凋亡的检测

nullnullDetection of ApoptosisApoptosis is an Essential ProcessApoptosis is an Essential ProcessThree types of cell death: necrosis, apoptosis and autophagy According to the characteristics of morphology, bio-chemistry, and molecular biology of cells, the apoptotic cells can be distinguished from the necrotic cells Apoptosis (programmed cell death) is a programmed or intentional form of cell death，and plays important roles in normal development and homeostasis Apoptosis is activated through two principal signaling pathways: intrinsic and extrinsic nullApoptosis is Carried out by Caspases Initiator caspasesPro-apoptotic stimulusEffector caspasesCaspase cascadeApoptosis is Carried out by Caspases Adapted from Thornberry NA, Lazebnik Y. Science 1998;281:1312–1316. Caspase, cysteine aspartase.The Intrinsic Apoptosis PathwayThe Intrinsic Apoptosis PathwayAdapted from Ashkenazi A. Nat Rev Cancer 2002;2:420–430. APAF1, apoptotic protease activating factor-1; BAK, BCL2 homologous antagonist/killer; BAX, BCL2-associated protein; BCL2, B-cell chronic lymphocytic leukemia/lymphoma 2; BCLXL, BCL2-like 1; IAP, inhibitor of apoptosis protein; MCL1, myeloid cell leukemia sequence 1 (BCL2-related); PUMA, p53-upregulated modulator of apoptosis; SMAC/DIABLO: second mitochondria-derived activator of caspase/direct IAP binding protein with low pI.Chemotherapy RadiotherapyCaspase 3, 6, 7Cell-intrinsic pathwayBCL2, BCLXL, MCL1MitochondriaSMAC/DIABLOp53Caspase 9DNA damagePUMA, NOXAAPAF1Cytochrome cDNA damageIAPThe Extrinsic Apoptosis PathwayThe Extrinsic Apoptosis PathwayAdapted from Ashkenazi A. Nat Rev Cancer 2002;2:420–430. FADD, Fas-associated death domain; FLIP, FLICE (FADD-like interleukin 1β-converting enzyme) inhibitory protein.Pro-apoptotic ligandCaspase 3, 6, 7ApoptosisFADDFLIPDR5DR4Cell-extrinsic pathwayProcaspase 8, 10Caspase 8, 10The Two Major Apoptosis PathwaysThe Two Major Apoptosis PathwaysAdapted from Ashkenazi A. Nat Rev Can 2002;2:420–430. APAF1, apoptotic protease activating factor-1; BAK, BCL2 homologous antagonist/killer; BAX, BCL2-associated protein; BCL2, B-cell chronic lymphocytic leukemia/lymphoma 2; BCLXL, BCL2-like 1; BID, BH3-interacting domain death agonist; DR, death receptor; FADD, Fas-associated death domain; FLIP, FLICE (FADD-like interleukin 1β-converting enzyme) inhibitory protein; IAP, inhibitor of apoptosis protein; MCL1, myeloid cell leukemia sequence 1 (BCL2-related); PUMA, p53-upregulated modulator of apoptosis; SMAC/DIABLO: second mitochondria-derived activator of caspase/direct IAP binding protein with low pI.Caspase 3, 6, 7ApoptosisPro-apoptotic ligandFADDDR5DR4Cell-extrinsic pathwayProcaspase 8, 10Caspase 9Caspase 8, 10p53BAX, BAKMitochondriaSMAC/DIABLOChemotherapy RadiotherapyDNA damagePUMA, NOXAAPAF1Cytochrome cDNA damageBIDIAPCell-intrinsic pathwayBCL2, BCLXL, MCL1Apoptosis via Pro-apoptotic Receptors (DR4 and DR5)Apoptosis via Pro-apoptotic Receptors (DR4 and DR5)Endogenous Apo2L/TRAILDR4DR5Apo2L/TRAIL, apoptosis-inducing ligand 2/tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand; DR, death receptor.Endogenous Apo2L/TRAIL Activates Pro-apoptotic Receptors (DR4 and DR5)Endogenous Apo2L/TRAIL Activates Pro-apoptotic Receptors (DR4 and DR5)DR4DR5DR, death receptor.Pro-apoptotic Receptors (DR4 and/or DR5) Recruit FADDPro-apoptotic Receptors (DR4 and/or DR5) Recruit FADDDR4DR5DR, death receptor; FADD, Fas-associated death domain.FADD Recruits Initiator Caspase 8 and/or 10 to the DISCDR4DR5FADD Recruits Initiator Caspase 8 and/or 10 to the DISCProcaspase 8, 10Procaspase 8, 10DISCDR, death receptor; DISC, death-inducing signaling complex.Activated Caspase 8 and 10 are Released Into the CytoplasmActivated Caspase 8 and 10 are Released Into the CytoplasmCaspase 8,10Caspase 8,10DR4DR5DR, death receptor.Caspase 3, 6, and 7 are ActivatedCaspase 3, 6, and 7 are ActivatedDR4DR5Caspase 3, 6, 7Caspase 3, 6, 7Caspase 8, 10Caspase 8, 10DR, death receptor.nullnull1．脑缺血神经细胞凋亡可以用caspases抑制剂防止。如新生儿窒息，老年脑缺血，老年痴呆症（如Alzheimers病）可用药物预防神经元凋亡。 2．过度凋亡所致疾病的防治：神经退行性变疾病，视网膜退行性病变，移植排斥，自身免疫性疾病等由于过度凋亡引起细胞缺失，可用caspases抑制剂预防。 3．肿瘤治疗：肿瘤细胞能够逃避凋亡，化疗和放疗可诱导肿瘤细胞凋亡。应了解某种肿瘤细胞启动的caspases酶系统和正常细胞死亡caspases酶系统的差异，以便选择激发肿瘤细胞的caspases系统。另外，肿瘤细胞可能是bcl-2表达过度，p53表达不足或突变使肿瘤细胞死亡减少，也可据此 设计 领导形象设计圆作业设计ao工艺污水处理厂设计附属工程施工组织设计清扫机器人结构设计 治疗策略。 4．心肌缺血，心肌梗死：在急性条件下，心肌纤维多为坏死，有些缓慢发展的心肌缺血可产生心肌细胞凋亡，通过了解凋亡的发生过程可以预防和治疗慢性心肌纤维死亡。凋亡和医学药学的关系Sequential apoptotic events and detection methodsSequential apoptotic events and detection methodsMitochondria potential loss Cyto-C/Apaf-1 complex formation Caspase activation PS translocation to outer cell membrane Morphology change DNA fragmentationFACS: DIOC6/JC-1 stain assay for Mitochondria φ WB/IF: cyto-c/AIF release FACS/WB: caspase activity FACS and IF: Annexin-V/PI stain assay DAPI, AO/EB, electron microscope DNA ladder and TUNEL assayBiological eventsDetection methodsnullDAPIABDCDAPInullDAPI 是一种DNA特异性染料，与DNA产生非嵌入式结合，发出蓝色荧光。该染料对细胞膜有半通透性，可透过正常活细胞产生较弱的蓝色荧光（细胞固定后荧光增强），而凋亡细胞的膜通透性增加，对其摄取能力增强，产生很强蓝光染色。并且正常细胞的核形态呈圆形，边缘清晰，染色均匀，而凋亡细胞的细胞核边缘不规则，细胞核染色体浓集，着色较重，并伴有细胞核固缩，核小体碎片增加，因此从荧光强度及核形态均可鉴别出细胞发生凋亡的典型特征。 贮存液：70%酒精溶解，浓度100 μg/ml，配好后用锡纸包起来，避光，可在4摄氏度下长期保存。 使用浓度：贮存液用1xPBS稀释1000倍，最终浓度100 ng/ml。注意事项： DAPI可能具有致癌性，全部操作过程中必须带塑料或乳胶手套。DAPInullHoechst 33258是一种无毒、水溶性双苯咪唑类化合物，可作为荧光探针与DNA分子结合。在凋亡细胞中，细胞膜对Hoechst 33258的摄取增高，并且由于染色体高度浓缩，Hoechst 33258与之结合增强，染色呈强蓝色荧光，而正常细胞只呈微弱荧光，死细胞则不被染色，由此可检测出凋亡。DAPInull优点：需要细胞量较少，操作简便，用时较短，形态学观察直观，反映单个细胞的凋亡状态 缺点：不能区别早期凋亡和晚期凋亡，主观性较强，仅能作为半定量方法，受试药物不能带荧光，否则干扰观察，DAPI有毒DAPInullAO/EBAO/EBnull吖啶橙(AO)能透过胞膜完整的细胞，嵌入细胞核DNA，使之发出明亮的绿色荧光。 溴乙锭(EB)仅能透过胞膜受损的细胞，嵌入核DNA，发橘红色荧光。 凋亡的细胞呈现为染色增强，荧光更为明亮，均匀一致的圆状或固缩状、团块状结构。非凋亡细胞核呈现荧光深浅不一的结构样特征。 三种细胞形态： 活细胞，核染色质着绿色并呈正常结构； 早期凋亡细胞，核染色质着黄绿色呈固缩状或圆珠状； 晚期凋亡细胞，核染色质为橘红色并呈固缩状或圆珠状AO/EBnull缺点：主观性较强，仅能作为半定量方法，受试药物不能带荧光，否则干扰观察，染料有毒AO/EB优点：需要细胞量较少，操作简便，用时较短，可以大致区别早期凋亡和晚期凋亡，反映单个细胞的凋亡状态nullElectron microscope Elec Micronull缺点：设备受限优点：观察凋亡细胞形态的最好方法, 细胞核和细胞器亚微结构清晰易辩, 可以同时反映细胞膜的完整性, 细胞浆中细胞器的改变, 细胞核及染色质的改变, 凋亡小体的形成等 Elec MicronullDNA ladderDNA ladderDNA ladderDNA ladderDNA laddernull缺点：需要细胞量多，操作相对麻烦，EB有毒，如果用苯氯仿抽提法的话，有一定毒性，对早期凋亡检测灵敏度不够，只能定性不能定量。优点：可同时显示晚期凋亡细胞基因组DNA 被切断转化为核小体DNA 片断的方法，反映群体细胞的凋亡状态 DNA laddernullTUNEL assay细胞凋亡中, 染色体DNA双链断裂或单链断裂而产生大量的粘性3'-OH末端，可在脱氧核糖核苷酸末端转移酶（TdT）的作用下，将脱氧核糖核苷酸和荧光素、过氧化物酶、碱性磷酸酶或生物素形成的衍生物标记到DNA的3'-末端，从而可进行凋亡细胞的检测，这类方法称为脱氧核糖核苷酸末端转移酶介导的缺口末端标记法（terminal -deoxynucleotidyl transferase mediated nick end labeling, TUNEL）。TUNEL assaynull正常细胞：几乎没有DNA的断裂，没有3‘-OH形成，很少能够被染色。 凋亡细胞：发生DNA断裂，TdT将标记的dUTP 将标记的dU TP 连接到DNA 片断的自由3′末端上, 在断裂处检测到荧光。 TUNEL实际上是分子生物学与形态学相结合的研究方法，对完整的单个凋亡细胞核或凋亡小体进行原位染色，能准确地反应细胞凋亡典型的生物化学和形态特征，可用于石蜡包埋组织切片、冰冻组织切片、培养的细胞和从组织中分离的细胞的细胞形态测定，并可检测出极少量的凋亡细胞。TUNEL assaynull缺点：试剂盒昂贵。优点：灵敏度很高，操作简便，孵育过程只需3h左右，反映单个细胞凋亡状态，可以检测到早期凋亡。 TUNEL assaynullPI staining PI　细胞凋亡时, 在流式细胞仪直方图G1 峰左侧出现较宽的亚二倍体细胞群的峰型, 较易与正常细胞较窄的二倍体峰分开, 方法简单。在P I 染色中, 通过计量P I 强度, 可计算出凋亡细胞数量, 另外通过测量细胞的DNA 含量, 可计算出凋亡细胞中DNA 的下降程度。但G1 峰左侧出现的亚二倍体峰只是代表G0G1期发生凋亡的细胞, S 期和S2 发生的细胞凋亡位于G1 峰后, 无法观察, 此外全部细胞均经固定, 因此不能区别活细胞和死细胞。nullPInull缺点：仪器设备受限，不能区别坏死和凋亡，不能检测早期凋亡。优点：可以定量。 需要固定细胞PIAnnexin V-PI Annexin V-PI 磷脂酰丝氨酸（Phosphatidylserine, PS）正常位于细胞膜的内侧，但在细胞凋亡的早期，PS可从细胞膜的内侧翻转到细胞膜的表面，暴露在细胞外环境中。Annexin-V是一种分子量为35~36KD的Ca2+依赖性磷脂结合蛋白，能与PS高亲和力特异性结合。将Annexin-V进行荧光素（FITC、PE）或biotin标记，以标记了的Annexin-V作为荧光探针，利用流式细胞仪或荧光显微镜可检测细胞凋亡的发生。 碘化丙啶(propidine iodide, PI)是一种核酸染料，它不能透过完整的细胞膜，但在凋亡中晚期的细胞和死细胞，PI能够透过细胞膜而使细胞核红染。因此将Annexin-V与PI匹配使用，就可以将凋亡早晚期的细胞以及死细胞区分开来。 null坏死晚凋早凋AV-PInull缺点：试剂盒昂贵，仪器设备受限。优点：灵敏度很高，操作简便，可以准确将早期凋亡，晚期凋亡和坏死分开，是很好的凋亡定量方法。 注意事项 　　1. 整个操作动作要尽量轻柔，勿用力吹打细胞。 　　2. 操作时注意避光，反应完毕后尽快在一小时内检测。 AV-PInullInitiator caspasesPro-apoptotic stimulusEffector caspasesCaspase cascadeCaspase activity detectionPARP cleavageCaspase activityCaspase activity detectionCaspase activity detectionCaspase activitynull也可以购买专门的试剂盒检测caspase的活性，但是价格非常昂贵Caspase activity缺点：费时费事，要做western blot。抗体费用。。优点：在蛋白水平反映细胞凋亡的情况。 null线粒体膜电位下降null 线粒体在细胞凋亡的过程中起着枢纽作用，多种细胞凋亡刺激因子均可诱导不同的细胞发生凋亡，而线粒体跨膜电位的下降，被认为是细胞凋亡级联反应过程中最早发生的事件，它发生在细胞核凋亡特征（染色质浓缩、DNA断裂）出现之前。 　　线粒体跨膜电位的存在，使一些亲脂性阳离子荧光染料如Rhodamine 123、3，3-Dihexyloxacarbocyanine iodide[DiOC6（3）]、Tetrechloro-tetraethyl-benzimidazol carbocyanine iodide[JC-1]、Tetramethyl rhodamine methyl ester(TMRM)等可结合到线粒体基质，其荧光的增强或减弱说明线粒体内膜电负性的增高或降低。 null将正常培养的细胞和诱导凋亡的细胞加入使用终浓度为Rhodamine 123（1mM）或终浓度为DiOC6（25nM），JC-1（1mM），TMRM（100nM），37°C平衡30min，流式细胞计检测细胞的荧光强度。 注意事项 　　1． 始终保持平衡染液中pH值的一致性，因为pH值的变化将影响膜电位。 2． 与染料达到平衡的细胞悬液中如果含有蛋白，他们将与部分染料结合，降低染料的浓度，引起假去极化。 null用到荧光显微镜用到流式细胞仪用到western blot用到DNA电泳能检测早凋能进行定量能反映单细胞情况能观察形态null • Autophagy is a process that describes the degradation and recycling of proteins and intracellular components in response to starvation or stress. nullNature Reviews Cancer 2005 5: 726-734nullnull