种生 物功能【1-2]，并通过调节多种细胞因予参与机体抗感染和 免疫过程。牛乳铁蛋白素(1actoferricin B，简写为Lfcin B)是牛乳铁蛋~t(1actoferrin B，LFB)在酸性环境下经胃蛋 白酶作用从N端释放的 ‘段 25个氨基酸残基的多肽 LFB 是近年来发现的一种新型抗菌肽，具备抗菌、抑菌、 抗病毒、抗氧化、调节机体的免疫和提高肠道对铁离 子的吸收等作用，其抗菌活性比乳铁蛋白高400多倍[3】。 因为Lfcin B来源于动物本身，具有传统抗生素没有的 作用效果，而且它不会使细菌产生抗药性，也不会残 留于畜产 品中，加之其物化性质和生物学活性独特， Lfcin B成为近年来研究的热点。 Lfcin B不含稀有氨基酸和外源化学成分，是一种 健康安全的产品，具有替代抗生素的巨大潜能。Lfcin 具有营养生理调节作用，提高幼龄动物的免疫机能、改 善动物肠道微生态环境，促进动物健康的作用，用于 饲料与食品中起到天然防霉、防腐剂作用，抑制致病 菌有良好的耐热稳定性，特别是在酸性条件下，加热 甚至是高温、高压处理对其抗菌活性均没有影响，因 此，Lfcin不仅能够耐受饲料与食品加工过程中高温、高 压等剧烈条件，并月．可以在饲料与食品的保存过程中持 续发挥其作用，保持饲料与食品品质，延长贮存期限。 收稿 日期：2007—04—19 基金项目：湖南省重大科技专项(2007FJ1003)；中国科学院海外杰出学者基金项目(2005—1—7)； 国家 自然科学基金项 目(30700581；30771558；30671517；30528006) 作者简介：邢芳芳(1982一)，女，硕士研究生，研究方向为单胃动物营养与分子生物学。E—mail：xff9178@yahoo．com．cn {通讯作者：印遇龙(1956一)，男，研究员，研究方向为单胃动物营养。E—mail：yyulong@hotmail．com 维普资讯 http://www.cqvip.com 222 2007,Vo1．2＆No．O1 食 品 科 学 ※生物工程 Lfcin具有抗真菌和抗脂质氧化等作用，可用作为防霉剂 和抗氧化剂；具有乳化作用，可促进脂肪消化吸收。 由于具有强大生物学功能及安全性等优点，Lfcin B在乳 品、食品以及动物营养中正在进行应用[4】，其表现出良 好的开发前景。因此，乳铁蛋 白素在开发新的绿色、 环保、保健食品添加剂方面具有重要应用价值。本研 究将 Lfcin B基因在原核表达系统中表达，并对表达蛋 白的生物学活性进行初步检测。 1 材料与方法 1．1 表达载体与菌株 质粒pSC101．Cm、表达载体pET28a、HS996大肠 杆菌及表达系统BL21大肠杆菌由德国基因桥有限股份公 司分子生物学实验室张友明博士提供，通过对 pET28a 进行改造得到稳定表达Lfcin B基因的表达载体。 1．2 试剂与工具酶 Taq DNA聚合酶、Ava I、Nco I限制性内切酶、 IPTG、TriCine、SDS、丙烯酰胺、双丙烯酰胺、 TEMED、APS等 大连宝生物工程公司；T4 DNA连接 酶 Promega公司；DNA回收试剂盒、质粒提取试剂 盒 Invitrogen公司 。 1．3 仪器与设备 PCR热循环仪、紫外分析仪、PCR电泳仪、水浴 摇床、SDS．PAGE垂直蛋白电泳仪、分光光度计、XZQ． x100振荡培养箱、TGL台式离心机等。 1．4 Lfcin B基因优化及引物合成 根据 Genebank公布的Lfcin B基冈序列及蛋白序 列，为使目的基因获得稳定表达，用适于在 BL21中表 达的密码子代替那些不适合于在其中表达的密码子优化 Lfcin B基因，优化前后序列见图 1。 根据优化后的目的序列分别设计上游引物和下游引 物，由上海生工生物工程有限公司合成。上游引物： 5 TGGAT ACC ATG GGC TTC AAA TGC CGT CGC TGG CAG TGG 0GT TlG AAA AAA CTG GGTGCTCCG T( r I℃ L('C I．GCGI’GCGC0GrI’G(=GTI℃1 AGG(=G r(：AC GAG GCC CTT；下游引物 ：3'TCA ATTC CCGGG 1广】 CGCCCCGCCCTGCCACTC，并在5’端引物设计了Nco I酶切位点(红色标记)，3’端引物设计了Ava I酶切位 点(红色标记)，以pSC101．Cm为 模板 个人简介word模板免费下载关于员工迟到处罚通告模板康奈尔office模板下载康奈尔 笔记本 模板 下载软件方案模板免费下载 ，扩增片段约为 1 kb。 1．5 LfcinB基冈的克隆 1．5．1 目的基冈扩增 以质粒PSC101．Cm为模板，以5’T(jGAT ACC ATG GGC TTC AAATGCCGTCGC TGG CAG TGG CGTATG 卫 TAGGCGTATCACGAGGCCcrr(下 划线为Lfcin B基因)和3 TCA ATTC CCGC~ TTA CGC CCC GCC CTG CCA CTC为引物，选择50 l体系进行 PCR扩增。扩增程序如下：95℃ 3min，32(95℃ 55s， 54 oC 55s，72℃ lmin)，72℃ lOmin，然后利用 1％琼 脂糖凝胶，1OOV电压进行电泳检测。 1．5．2 载体构建及转化 将 PCR扩增产物和表达载体pET28a(+)分别用Nco I 和 Ava I双酶切，用试剂盒回收后进行连接；将连接产 物转入大肠杆菌 HS996感受态细胞，在含氯霉素(50 g／ m1)的抗性平板上培养过夜，挑取单克隆进行液体培养， 选取阳性重组菌株送上海生工生物工程有限公司测序。 1．5．3 阳性克隆鉴定 测序结果表明，所得片段为目的基因，将连接产 物转入大肠杆菌BL21感受态细胞，在含氯霉素(50pg／ha) 的抗性平板上培养过夜 挑取数个转化菌单菌落，于 少量LB液体培养基(含氯霉素)，37℃培养过夜，质粒 提取试剂盒提取质粒，用Nco I和Ava I双酶切鉴定。 1．6 重组大肠杆菌的诱导表达及表达产物的Tricin-SDS． PAGE电泳分析 从LB抗性平皿培养基上挑取阳性克隆单个菌落，于 5ml LB培养基中37℃摇床培养过夜，第2d转100 l至 CAG TGG Gin Trp AGG GCC A曜 Ala A AAA CTG GGT GCT CC( Lys Leu Gly Ala Pro B 图 1 改造前(A)后(B)的乳铁蛋白素基因序列及氨基酸序列 Fig．1 Fore—and-aft reconstruct gone sequence and amino sequence of lactoferricin B 胁 鲫触 叫 薹耋：薹 ‰ ；i Ⅶ 郇 嗽 m № ‰ ；i 她 ；i Ⅶ 郇 眦 维普资讯 http://www.cqvip.com ※生物工程 食 品 科 学 2007,VoL 28,No．O1 223 50ml LB液体培养基中37℃振荡培养，每 20min测一次 OD值，待菌液达到对数期(OD 一0．5)时，加诱导剂 IPTG至 3mol／ml，诱导5h。 收集诱导表达后的BL2 1菌液，8000r／min离心 10min，沉淀加约 10ml蒸馏水，进行超声破碎。超声 3s／off，4s／on，50循环。超声破碎后的溶液 12000ffmin 离心 20min。取 100ul，于一EP管，加50ul样品处理 液(1／3体积)，煮沸5min，此为上清样品。未诱导的样 品同样处理，作对照。对这两个样品利用本实验室改 进的Tricine．SDS—PAGE凝胶电泳方法电 _7】，电泳完毕 后对凝胶进行双波长扫描，明确 目的蛋白的表达量。并 利用超声破碎后的菌液进行下一步的体外抑菌实验。 1．7 目的蛋白表达、活性分析 为了进一步证明牛乳铁蛋白素在工程菌中获得表 达，利用牛乳铁蛋白素的抗菌作用进行体外抑菌实验。 分别取加IPTG诱导表达后的全菌样品与未加诱导剂诱导 表达的全菌样品 100u l，加到处于接入大肠杆菌DH5 o【 的LB液体培养基中，37℃恒温振荡培养，5h后观察DH5仅 的生长 状 况 。 2 结果与分析 2．1 目的基因的扩增 以pSC101一Cm为模板，利用合成的上游引物、下 游引物进行PCR扩增，扩增产物 1％琼脂糖凝胶，100V 电压下电泳40min。得到 lkb左右的 条带(图2)，大小 与预期结果(1008bp)相等。 M 1008bp M：DNA Marker 100bp~1：PCR扩增产物。 图 2目的基因PCR产物 Fig．2 PCR products of target gene 2．2 表达载体构建及重组质粒酶切鉴定 扩增 片段经 回收纯化 ，连 接到 改造后 的载体 pET28a(+)上，得到的重组质粒载体骨架上含有限制性内 切酶Nco I、Ava I、EcoR I的酶切位点以及氯霉素抗 性基因(图3)。重组质粒转化到大肠杆菌HS996感受态细 胞，挑选阳性克隆进行质粒提取，用Nco I和Ava I双 NcoI、AvaI双酶切 1_7启动子 图 3表达载体构建 流程 快递问题件怎么处理流程河南自建厂房流程下载关于规范招聘需求审批流程制作流程表下载邮件下载流程设计 图 Fig．3 Flow chart of expression plasmid construction M：DNA Marker 100bp：1和 2：质粒双酶切结果。 图 4重组质粒双酶切结果 Fig．4 Results of recombinant plasmid digested by Nco l and Ava 酶切鉴定。重组质粒酶切后经 1％琼脂糖电泳后有符合 大小的片断出现(图4)，鉴定结果表明提取的质粒为重组 表达质粒 。 2．3 表达产物的Tricin—SDS．PAGE分析 分别将未诱导和诱导过夜的BL21大肠杆菌的总蛋白 进行Tricine．SDS—PAGE蛋白电泳。从电泳的结果来看， M ： Fig．5 分子量蛋白 标准 excel标准偏差excel标准偏差函数exl标准差函数国标检验抽样标准表免费下载红头文件格式标准下载 品：1：诱导表达全菌蛋白： 2：未诱导表达全菌蛋白。 图 5 牛乳铁蛋白素电泳图(银染法) Electrophoresis of lactoferricin B(silver blotting) 维普资讯 http://www.cqvip.com 224 20O7,Vo1．28,No．O1 食 品 科 学 ※生物工程 相对与空白对照IPTG诱导的BL21，诱导表达的BL21。 电泳后泳道中分别可见 1条特异性的条带与牛乳铁蛋白 素重组蛋白的理论分子量 3．1kD相符(图5)，由此说明 Lactoferricin B在大肠杆菌BL21中获得稳定表达。 2．4 目的产物表达检测 利用工程菌全菌蛋白溶解液进行抗菌活性检测，结 果如图6所示。加入诱导表达全菌蛋白的菌液相对澄 清，说明加入的蛋白混合物中含有抗菌物质；而加入未诱 导表达全菌蛋白的菌液相对混浊，细菌长势良好，说明 IPTG诱导表达产物为乳铁蛋白素。进而对目的蛋白进行半 定量检测，凝胶双波长扫描结果表明，目的蛋白质质量分 数占全菌蛋白约21％，乳铁蛋白素基因获得高效表达。 l：加入诱导表达的全菌蛋白；2：加入未诱导表达的全菌蛋白。 图 6 牛乳铁蛋白素抗菌活性检测结果 Fig．6 Results of lactoferricin B against bacterium 3 讨 论 牛乳铁蛋白素是近年来发现的 ‘种新型抗菌肽，有 广泛的生物学活性，但是由于价格昂贵等原冈目前还没 有广泛应用[8】。长期以来，如何获得大量廉价牛乳铁蛋 白素，成为研究者们努力解决的难题。通过色谱法 、 超滤法、盐析、酸沉淀等方法制得牛乳铁蛋白，然后 水解制得Lfcin B，以及利用多肽自动合成仪少量合成 Lfcin B及其多种衍生物的方法都有很多 利冈素，冈此 利用基冈工程生产Lfcin B具有广阔的应用前景[2】。 基冈工程生产是一个较为理想的选择，但是由于抗 菌肽分子小，容易被蛋白酶降解，同时由于其表达产 物对宿主菌有害，可造成宿主细菌的自杀，冈此不能 在原核系统中直接表达【9J。本研究利用基因重组技术成 功克隆了Lfcin B基因，在已知的Lfcin B序列的基础上， 根据密码子的兼并性改造个别碱基，确保编码序列的稳 定性。载体pET一28a(+)是一种带有His—Tag的表达载体， 可高效克隆及表达的质粒；BL2 1菌株转化效率高，并 可高拷贝表达质粒，并含有用于高效表达克隆于 pET． 28a(+)的T7噬菌体启动子的表达载体的基冈。冈此，本 研究以pET一28a(+)为载体，与靶基因克隆后，先转化 HS996大肠杆菌菌株内，提取质粒后进行酶切鉴定，然 后再转化人BL21菌株内，对诱导剂IPTG浓度、起始 诱导菌浓度、宿主菌种类等对系统进行了优化，进行 靶基冈的高效表达[21。由于Lfcin B的分子量只有3．1kD， 使用常规的SDS—PAGE方法小能实现Lfcin B的分离，本 实验采用改进的Tricine—SDS—PAGE方法分析工程菌的表 达产物，成功地分离了具有生物活性的Lfcin B。 目前国内关于Lfcin B克隆及应用的研究较少，本 研究对Lfcin B基冈进行了大肠杆菌表达系统表达尝试， 成功克隆了牛乳铁蛋白素基冈，为研究其它动物的乳铁 蛋白素基冈进行了初步探索，为其它乳铁蛋白素的生产 提供了一条可行的路径。得到的Lfcin B为可溶性蛋白， 无需复性，仍保持其生物活性，具有重要的生物学功 能。由于 目前 rf丁场上牛乳铁蛋 白素价格非常高，而且 尚无商品化的牛乳铁蛋白素抗体，冈此本实验中采用体 外抑菌实验进行粗略活性检测。 利用基冈工程手段生产乳铁蛋白素，不但可以提高 Lfcin的生产效率，降低成本，而且可以改造Lfcin和设 计新抗菌肽分子，使之成为新一代肽类抗菌药的来源， 为绿色畜牧业以及营养健康服务。 参考文献： 【2] 【3】 【6】 【7】 【8】 【9] SC瑚田ⅡJD J．VOGELPM．HANS J．霸1e structureofthe antimiero- bial acuve center of lactoferricin B bound to sodium dodecyl sulfate micelles【J】．FEBS Letters，1999，446：213—217． KIM HK，CHUN D S，KIM J S，et a1．Expression of the cationic antimicrobial peptide lactoferricin fused with the anionic peptide in Escherichia coli【J】．Appl Microbiol Biotechnol，2oo6。19：1-9． BEILAMYW，T SEM，YAMAUD瑚M K eta1．Identificationof thebactericidal domain oflactoferrin【J】．Biophys Acta,1992，1121： l30-136． W AKABAYASHI H，UCHIDA K，YAMAUCHI K，et a1． Lactoferrin given in food facilitates dermatophytosis cure in guinea pig models【J】．Journal of Antimicrobial Chemotherapy，2000， 46：595—6o1． SCHAGGER H，VON—JAGOW G．Tricine~sodium dodecyl sulfate． polyacrylamidegdelectrophoresisforthe separationof proteinsinthe range from l to 100 kDa[J]．Anal Biochem,1987，166：368—379． 马歇克DR，门永JT，布格斯RR，等．蛋白质纯化与鉴定实验指南 [M】．2版．朱厚础，等，译．北京：科学出版社。2000：256—259． 汪家政，范明．蛋白质技术手册口咽．北京：北京科学技术出版社，2OOO． 黄海青。汪以真．乳铁蛋白素的研究进展【J】．中国兽药杂志，2004： 38(6)：15—18． PRASAD V，SATYAVATHI V V，SANJAYA，et a1．Expression of biologically active hemagglutinin—neuraminidase protein of peste des pcdts rumir~mtsvirusintransgenicpigeonpea[Cajanuscajan(L)Mill~] 【J】．Plant Science，2004。166(1)：199—205． 维普资讯 http://www.cqvip.com