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生物化学课件.ppt

生物化学课件

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2011-11-12 0人阅读 举报 0 0 暂无简介

简介:本文档为《生物化学课件ppt》,可适用于高等教育领域

生物化学学习生物化学的方法学习生物化学的方法系统性、条理性学习细心耐心、循序渐进分清主次抓住重点做好预习多做习题本课程的考核方式本课程的考核方式听课出勤率课堂提问成绩期末考试成绩本学期讲授内容本学期讲授内容第一章:糖类的结构与性质第二章:脂类的结构与性质第三章:氨基酸(重点)第四章:蛋白质的结构与性质(重点)第五章:酶(重点)第六章:维生素、抗生素与激素第七章:代谢概况、生物能学、生物膜与物质运输第八章:糖酵解(重点)第九章:三羧酸循环(重点)本学期讲授内容本学期讲授内容第十章:电子传递与氧化磷酸化(重点)第十一章:HMP途径、糖异生、乙醛酸循环(重点)第十二章:寡糖、糖原的代谢第十三章:脂肪酸代谢(重点)第十四章:氨基酸代谢第十五章:核苷酸代谢第一章:糖类的结构与性质第一章:糖类的结构与性质本章主要内容一、糖类概况二、糖的旋光性三、单糖(结构、性质、代表性单糖及衍生物)四、寡糖五、复合糖(糖胺聚糖、蛋白聚糖、糖蛋白)六、糖链结构分析糖类寡糖多糖同多糖杂多糖复合糖单糖什么是糖类?基本概念异构旋光异构不对称碳原子对映体构型构象异头物糖苷还原糖判定异构:化合物具有相同的分子式但原子连接次序或原子空间排布不同。构型:具有相同的分子式和结构式但原子在空间的排布不同称之构型。旋光异构:由于存在手性碳(不对称碳原子)而具有旋光性不对称碳原子:与四个不同的原子或基团相连并因此失去对称性的四面体碳。用C*表示。对映体一个不对称碳原子的取代基在空间里的两种取向是物体与镜像的关系并且两者不能重叠。这两种旋光异构体称为对映体。两个对映体具有程度相同但方向相反的旋光性(D与LD与L)和不同的生物活性其他物理和化学性质完全相同。含n个C*的化合物其旋光异构体的数目是n,组成n对对映体。任一旋光化合物都只有一个对映体它的其他旋光异构体在理、化性质都与之不同不是对映体的旋光异构体称非对映体。仅一个手性碳构型不同的非对映体称差向异构体(有几种情况)。异头物单糖由直链结构变成环状结构后羰基碳成为新的手性碳(异头碳)导致C差向异构化产生两个非对映体称之。α、β异头物判断:有种方式。见P。异构结构异构(结构式)立体异构旋光异构(不对称碳原子)几何异构(顺反异构双键或环)糖的构型D、L构型(最远手性碳与甘油醛比较)RS构型(手性碳取代基优先性旋转)糖的立体结构表示Fischer投影式(线形)Haworth式(环式)吡喃型呋喃型透视式注意:糖的构型(D、L)与旋光方向(、)并无直接联系。单糖性质异构化氧化(重点:高碘酸氧化)还原成酯、成醚(酰基化、甲基化反应)形成糖苷(重点)高碘酸氧化:糖中邻二羟基间的CC键被断裂形成二醛基继而有一个醛基被氧化成甲酸。测定聚合度、分支点数目和糖苷键位置糖苷(键):环状单糖的半缩醛或半缩酮羟基与另一化合物发生缩合形成糖苷糖苷键有O苷、N苷、S苷等糖苷是缩醛无醛的性质。重要的糖单糖:甘油醛、二羟丙酮、D核糖、Glc、Gal、Fru、GlcUA、GlcA、Fuc、GlcNAc、MurNAc、NNeuNAc、Sia寡糖:蔗糖、乳糖、麦芽糖、纤维二糖多糖:同多糖:淀粉、纤维素、糖原、几丁质糖胺聚糖(透明质酸、硫酸角质素)、蛋白聚糖杂多糖:细菌多糖(肽聚糖、脂多糖、磷壁酸)糖蛋白:糖肽键(N、O型)糖链(寡糖链具重要功能)α淀粉酶、β淀粉酶!糖链结构分析(重点):以糖蛋白为例分离纯化糖蛋白从糖蛋白释放糖链糖链的分离纯化化学法酶法N糖苷酶FO糖苷酶HPAECPAD凝集素亲和层析GPC糖链的纯度鉴定与相对分子量测定单糖组成的测定完整糖链的测序糖链结构测定的常用方法高碘酸氧化甲基化分析:甲醚基糖醇乙酰化寡糖顺序降解化学法测定直链多糖的聚合度和支链多糖的分支数目确定糖苷键的位置酶法外切糖苷酶:从糖链非还原端内切糖苷酶:从糖链内部本章需掌握的知识点、单糖构型的判定α、β异头物的判定、糖的甲基化、酰基化、高碘酸氧化、硼氢化钠还原、糖苷键形成、重要糖的结构、糖链分析方法本章习题:本章主要内容一、什么是脂质?二、脂肪酸三、三酰甘油四、脂质过氧化五、磷脂六、糖脂七、萜和类固醇八、脂蛋白九、脂质的提取、分离第二章:脂类的结构与性质具体问题、什么是蜡?、生物膜中脂双层的结构、脂肪酸简写符号及代表性的脂肪酸、人体必需脂肪酸与多不饱和脂肪酸家族、前列腺素与阿司匹林、磷脂酸、甘油磷脂与鞘磷脂的结构与极性鞘糖脂的结构、卵磷脂、脑磷脂、心磷脂神经酰胺与脑苷脂、神经节苷脂、磷脂酶的分类及作用部位、胆固醇的结构及其衍生物、血浆脂蛋白的结构、分类与功能上一页脂质的分类化学组成单纯脂质复合脂质衍生脂质取代烃固醇类萜其它皂化性质可皂化脂质不可皂化脂质极性极性脂质非极性脂质生物功能储存脂质结构脂质活性脂质上一页脂质:是一类微溶于水而易溶于非极性溶剂的有机分子大多数是脂肪酸和醇所形成的酯类及其衍生物。两亲化合物:具有极性头部(亲水)和非极性尾部(亲脂)的分子称之。必需脂肪酸:亚油酸和亚麻酸对人体功能必不可少但必须由膳食提供称之。碘值:指g油脂卤化时所能吸收碘的克数。重要概念上一页脂质过氧化:一般是指多不饱和脂肪酸或多不饱和脂质的发生自动氧化产生过氧化物的现象它是典型的活性氧参与的自由基链式反应活性氧:指氧或含氧的高反应活性分子如超氧阴离子自由基、羟基自由基、过氧化氢、单线态氧等的统称上一页脂肪酸概况脂肪酸的种类及简写符号:分为饱和脂肪酸、单不饱和脂肪酸、多不饱和脂肪酸偶数碳与奇数碳脂肪酸(奇数碳脂肪酸含量极少!)简写符号用碳数:双键数△双键位号(含顺反式)表示如:△c,c。多不饱和脂肪酸家族:分为ω和ω系列(指离羧基最远的双键到甲基末端个碳和个碳)。如亚油酸和γ亚麻酸为ω系列而α亚麻酸为ω系列。人体内二者不能互转!且二者对血脂的影响不同。见页表格。三酰甘油的化学性质三酰甘油的化学性质水解与皂化(皂化值)氢化和卤化(碘值)乙酰化(含羟基乙酰化值)酸败与自动氧化(酸值)皂化值:皂化g油脂所需的KOHmg数碘值:g油脂卤化时所吸收的碘的克数乙酰值:中和g乙酰化物所释放的乙酸所需要的KOHmg数酸值:中和g油脂中的游离脂肪酸所需的KOHmg数重要的脂质磷脂甘油磷脂鞘磷脂卵磷脂脑磷脂脂肪酸必需脂肪酸(亚油酸、亚麻酸)DHAEPA(ω系列)花生四烯酸(衍生物为类二十碳烷:如前列腺素等)心磷脂鞘糖脂鞘脂类神经酰胺鞘胺醇神经节苷脂脑苷脂磷脂酸饱和脂肪酸:月桂酸、软、硬脂酸、花生四烯酸萜和类固醇萜和类固醇萜:由两个或多个异戊二烯单位组成如类胡萝卜素为四萜单萜、倍半萜等。类固醇:即甾类环戊烷多氢菲衍生而来胆固醇衍生物激素:类胆汁酸维生素D脂蛋白:由脂质和蛋白质以非共价键结合而成的复合物血浆可分为乳糜微粒、VLDL、IDL、LDL、HDL五类血浆脂蛋白的结构与各自的功能!其它胆固醇的结构与极性!上一页第章:氨基酸(重点)氨基酸分类氨基酸的酸碱性质氨基酸的化学反应氨基酸混合物的分离知识点氨基酸:是蛋白质的构件分子具有酸碱性质、手性、聚合能力、特定的侧链结构及多样的化学反应兼性离子:指氨基酸分子含有一个正电荷和一个负电荷的形式。在氨基酸晶体中或中性水溶液中以兼性离子形式存在等电点:指氨基酸处于净电荷为零的兼性离子状态时的pH。等电点与离子浓度无关只决定于等电兼性离子两侧的pKa值氨基酸类别非蛋白质氨基酸蛋白质氨基酸(种)酸性氨基酸天冬氨酸谷氨酸碱性氨基酸赖氨酸组氨酸精氨酸中性氨基酸极性氨基酸非极性氨基酸丝氨酸苏氨酸半胱氨酸酪氨酸天冬酰氨谷氨酰胺甘氨酸丙氨酸亮氨酸异亮氨酸苯丙氨酸甲硫氨酸色氨酸脯氨酸颉氨酸氨基酸的酸碱性质根据酸碱质子理论HAA+H氨基酸是两性电解质既是质子供体又是质子受体。当氨基酸完全质子化时可看作是多元酸COOH和NH可以发生解离用Ka表示它们的解离常数在氨基酸溶液中pH值计算公式如下:pH=pKa+lg(质子受体质子供体)当pH大于等电点时氨基酸带净负电荷当pH小于等电点时氨基酸带净正电荷!在一定的pH范围内氨基酸溶液的pH离等电点愈远氨基酸所携带的净电荷愈大。氨基酸的化学反应α氨基参加的反应与亚硝酸反应(生成羟基氨基酸和氮气)与酰化试剂反应(氨基被酰基化而被保护)烃基化反应DNFB反应(生成DNP氨基酸)PITC反应(生成PTH氨基酸)形成西佛碱反应(与醛类化合物)脱氨基反应α羧基参加的反应成盐成酯成酰氯(与二氯亚砜等)脱羧基反应叠氮反应(氨基酸酯与肼、亚硝酸)α氨基与α羧基共同参加反应与茚三酮反应(氨与还原茚三酮发生作用生成紫色物质)成肽反应侧链R基参加的反应酪氨酸酚羟基组氨酸咪唑精氨酸胍基色氨酸吲哚基半胱氨酸巯基氨基酸的旋光性与光谱性质氨基酸的旋光性:氨基酸的构型(指α碳)也以甘油醛为参考物从蛋白质的酸水解或酶水解液中得到的都是L型但D型氨基酸在自然界也存在蛋白质用碱水解或有机合成氨基酸时得到的都是无旋光性的DL消旋物氨基酸的光谱性质:参与蛋白质组成的多种氨基酸在可见光区没有光吸收在红外区和远紫外区都有光吸收但在近紫外区只有芳香族氨基酸有光吸收氨基酸混合物的分析分离分离方法柱层析纸层析(相对迁移率非极性性质)薄层层析离子交换层析(电荷和非极性)气相层析高效液相层析氨基酸洗脱顺序的判定:氨基酸与树脂的亲合力主要决定于它们之间的静电吸引其次是氨基酸侧链与树脂聚苯乙烯之间的疏水相互作用亲和力愈大愈难洗脱!第四章:蛋白质(重点)第四章:蛋白质(重点)蛋白质概况蛋白质的共价结构蛋白质的三维结构蛋白质的结构与功能的关系蛋白质的分离、纯化与鉴定Ⅰ蛋白质概况蛋白质的化学组成:碳()、氢()、氧()、氮()、硫()、其它元素微量蛋白质的平均含氮量为此为凯氏定氮法测定蛋白质含量的基础。蛋白质是一类最重要的生物大分子英文称protein意为“最原初的第一重要的”。分类Ⅰ单纯蛋白质(如清蛋白、球蛋白、组蛋白、谷蛋白、硬蛋白等)缀合蛋白质(如糖蛋白、脂蛋白、核蛋白、金属蛋白、黄素蛋白等)分类Ⅱ:按生物学功能可将蛋白质分为酶、调节蛋白、结构蛋白、转运蛋白等等分类Ⅲ分类Ⅳ纤维状蛋白质(一般不溶于水。典型的有:胶原蛋白、弹性蛋白、角蛋白、丝蛋白、肌球蛋白等)球状蛋白质(可溶性好。典型的有:胞质酶类等)膜蛋白(与细胞的膜系统结合而存在)单体蛋白质(寡)多聚蛋白质蛋白质结构的层次构象:指具有相同结构式和相同构型的分子在空间里可能的多种形态构象形态间的改变不涉及共价键的破裂!每一种天然蛋白质都有自己特有的空间结构或三维结构称之为蛋白质的构象一个给定的蛋白质可以有多种构象但只有一种或少数几种在能量上是有利的。蛋白质的结构一级结构(即共价结构指多肽链的氨基酸序列)二级结构(指多肽链借助氢键形成α螺旋和β折叠片)三级结构(指多肽链借助各种非共价键弯曲、折叠成具有特定走向的紧密球状结构)四级结构(指多聚蛋白质的各亚基之间在空间上的相互缔合关系)蛋白质的一级结构即多肽链的氨基酸序列决定蛋白质的高级结构!蛋白质的功能:催化、调节、转运、储存、运动、结构组分、支架作用、免疫、异常功能Ⅱ蛋白质的共价结构(一级结构)氨基酸残基肽(键)蛋白质一级结构的测定氨基酸序列与生物功能肽的人工合成知识点氨基酸残基:肽链中的氨基酸由于参加肽键的形成因而不在是原来完整的分子称为氨基酸残基两个氨基酸形成一个肽键时失去一分子水因此失去的水分子数比氨基酸残基数少一个。每个氨基酸残基的平均分子量为。肽:由两个或多个氨基酸残基通过肽键相连而形成的化合物肽有寡肽和多肽之分。一条肽链通常在一端含有一个游离的末端氨基称为N末端而另一端含有一个游离的末端羧基称为C末端肽键具有部分双键的性质肽键比一般碳氮单键短与肽键相连的氢原子和氧原子呈反式构型肽键不可自由旋转肽的理化性质:①肽键的酰氨氢不解离肽的酸碱性质主要决定于肽键中的游离末端αNH、αCOOH及侧链R基上的可解离基团②肽中末端α羧基的pKa值比游离氨基酸的大末端α氨基的pKa值比游离氨基酸的小③游离的α氨基、α羧基和R基可发生与氨基酸中相应的类似反应如茚三酮反应等④蛋白质部分水解后所得的肽若不发生消旋则具有旋光性短肽的旋光度约等于组成氨基酸的旋光度之和较长的肽的旋光度则不是简单加和活性肽:具特殊的生物学功能的肽段如脑啡肽、谷胱甘肽、肌肽等肽蛋白质一级结构的测定测定多肽链的数目蛋白质测序的步骤拆分多肽链断开多肽链内的二硫键测定每一肽链的氨基酸组成鉴定多肽链的N末端和C末端裂解多肽链为较小的肽段测定各肽段的氨基酸序列利用重叠肽重建完整多肽链的一级结构确定二硫键的位置蛋白质测序的重要方法N末端测定二硝基氟苯(DNFB)法:肽游离末端NH与DNFB反应生成DNP肽最后水解生成黄色DNP氨基酸丹磺酰氯(DNS)法:用DNS取代DNFB生成DNS氨基酸苯异硫氰酸(PITC)法:生成PTH氨基酸从肽上断裂下来氨肽酶法:外切酶但效果不好C末端测定肼解法:测定C末端的最重要的化学方法肽与肼反应除C末端氨基酸游离外其他氨基酸转变为氨基酸酰肼化物还原法:C末端氨基酸用硼氢化锂还原成相应的α氨基醇羧肽酶法:最有效、最常用羧肽酶A羧肽酶B羧肽酶C羧肽酶Y二硫键的断裂过甲酸氧化法:将二硫键氧化成磺酸基巯基化合物还原法:将二硫键还原成巯基然后用烷基化试剂如碘乙酸保护巯基防止其重新被氧化氨基酸组成的测定:酸水解:是主要方法多用HCl同时辅以碱水解所得氨基酸不消旋但Trp全部被破坏SerThrTyr部分破坏Asn和Gln的酰氨基被水解生成Asp和Glu多肽链的裂解酶裂解:胰蛋白酶:专一性强断裂Lys或Arg的羧基参与形成的肽键糜蛋白酶:断裂PheTrpTyrLeu等疏水氨基酸的羧基端肽键嗜热菌蛋白酶:专一性差断裂ValLeuPheTyrTrp等氨基参与形成的肽键胃蛋白酶:在酸性条件稳定肽键两侧均为疏水氨基酸。在确定二硫键位置时常用到此酶。其它酶:略化学裂解:溴化氰(CNBr):只断裂Met的羧基形成的肽键羟氨(NHOH):在pH时专一性断裂AsnGly之间的肽键其它条件下不专一肽段的氨基酸测序Edman化学降解法:用Edman试剂PITC与游离氨基作用生成PTH氨基酸并可用各种层析技术分离用此法降解一次可连续测出个氨基酸残基的序列工作量大操作麻烦现改用蛋白质测序仪。酶解法:利用氨肽酶和羧肽酶局限性大有困难质谱法:质谱仪由核苷酸序列推定法:mRNAcDNA推出cDNA的核苷酸序列然后推测出蛋白质的氨基酸序列肽段在肽链中次序的确定:需借助重叠肽。重叠肽:由于不同的断裂方法即断裂的专一性不同产生的切口彼此错位使两套肽段正好跨过切口而重叠的肽段获得重叠肽需要两种或两种以上的不同方法断裂同一多肽样品得到两套或多套肽段。二硫键位置的确定:一般采用胃蛋白酶水解原来的含二硫键的蛋白质。一是胃蛋白酶专一低切点多得到含有二硫键的肽段较小易分离鉴定二是在酸性条件下有利于防止二硫键发生交换反应。蛋白质的氨基酸序列与生物功能肽合成同源蛋白质:在不同生物体中行使相同或相似功能的蛋白质称同源蛋白质。同源蛋白质具有共同的进化起源。同源蛋白质具有明显的氨基酸序列相似性称之为序列同源。根据同源蛋白质的氨基酸序列资料可建立系统树(进化树)。两个物种的同源蛋白质其序列中氨基酸的差异数目与这些物种间的进化发生差异是成比例的。蛋白质激活:在生物体内有些蛋白质是以前体形式合成不具有活性只有按一定方式裂解除去部分肽链后才具有生物活性称之为蛋白质激活。如酶原激活。肽的人工合成:氨基酸共聚合(由一种或两种氨基酸反应)控制合成(由不同氨基酸按一定顺序):接肽反应需接肽试剂为避免接肽试剂与某些活泼基团反应故在接肽前须首先将这些基团加以封闭或保护如氨基保护或羧基保护等。在正常条件下羧基和氨基之间不会自发形成肽键即氨基或羧基需活化通常是羧基活化。固相肽合成:是控制合成技术的巨大进步利用固相肽合成仪已成功合成多种肽和蛋白质。其实质是肽的羧基端第一个氨基酸共价挂接在树脂上然后加入氨基受保护的第二个氨基酸并发生缩合反应形成肽键依次类推。最后是肽与树脂断裂并去掉氨基端的保护基团。Ⅲ蛋白质的三维结构研究蛋白质构象的方法:至今研究蛋白质三维结构的成就主要是应用间接的X射线衍射法研究溶液中蛋白质构象的光谱学方法(了解)。稳定蛋白质三维结构的作用力非共价键(次级键)氢键范德华力疏水作用:突出地位离子键(盐键、静电引力)共价键:二硫键重要作用蛋白质的二级结构无规卷曲β转角β折叠片α螺旋:最常见、最典型、最丰富的二级结构元件α螺旋:是重复性结构每圈螺旋站个氨基酸残基沿螺旋轴上升nm即螺距值由氢键封闭的环为元环一般为右手螺旋分子内或链内氢键使之稳定减少R基间的相互作用或β碳原子无分支结构均利于其稳定而Pro存在可中断之。非重复性结构β折叠片:为重复性结构β折叠片的肽链处于曲折的伸展状态借助链间或肽段间的氢键而稳定分为平行和反平行β折叠片平行的比反平行的更规则。纤维状蛋白质:动物体的基本支架和外保护成分分子具规则的线性结构。纤维状蛋白质不溶性(硬蛋白)可溶性蛋白角蛋白胶原蛋白:结缔组织中(骨、皮肤等)大量存在弹性蛋白:存在于结缔组织α角蛋白:主要存在于毛发中β角蛋白:天然存在于丝中其它肌球蛋白血纤蛋白原其它说明:α角蛋白经充分伸展后可转变成β角蛋白即β折叠片结构。球状蛋白质:其种类远比纤维状蛋白质多蛋白质结构的复杂性和功能的多样性主要体现在球状蛋白质球状蛋白质的整个肽链没有均一的二级结构但具有多种二级结构元件如α螺旋、β折叠片、无规卷曲等由此构建的三级结构结构域并将球状蛋白质分成大类其三维结构具有明显的折叠层次且疏水测链球状分子内部亲水侧链暴露在分子表面在多数的胞内酶、血浆蛋白及蛋白类激素都属于球状蛋白质。超二级结构:由若干相邻的二级结构元件组合在一起彼此相互作用形成种类不多有规则的二级结构串并在多种蛋白质中充当三级结构的构件称为超二级结构。已知有种基本形式:αα、βαβ、ββ。结构域:在多肽链上由二级结构元件或超二级结构形成的相对独立的紧密球状实体是三级结构的局部折叠区。较小的球状蛋白质或亚基是单结构域而较大的球状蛋白质或亚基是多结构域。结构域可分类:全α结构、αβ结构、全β结构和富含金属或二硫键结构域。蛋白质变性与蛋白质折叠蛋白质变性:天然蛋白质分子在受到理化因素的作用时导致溶解度降低、不对称性增高、生物活性丧失及理化特性改变此过程称之为蛋白质变性。蛋白质变性的实质是分子中次级键被破坏引起天然构象解体。变性不涉及共价键破坏即蛋白质一级结构仍保持完好。当变性因素除去后变性蛋白质又可重新回复到天然构象此为蛋白质的复性。是否蛋白质变性与复性可逆仍有疑问。蛋白质折叠:蛋白质折叠不是随机的而是通过累积选择找到自由能最低的构象折叠需要折叠酶和分子伴侣参加。分子伴侣:是一类与蛋白质折叠有关的蛋白质家族(来源相同、结构相似、功能相关)它们通过抑制新生肽链不正常的聚集并排除与其他蛋白质不合理的结合而协助多肽链的正确折叠。亚基缔合与四级结构:在同多聚体蛋白质中原体就是亚基而在杂多聚体蛋白质中原体是由不同的亚基组成亚基缔合的驱动力主要是疏水相互作用亚基缔合的专一性由相互作用的表面上的机性基团之间的氢键和离子键决定。Ⅳ蛋白质的结构与功能的关系肌红蛋白和血红蛋白是两个研究得最透彻的蛋白质它们是蛋白质结构与功能的范例。肌红蛋白是哺乳动物肌肉中储氧的蛋白质它和血红蛋白的亚基在氨基酸序列上具有明显的同源性它们的构象和功能也十分相似。肌红蛋白珠蛋白:含个氨基酸残基为条肽链辅基血红素:原卟啉Ⅸ与Fe的络合物称血红素。卟啉化合物有很强的着色力使生物组织呈现特定的颜色。卟啉环中心的铁原子有个配位键其中个与四吡咯环的N原子相连另个沿垂直于卟啉环面的轴分布在环面的上下这两个键合部位分别称为第和第配位。铁原子可以是亚铁(Fe)或高铁(Fe)相应的血红素称为亚铁血红素和高铁血红素相应的肌红蛋白称为亚铁肌红蛋白和高铁肌红蛋白。类似的命名也用于血红蛋白。其中只有亚铁态的蛋白质才能结合O。在肌红蛋白分子中血红素共价地结合于肌红蛋白分子的疏水空穴中。其中血红素铁在第配位键与珠蛋白第位His残基的咪唑N配位结合第配位键处于开放状态是O的结合部位。当第位被O分子所占据时即为氧合肌红蛋白血红素中Fe能进行可逆氧合作用。血红素的铁原子如果处在水环境则容易被氧化成Fe失去氧合能力此时HO分子代替O成为Fe的第个配体。CO能与O竞争第配位键且结合能力远大于O。血红蛋白(Hb)的主要功能是在血液中结合并转运氧气它存在于红细胞中。Hb的结构:脊椎动物的Hb由个多肽链亚基组成其中个是一种亚基个是另一种亚基。如成人的血红蛋白主要是HbA亚基组成为αβ次要组分是HbA亚基组成为αδ每个血红蛋白分子都有个血红素每个血红素分别位于每个多肽链中的裂隙处并暴露在分子的表面。氧合过程中的构象变化:氧合作用显著改变Hb的四级结构且氧合血红蛋白和去氧血红蛋白具有不同的构象。氧合曲线和别构效应:氧合曲线呈S形曲线(氧饱和度与氧分压之间)即血红蛋白的氧合具有正协同性同促效应一个O的结合增加同一Hb分子中其余空的氧合部位对O的亲合力Hb对O亲和力的影响因素:H、CO促进O从血红蛋白中释放O也促进H、CO在肺泡毛细血管中释放BPG(二磷酸甘油酸)降低Hb对O的亲和力其只与去氧血红蛋白结合。血红蛋白分子病:导致一个蛋白质中氨基酸改变的基因突变能产生分子病这是一种遗传病。了解最清楚的分子病是镰刀状细胞贫血病该病人的不正常的血红蛋白称HbS它只是在两条β链的N端第位上Glu被Val置换。这一改变使血红蛋白表面产生一个疏水小区导致血红蛋白聚集成不溶性的纤维束并引起红细胞镰刀状化和输氧能力降低。地中海贫血是由于缺失一个或多个编码血红蛋白链的基因造成的。免疫球蛋白:人类具有类免疫球蛋白每一类别的生物学功能不同。最丰富的是IgG类它由条多肽链组成条重链条轻链。通过二硫键连接成Y形结构的分子。靠近Y的两臂顶端的结构域是可变区形成两个抗原结合部位。其它抗体有IgA:主要存在于人体分泌物中如唾液、泪、乳中IgM:只存在于血液中抵制入侵血液的细菌IgG:血液中最丰富的抗体也是唯一能通过胎盘而进入人体的抗体IgE:在过敏反应中起重要作用的抗体。蛋白质的分离纯化蛋白质的分离和纯化主要是利用蛋白质之间各种特性的差异包括蛋白质分子的酸碱性质、分子的大小和形状、溶解度、吸附性质和对配体分子的特异亲合力。蛋白质的酸碱性质:蛋白质是两性电解质。在蛋白质分子中可解离基团主要来自侧链上的功能团此外还有少数的末端α羧基和α氨基。可以把蛋白质分子看作是一个多价离子所带电荷的性质和数量是由蛋白质分子中的可解离基团的种类和数目以及溶液的pH所决定的。对某一种蛋白质来说在某一pH时它所带的正电荷与负电荷恰好相等即净电荷为零这一pH称蛋白质的等电点。蛋白质的等电点在中性盐存在下可发生明显的变化这是由于蛋白质分子中的可解离基团可与中性盐中的阳离子或阴离子相结合。在没有其他盐类干扰时蛋白质的质子供体基团解离出来的质子数与质子受体基团结合的质子数相等时的pH称为蛋白质的等离子点。蛋白质分子的形状:测定蛋白质分子的形状或构象最精确的方法是X射线晶体结构分析但这种方法只能测定晶体状态的蛋白质空间结构。对于溶液中的蛋白质分子的形状只能借助间接的方法来描述蛋白质分子构象的轮廓。测定蛋白质分子相对质量的方法根据化学组成测定最低相对分子质量:测定某一微量元素或某一氨基酸的含量如铁原子或色氨酸并假设蛋白质分子中只有一个铁原子或一个色氨酸即最低相对分子质量=铁的原子量铁的百分含量渗透压法:在半透膜存在时蛋白质溶液将产生渗透压(平衡时的静水压力)。理想溶液的渗透压与溶质的浓度呈线性相关其关系可用范托夫公式表示:π=cRTMr在高分子溶液中πc=RTMrKc渗透压法简单、准确、且不受蛋白质分子的形状和水化程度影响但受pH的影响不能区别溶液中蛋白质分子是否均一。沉降法:离心力作用沉降速率法:单位离心场的沉降速度是个定值称沉降系数s。见P页沉降平衡法:沉降产生浓度梯度凝胶过滤法:标准蛋白质(已知Mr和斯托克半径)和待测蛋白质必须具有相同的分子形状(接近球体)分子形状为线型或与凝胶发生吸附的蛋白质不可用此法测定。SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳法:加入SDS和少量巯基乙醇则电泳迁移率主要取决于其相对分子质量而与电荷和分子形状无关。蛋白质的胶体性质:蛋白质溶液属于胶体系统其具备形成胶体系的条件:分散相(蛋白质分子颗粒)的质点大小在~nm能在分散介质中作布朗运动分散相的质点带同种电荷不易凝聚成大颗粒而沉淀分散相的质点能与溶剂形成溶剂化层如水化层而不易凝聚。蛋白质在溶液中的稳定性是有条件的相对的。如果条件改变则蛋白质就会从溶液中沉淀出来如改变质点大小、电荷或水化层等。沉淀蛋白质的方法如下:盐析法:加入大量的中性盐脱去水化层而沉淀有机溶剂沉淀法:加入极性的有机溶剂如甲醇等脱去水化层并增加质点间的相互作用而沉淀重金属盐沉淀法:当pH大于等电点时蛋白质颗粒带净负电荷易与重金属离子结合成不溶性盐而沉淀生物碱或酸类沉淀法:当pH小于等电点时蛋白质颗粒带净正电荷易与生物碱或酸根负离子结合成不溶性盐而沉淀加热变性沉淀法:蛋白质因加热变性而凝固蛋白质沉淀法蛋白质纯化的总目标是增加制品的纯度即设法除去变性的和不需要的蛋白质以增加单位蛋白质重量中所需蛋白质的含量或生物活性。分离纯化蛋白质的程序为:前处理(细胞或组织处理)、粗分级分离(除去杂蛋白)和细分级分离。蛋白质的分离纯化方法分子大小透析和超过滤:透析指利用蛋白质分子不能通过半透膜而与小分子分离超滤是利用压力或离心力使小分子溶质通过半透膜而蛋白质被截留在膜上而分离。密度梯度离心:蛋白质颗粒在具有密度梯度的介质中离心时质量和密度大的颗粒比质量和密度小的颗粒沉降得快且每种蛋白质颗粒沉降到与其自身密度相等的介质密度梯度时即停止不前最后各种蛋白质在离心管中被分离成不同的区带。见P页。凝胶过滤:即分子排阻层析。凝胶颗粒内部为多孔的网状结构。大分子最先流出层析柱。溶解度等电点沉淀和pH控制盐溶和盐析:中性盐在低浓度时可增加蛋白质的溶解度即盐溶。原因是蛋白质分子吸附盐类离子后带电层使蛋白质分子彼此排斥而与水分子相互作用加强当离子强度增大到足够高时此时与蛋白质疏水基团接触的自由水被移去以溶剂化盐离子导致蛋白质疏水基团暴露使蛋白质因疏水作用凝聚沉淀。有机溶剂分级分离法:一是降低介质的介电常数二是与蛋白质争夺水化水。温度沉淀:温度对溶解度有影响低温稳定高温不稳定。在~℃大部分的球状蛋白质溶解度随温度升高而增加。蛋白质分离纯化方法电荷电泳(净电荷、分子大小、形状)区带电泳聚丙烯酰氨凝胶电泳(PAGE)毛细管电泳离子交换层析等电聚焦:外加电场时蛋白质混合物在具有pH梯度的介质中移向并聚焦(停留)在等于其等电点的pH处形成区带。层析聚焦:层析柱中建立连续的pH梯度蛋白质样品由柱上端随缓冲液的展开而聚焦在各自的等电点pH处形成区段。吸附:吸附层析吸附剂(硅石、氧化铝、活性碳)和疏水吸附剂与待分离分子和杂质分子的吸附与解吸能力不同。特异亲和力:亲和层析其它:如高效液相层析(HPLC),快速蛋白液相层析(FPLC)蛋白质纯度的鉴定方法:采用物理化学方法如电泳、离心沉降、HPLC和溶解度分析等。纯的蛋白质电泳时其电泳图谱只呈现一个条带或峰离心时以单一的沉降速度移动纯的蛋白质在一定的溶剂系统中具有恒定的溶解度即溶解度曲线只有一个折点在折点以前直线斜率为在折点以后斜率为零此外N末端分析也用于纯度鉴定(单体蛋白质而言)。必须指出采用任何单独的一种方法鉴定纯度只能作为蛋白质均一性的必要条件而非充分条件即蛋白质往往在一种鉴定中表现为均一性而在另一种鉴定中又表现为不均一性。蛋白质含量测定与纯度鉴定:测定蛋白质含量的常用方法有:凯氏定氮法、双缩脲法、Folin酚试剂法(Lowry法标准测定方法)、紫外吸收法、染料(考马斯亮蓝)结合法、胶体金法(带负电的疏水胶体洋红色遇蛋白质变蓝色灵敏度最高)第五章:酶(重点)酶概论酶促反应动力学酶的作用机制和酶的调节酶概论知识点酶的本质全酶辅酶辅基单体酶寡聚酶多酶复合体酶的分类酶的专一性酶活力酶单位比活力转换数核酶抗体酶固定化酶酶具有生物催化功能的蛋白质或核酸。酶作为生物催化剂具有高效性、高度专一性、活性调控和易失活等特点。多酶复合体由几种酶靠非共价键彼此嵌合而成也称酶系。酶的分类国际酶学委员会根据催化反应类型将酶分为大类即氧化还原酶类、转移酶类、水解酶类、裂合酶类、异构酶类和连接酶类。分别用~来表示在根据底物中被作用的基团或键分为亚类每一亚类在细分为亚亚类等亚类和亚亚类均按顺序编成等。每一个酶的分类编号由个数字组成数字间用“”隔开编号前冠以EC(EnzymeCommision)。酶活力即酶活性指酶催化某一化学反应的能力酶活力的大小可以用在一定条件下所催化的某一化学反应的反应速率来表示二者呈线性相关。所以测定酶活力就是测定酶促反应速率酶促反应速率可用单位时间内底物的减少量或产物的增加量来表示。酶单位(U)在一定条件下一定时间内将一定量的底物转化为产物所需的酶量。酶的含量用每克酶制剂或酶毫升酶制剂含有多少酶单位表示(Ug或Uml)。国际单位(IU):在最适反应条件下(温度℃)下每分钟内催化微摩尔底物转化为产物所需的酶量为一个酶活力单位即IU=umolmin。Katal单位(Kat):在最适条件下每秒钟催化摩尔底物转化为产物所需的酶量定为Kat单位。酶的比活力每mg蛋白质所含的酶的活力单位数表示其代表酶的纯度也可用来比较每单位质量蛋白质的催化能力。转化数在一定条件下每秒钟每个酶分子转换底物的分子数或每秒钟每微摩尔酶分子转化底物的微摩尔数。抗体酶一种具有催化能力的免疫球蛋白(抗体)即抗体具有酶的属性也称催化性抗体。核酶(ribozyme)某些具有催化功能的RNA即为核酶。核酶的发现开辟了生物化学研究的新领域提出了生命起源的新概念:即RNA可能早于蛋白质和DNA是生命起源中首先出现的生物大分子。酶的专一性即酶对底物的高度选择性酶一般只能催化一种或一类反应作用于一种或一类底物。酶的专一性可分为结构专一性和立体异构专一性用“诱导契合说”解释酶的专一性已被广泛认同。酶的分离纯化是酶学研究的基础大多数酶的本质是蛋白质故可用分离纯化蛋白质的方法纯化酶。但要选择合适的材料操作条件要温和且在制备过程中每一步都要测定酶的总活力和比活力以了解酶的回收率和提纯倍数。酶工程是将酶学原理与化学工程技术及基因重组技术有机结合而形成的新型应用技术是生物工程的重要组成部分并必将成为一个很大的生物技术产业。酶促反应动力学反应分子数与反应级数米氏方程米氏常数(Km)双倒数作图法酶的抑制类型温度、pH、激活剂对酶反应的影响反应分子数在反应中真正相互作用的分子数目。仅有个反应的分子参加的反应称为单分子反应有个反应物分子参加的反应称为双分子反应依此类推。即:AP属于单分子反应动力学方程(速率方程)为:υ=dcdt=kcABpQ属于双分子反应动力学方程为:υ=dcdt=kcc反应级数指整个化学反应的速率服从哪种分子的反应速率方程式则这个反应即为几级反应。若总反应的速率与浓度关系能以单分子反应的速率方程式表示即为一级反应若能以双分子反应的速率方程式表示则为二级反应依此类推把反应速率与反应物浓度无关的反应称为零级反应。知识点各级反应的特征一级反应:c=cekt半衰期t≈k二级反应:υ=dcdt=kcc半衰期t=ka(a为底物的初浓度)零级反应:υ=dcdt=k半衰期t=ak(a为底物的初浓度)酶促反应动力学:底物浓度与酶促反应速率的关系呈双曲线即当底物浓度较低时反应速率与底物浓度呈正比关系表现为一级反应当底物浓度逐渐增加时反应速率不再按正比关系升高反应表现为混合级反应当底物浓度达到足够高时反应速率与底物浓度几乎无关反应达到最大反应速率表现为零级反应。米氏方程年Michaelis和Menten在前人工作基础上根据酶反应的中间复合物学说即:E+SESE+P假定E+SES迅速建立平衡底物浓度远大于酶浓度下ES分解成产物的逆反应忽略不计推导出一个数学方程式来表示底物与酶反应速率之间的定量关系称为米氏方程表达式如下:υ=Vmax·[S](Km+[S])式中Km为米氏常数其物理意义是当酶反应速率达到最大反应速率一半时的底物浓度单位是molL与底物浓度的单位一样。米氏常数Km的意义如下:①Km是酶的一个特征常数其大小只与酶的性质有关而与酶的浓度无关②Km值随测定的底物、反应温度、pH及离子强度而改变即Km作为常数只是针对一定的底物、温度、pH和离子强度而言③Km值可以判断酶的专一性和天然底物:有的酶可作用于几种底物因此就有几个Km值其中Km值最小的底物称为该酶的最适底物或天然底物。Km值随不同底物而异的现象可以帮助判断酶的专一性④若已知某个酶的Km值可以计算出在某一底物浓度时的反应速率相当Vmax的比例⑤Km值可以帮助推断某一代谢反应的方向和途径:同一种底物往往可以被几种酶作用催化不同的反应走不同的途径究竟走哪一条途径决定于Km值最小的酶只有Km值小的酶反应比较占优势。利用作图法测定Km和Vmax值:Km值可用公式计算求得Km=(k+k)k当k远小于k时Km≈kk=Ks在此时Km相当于ES复合物的解离常数Ks!Vmax=k·Et(Et为总酶浓度)Km和Vmax可根据实验数据通过作图法直接求得:即将米氏方程进行变换使其成为直线方程然后用图解法求出Km与Vmax值。例如LineweaverBurk双倒数作图法:υ=KmVmax·[S]+Vmax横轴截距为Km纵轴截距为Vmax酶的抑制:酶主要是蛋白质使酶蛋白变性而导致酶活力丧失的作用称为失活作用若由于酶的必需基团化学性质的改变但酶并未变性而引起酶活力的降低或丧失称为抑制作用。引起抑制作用的物质称为抑制剂。抑制类型如下:抑制类型不可逆抑制:抑制剂与酶的必需基团以共价键结合不能用物理方法除去抑制剂。可逆抑制:以非共价键结合竞争性抑制:竞争酶的结合部位非竞争性抑制:同时和酶的不同部位结合反竞争性抑制:酶与底物结合后才可与抑制剂结合竞争性抑制Vmax不变Km增加可逆抑制动力学非竞争性抑制Vmax减小Km不变反竞争性抑制Vmax减小Km减小重要的抑制剂不可逆抑制剂非专一性:有机磷化合物:与酶活性部位SerOH共价结合强烈抑制胆碱酯酶活性敌敌畏、敌百虫有机汞、有机砷化合物:与酶分子中CysSH作用抑制含巯基的酶重金属:使酶蛋白变性失活用螯合剂可解除氰化物、硫化物、CO:与酶分子中金属离子形成络合物烷化剂:与酶的巯基、氨基、羧基、咪唑基等结合专一性:作用某一种酶Ks型:具底物类似结构可与相应酶结合并带有一个活泼的化学基团可对酶分子的必需基团进行修饰从而抑制酶的活性。亦称亲和标记试剂。Kcat型:具有底物类似结构本身也是酶的底物且存在潜伏的反应基团:当发生催化反应时潜伏基团暴露或活化作用酶活性部位的必需基团或辅基使酶不可逆失活。亦称自杀性底物。可逆抑制剂:最重要和最常见的是竞争性抑制剂。这类抑制剂与天然代谢物在结构上十分相似能选择性抑制病菌或癌细胞在代谢过程中的某些酶故称之为抗代谢物。如磺胺药对氨基苯磺酰胺它是对氨基苯甲酸的结构类似物而对氨基苯甲酸是叶酸结构的一部分细菌不能直接利用外源的叶酸只能在二氢叶酸合成酶的作用下利用对氨基苯甲酸为原料合成二氢叶酸继而合成四氢叶酸嘌呤核苷酸合成中重要的辅酶!因此可利用竞争性抑制的原理设计药物。此外过渡态底物类似物也可作为竞争性抑制剂:所谓过渡态底物是指底物和酶结合而形成的中间复合物被活化后的过渡形式。过渡态底物对酶的亲和力远大于底物因此可将抑制剂的化学结构设计成类似于过渡态底物从而一起酶的强烈抑制。目前报道的过渡态底物类似物都是竞争性抑制剂其抑制效率比基态底物类似物高的多。温度、pH、激活剂对酶活性的影响:存在酶反应的最适温度、最适pH凡能提高酶活性的物质都称为激活剂它对酶的作用具有一定的选择性即一种激活剂对某种酶起激活作用而对另一种酶可能起抑制作用。酶的作用机制和酶的调节酶的活性部位影响酶催化效率的因素酶活性的调控调节酶别构酶共价调节酶酶原激活可逆共价修饰同工酶知识点酶活性部位酶的催化能力只局限在酶分子的一定区域只有少数特异的氨基酸残基参与了底物结合与催化作用这些特异的氨基酸残基比较集中的区域即与酶活性直接相关的区域称为酶的活性部位或活性中心。活性部位结合部位:决定酶的专一性催化部位:决定酶的催化能力酶活性部位的共同特点:①酶活性部位在酶分子的总体积中只占相当小的部分通常只占整个酶分子体积的~②酶的活性部位是一个三维实体(空间概念):不是点、线、面的概念③酶的活性部位并不是和底物的形状正好互补而是在结合过程中二者发生一定的构象变化后才互补的:此动态的辨认过程称为诱导契合④酶的活性部位是位于酶分子表面的一个裂缝内底物分子或底物分子的一部分结合到裂缝内并发生催化作用⑤底物通过次级键结合到酶上:酶与底物形成ES复合物主要靠氢键、盐键、范德华力和疏水相互作用⑥酶活性部位具有柔性或可运动性:活性部位更易被破坏酶活性部位的研究方法:酶分子侧链基团的化学修饰法(巯基、氨基、羧基、羟基、咪唑基、胍基等)X射线晶体结构分析法定点诱变法(改变编码蛋白质基因中的DNA顺序来研究酶活性部位必需氨基酸的变化)等。补充:酶的催化作用是由氨基酸侧链上功能基团和辅因子为媒介的主要的有His、Ser、Cys、Lys、Glu、Asp的侧链常直接参加催化过程辅因子对于酶的催化具有协同作用对于多底物的酶促催化反应存在着个以上的底物结合部位在活性部位存在个以上的催化基团能进行协同催化与底物相比较酶分子很大而活性部位通常只比底物稍大一些故活性部位通常包围着底物。影响酶催化效率的因素底物和酶的邻近效应与定向效应:邻近效应指酶与底物结合成中间复合物后使底物与底物之间酶的催化基团与底物之间的有效浓度大大提高定向效应指底物的反应基团之间和酶的催化基团与底物的反应基团之间的正确取位产生的效应。底物形变和诱导契合:酶使底物分子中敏感键基团的电子云密度增高或降低产生电子张力使底物分子形变而接近其过渡态降低了反应活化能酸碱催化:酶通过瞬时的向底物提供质子或从底物接受质子以稳定过渡态底物而加速反应的催化机制。在生理条件下pH中性OHH很低不能起到酸碱催化作用此时主要依靠广义的酸碱催化来作用即酶蛋白分子中某些基团既是质子供体又是质子受体如氨基、羧基、巯基、酚羟基、咪唑基等。共价催化:酶蛋白中的亲核基团容易攻击底物的亲电中心形成酶底物共价结合的中间物从而降低反应活化能加速反应。酶蛋白中最常见的种亲核基团是:丝氨酸羟基、半胱氨酸巯基、组氨酸咪唑基底物中典型的亲电中心:磷酰基、酰基和糖基。金属离子催化:几乎的酶催化活性需要金属离子金属离子通过种主要途径参与催化过程:结合底物为反应定向可逆地改变金属离子的氧化态调节氧化还原反应静电稳定或屏蔽负电荷。多元协同催化:酶活性部位受微环境影响:非极性、低介电环境利于酶促反应。酶活性的调控酶活性的调控激素产物反馈抑制抑制剂、激活剂别构调节:可逆、非共价:别构酶共价修饰不可逆共价修饰:酶原激活可逆共价修饰:磷酸化与去磷酸化甲基化与去甲基化其它同工酶别构调节酶分子的非催化部位(别构部位)与某些化合物可逆地、非共价结合后使酶的构象发生改变进而改变酶活性(增加或降低)称之为酶的别构调节。具有这种调节作用的酶称为别构酶(变构酶)。使酶分子发生别构作用的物质称为效应物或别构剂它包括正效应物(别构激活剂)和负效应物(别构抑制剂)。别构调节普遍存在于生物界许多多谢途径的关键酶就是利用别构调节来控制代谢途径之间的平衡。别构调节现象不仅存在于别构酶还存在于其它的别构蛋白质如血红蛋白此外操纵子中的调节蛋白也是别构蛋白质。关于别构酶:①别构酶的酶促反应大多不符合MichaelisMenten动力学即不符合米氏方程其酶促反应曲线为S型(正协同)或双曲②效应物(别构剂)与调节亚基(调节部位)结合后导致酶构象的改变引起酶催化部位的活性增加或降低③具活性中心和别构中心且二中心处在酶蛋白的不同亚基或同一亚基的不同部位即调节部位不同于催化部位④许多别构酶常处于代谢途径的起始部位或受控部位代谢途径的终产物常作为别构酶的负效应物抑制这些酶⑤所有的别构酶均为寡聚酶⑥存在同促效应和异促效应:底物分子本身对别构酶的调节作用称同促效应非底物分子对别构酶的调节作用称异促效应补充:为了区分符合米氏方程的酶和正协同效应的别构酶及负协同效应的别构酶Koshland建议用协同指数(coop

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