!""# $%%&’&()(*# $$’+,&% -. 中国生物化学与分子生物学报 /001: - - 234546 43576 8976 2:*/;:8<8 =>7?:@A >B C;>2/85;<0?D @:9 E>A827A@? C;>A>FD )%$$ 年 ( 月)&( () : SG, I SS+
K-!G78PGL<调节小鼠乳腺上皮细胞内 &/%G7 的表达
丁 巍， 李庆章J ， 王春梅， 李 晔， 崔 巍， 冯 丽
(东北农业大学乳品科学教育部重点实验室，哈尔滨 $S%%+%)
摘要 E;2?>O#P<( 5;O#P<)是一类大约 )) 个核苷酸的非编码 O#P6 它能通过调控生长因子表达，
引发肿瘤形成"细胞增殖和组织器官发育 6 本文通过构建 5;O’$)H’S1 靶基因序列的双荧光素酶报
告载体
分析
定性数据统计分析pdf销售业绩分析模板建筑结构震害分析销售进度分析表京东商城竞争战略分析
了 5;O’$)H’S1 与靶基因之间的关系，应用脂质体转染技术和实时荧光定量技术观察了5;O’$)H’S1 在小鼠乳腺上皮细胞中的表达量及其变化，通过 *P"f 细胞活力仪检测转染后的细胞
增殖与活力变化，采用 T8<08?: 印迹方法检 !FB’$ 的变化 6 结果表明: 5;O’$)H’S1 在小鼠乳腺青春期
表达最高，成功构建了 !FB’$ 基因 +LcQO 荧光素酶报告载体，5;O’$)H’S1 抑制其荧光素酶活性 ( Fw %a %$) ，转染抑制子后 5;O’$)H’S1 表达降低( F w %a %$) ，胰岛素样生长因子 ( !FB’$) 表达增强( Fw %a %S) ，细胞增殖和活力增强 ( F w %a %$) ，结果提示: 5;O’$)H’S1 可能通过抑制靶基因蛋白 !FB’$
的表达，进而抑制小鼠乳腺上皮细胞增殖和活力 6
关键词 5;O’$)H’S1; 荧光素酶报告载体 ; 胰岛素样生长因子( !FB’$% ; 乳腺上皮细胞
中图分类号 .&S)K-!G78PGL< J*,/$+( %", &/DG7 >-#$’2-’/ -’ C")($ C*KK*,4 V<-+F$#-*# @$##(M!#U T8;，‘! .;:F’V/@:FJ ，TP#U */7:’E8;，‘! f8，*c! T8;，R\#U ‘;
( )*" +,-./,0./" .& @,6/" 456*25*$，N626$0/" .& K7:5,06.2，J./0<*,$0 =!/65:A0:/,A >26?*/$60"，(,/-62 $S%%+%，;<62,)01(+,*2+ E;2?>O#P<( 5;O#P<) ;< @ F?>71 >B :>:’2>9;:F <5@AA O#P< @4>70 )) :72A8>0;98<，Z/;2/ 2@:;:9728 075>? F8:8?@0;>:， 28AA 1?>A;B8?@0;>: @:9 @AA8A>0@XD 0/?>7F/ 0/8 ?8F7A@0;>: >B <>58 ?82810>?8X1?8<<;>:6 !: 0/;< <079D， 0/8 !FB’$ +L cQO A72;B8?@<8 ?81>?08? [820>? Z@< 2>:<0?720896 Q/8 M7@A’‘72;B8?@<8 O81>?08? P<<@D "D<085 Z@< 7<89 0> d7@:0;0@08 0/8 ?81>?08? @20;[;0D6 ‘;1><>58 0?@:
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收稿日期: )%$%’$$’$$ ; 接受日期: )%$$’%+’$,
国家自然科学基金项目( #>6 +$%&)$%+)J 联系人 Q8A: %GS$’SS$H%HHH ; \’5@;A: d;:FK/@:FA;] />05@;A6 2>5O828;[89: #>[8548? $$，)%$% ; P2281089: E@?2/ $,，)%$$"711>?089 4D #@0;>:@A #@07?@A "2;8:28 R>7:9@0;>: >B */;:@ ( #>6+$%&)$%+)J *>??8<1>:9;:F @70/>? Q8A: %GS$’SS$H%HHH ;\’5@;A: d;:FK/@:FA;] />05@;A6 2>5
微小 O#P ( 5;2?>O#P，5;O#P) 是长度约为 )%I )S :0"SL端带磷酸基团和 +L端带羟基的非蛋白编
码的小 O#P 家族［$］，广泛地存在于哺乳动物和人类
细胞中 6在动物中，多数 5;O#P 以不完全互补的方
式与其靶 5O#P 的 +L端非编码区识别位点结合，从
而阻碍该 5O#P 翻译调控基因表达，但不影响5O#P 的稳定性［)］6 5;O#P 通过调控基因表达，参
与生命过程的一系列重要进程，包括早期发育［+］"
第 ( 期 丁 巍等: 5;O’$)H’S1 调节小鼠乳腺上皮细胞内 !FB’$ 的表达
细胞增殖［G］"细胞死亡［S］"脂肪代谢和细胞分化［(］6
本实验室王春梅等［&］应用 5;O#P 微阵列检测技术
预测显示，5;O’$)H’S1 在小鼠乳腺生长发育的不同
时期存在明显差异表达，可能参与乳腺的生长发育 6
利用 Q@?F80"2@: 方法预测分析得知，小鼠胰岛素样
生长因子( ;:<7A;:’A;Y8 F?>Z0/ B@20>?’$，!FB’$ ) +L cQO
序列( 基因号: #E s%%$$$$)&Sa $ ) 处存在和 5;O’$)H’S1 的结合位点 6SL6 6 6 PPPUUPUPPPU*PPPU*PPPPP*6 6 6z z z z z z z+L *Ucc*UUUc*cUU*Uccccc*
本实验旨在进一步证明 5;O’$)H’S1 在小鼠乳
腺发育过程中的表达及其作用机制 67 材料与方法7: 7 材料CP‘C -* 小鼠购于哈尔滨肿瘤医院，细胞角蛋
白 $, 抗体 ( P2?;< )"脂质体试剂 <;_bOQ #8>RW
( P54;>:)"b10;’E\E ! 589;75 ( U;42>)"!FB’$ 多克
隆抗体 ( "@:0@*?7K8 )"UP_MN 多克隆抗体 ( "@:0@*?7K8)"R!Q* 二抗( ";F5@)"辣根过氧化物标记试剂
盒( ";F5@ )"\*‘ 超敏发光液 ( 普 利莱 )"1E!O’O\_bOQQE ‘72;B8?@<8 载体"海肾荧光素酶表达载
体( 本 实 验 室 保 存 )"双荧光素酶检测试剂盒
( _?>58F@ ) ， W’0?858U\#\ ( O>2/8 )" 1EM$,’Qe820>?"(629 %"4#* !"\A820?>’*8AA< =E$%H"QG M#P
连接酶"E,L 酶"_*O 试剂盒( 宝生物) ，荧光定量_*O 试 剂 盒"5;O’$)H’S1 ;:/;4;0>?"5;O’$)H’S15;5;2"#8F@0;[8 *>:0?>A( 上海吉玛) 67: 8 小鼠乳腺上皮细胞培养与鉴定
取妊娠中期雌鼠两侧第 G 对乳腺组织进行细胞
培养，用 ! 型胶原酶与胰蛋白酶+& u消化，所得细
胞沉淀接种于培养瓶中，置于+& u，*b)培养箱中培
养 6用细胞角蛋白 $, 免疫荧光染色，在激光共聚焦
显微镜下观察细胞角蛋白 $, 的特异性表达［,］67: 9 荧光素酶报告载体的构建
从 5;OC@<8 Q@?F80< 数据库中查找得到可能与5;O’$)H’S1 作用的 !FB’$ 的 5O#P，并找出其 +Lc QO
序列( 基因号: #E s%%$$$$)&Sa $ ) ，采用 _?;58? Sa% 软件
设计
领导形象设计圆作业设计ao工艺污水处理厂设计附属工程施工组织设计清扫机器人结构设计
合成 _*O 引物，上"下游引物分别引入
限制性内切酶 (629 %和 4#*"识别位点 6 小鼠乳腺
组织提取总 O#P 进行逆转录以其 2M#P 为
模板
个人简介word模板免费下载关于员工迟到处罚通告模板康奈尔office模板下载康奈尔 笔记本 模板 下载软件方案模板免费下载
进
行 _*O 扩增，总体系为 )S 0‘6扩增条件: HG u预变
性 S 5;: 后进入扩增循环，循环条件为: HG u $
5;:"S+ u +% <"&) u $ 5;:，共 +S 个循环 6 _*O 产
物用 $k琼脂糖凝胶电泳验证 6 将切胶纯化回收后
的 _*O 产物与 Q 载体连接，连接反应产物转化 )S0‘ 感受态大肠杆菌 =E $%H，将用 (629 %和 4#*"
双酶切正确的重组子，用 $k琼脂糖凝胶电泳验证 6
将双酶切产物及 1E!O’O\_bOQ 载体双酶切产物纯
化并连接得到重组载体 6 连接反应体系: Q 载体双
酶切产物与 1E!O’O\_bOQ 双酶切产物比例为 +v $，) h连接反应缓冲液 S 0‘，QG M#P 连接酶 $ 0‘，用
双蒸水补至 $% 0‘，G u过夜 6 取 G 0‘ 连接反应产
物转化 )S 0‘ 感受态大肠杆菌 =E $%H，将正确的重
组子送测序鉴定，测序鉴定正确的重组子命名为!FB’$’1E!O’O\_bOQ67: ? 细胞瞬时转染及荧光素酶活性测定
用 O>2/8 公司的 W’0?858U\#\ 转染试剂转染，
方法参考说明书 6 转染前 $ 9 将小鼠乳腺上皮细胞
接种于 )G 孔细胞培养板中，每个培养皿接种细胞数
为 $a % h $%S 个，用 S%% 0‘ 含 $%k胎牛血清的培养
液培养 6转染当天，细胞更换新鲜培养液 6 用 )S 0‘
不含血清的培养液稀释质粒 M#P，每个孔转染 $%%:F 的 !FB’$’1E!O’O\_bOQ"海肾荧光素酶表达载体，G%% :F 的 5;O’$)H’S1 5;5;2，以 5;O’$)H’S1 1?8’5;5;2 #8F@0;[8 *>:0?>A 作为对照 6 向稀释好的 M#P
中加入 ) 0‘ 脂质体，混匀后室温下孵育 $S 5;:，形
成转染复合物 6将上述转染复合物加入细胞培养板
各孔中 6转染 G, / 后裂解细胞，检测荧光素酶活性 6
上述实验每组设 + 个平行，以转染 #8F@0;[8 *>:0?>A
的细胞作为阴性对照，每组实验重复 + 次 6 根据_?>58F@ 公司的双荧光素酶检测试剂盒提供的方法
检测荧光素酶活性 6将待测细胞用 _C" 洗涤后再用$%% 0‘ 的被冻裂解液将细胞裂解 $S 5;:，裂解物用_?>58F@ 公司的 UA>5@X)% -)% A75;:>’5808? 荧光检测
仪检测 6 向测量管中加入 $%% 0‘ 的 ‘PO!! 和 )% 0A
的细胞裂解液，测量荧光 $，再加入 $%% 0‘ 的 "0>1o UA> 试剂，测量荧光 )a 以荧光 $ -荧光 ) 的值作为
相对荧光素酶活性 67: L 实时荧光定量技术鉴定小鼠各时期乳腺组织
中 K-!G78PGL< 的含量
提取小鼠 G 个生长时期乳腺组织中的 O#P，取+%% :F 总 O#P，5;O’$)H’S1 OQ 引物逆转录合成5;O’$)H’S1 2M#P 第 $ 链，以 5;O’$)H’S1 实时定量_*O 引物和第 $ 链 2M#P 为模板应用 PC!&S%% _*O
仪进行 _*O 反应，反应条件: HS u + 5;: 变性，HS u $% <"(% u +% <，G% 个循环 6 以 S < 为内参，进
HGS
毛 毛
毛 毛
毛 毛
毛 毛
毛 毛
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毛 毛
毛 毛
毛 毛
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毛 毛
中国生物化学与分子生物学报 第 )& 卷
行数据分析 67: M 小鼠乳腺上皮细胞的转染及实时荧光定量技
术鉴定转染后 K-!G78PGL< 表达变化
收集对数生长期的细胞，用正常培养基调整浓
度为 $a % h $%S -5‘ 细胞，+& u孵育; 采用 <;_bOQ#8>RW 脂质体转染试剂进行转染，方法参考说明书
进行 6 分别转染 5;O’$)H’S1 ;:/;4;0>? 及其 #8F@0;[8*>:0?>A6用 b10;’E\E ! 589;75 稀释 <;_bOQ #8>RW
脂质体转染试剂( + 0‘ g G& 0‘) ，轻轻混匀，室温
孵育 $% 5;: ; 用 b10;’E\E ! 589;75 稀释 5;O’$)H’S1 ;:/;4;0>? 和 5;5;2 ( %a &S 0‘ g GHa )S 0‘) ; 将上
面两个复合物混合，轻轻吹打，室温孵育 $% 5;: ; 放
入 )G 孔培养板中 6 将准备的细胞( GS% 0‘) 加入培
养板中，水平振荡培养板，+& u培养，)G / 后更换
正常培养基 6转染 G, / 后提取 O#P 进行 dOQ’_*O，
取 +%% :F 总 O#P 按照说明书进行，5;O$)H’S1 OQ
引物逆转录合成 5;O’$)H’S1 2M#P 第 $ 链，以5;O$)H’S1 实时定量 _*O 引物和第 $ 链 2M#P 为模
板应用 PC!&S%% _*O 仪进行 _*O 反应，反应条件:HS u + 5;: 变性，HS u $% <"(% u +% <，G% 个循环 6
以 S < 为内参，进行数据分析 67: N ]$(+$,’ 印迹检测转染后相关蛋白质的表达
变化!FB’$ 的 含 量 样 品 分 为 + 组: 5;O’$)H’S1;:/;4;0>? 转染组"阴性对照组"空白对照组 6 转染后
培养 G, /，分别收集以上各组小鼠乳腺上皮细胞 6用
细胞裂解液提取细胞总蛋白，收集置于 p )% u冻
存 备 用［,］6 进 行 T8<08?: 印 迹 检 测，结 果 用C@:9"2@:Ga + 软件分析，同一样本不同处理的结果
用 "_"" 统计分析软件进行 0 检验，多组数据之间应
用 "_"" 统计分析软件进行方差分析 67: Q K-!G78PGL< -’F-1-+", 转染后对小鼠乳腺上皮
细胞生长趋势及活性的影响
收集对数生长期的细胞，调整浓度为 $a % h$%S -5‘，将细胞接种于 )G 孔培养板中，分别加入 S%05>A -‘ 浓度的 5;O’$)H’S1 ;:/;4;0>? 以及 #8F@0;[8*>:0?>A，同等条件下培养，G, / 收集各组细胞，*P"f
细胞分析仪检测细胞数和活性 68 结果8: 7 鼠乳腺上皮细胞的鉴定
乳腺上皮细胞爬片染色完成后，置于激光扫描
共聚焦显微镜下观察细胞角蛋白 $, 的特异性表达
( R;F6 $) 6
D-/E 7 !$()#+( "% K")($ K*KK*,4 $<-+F$#-*# 2$##( 14-KK)’$%#)",$($’2$ (+*-’-’/ ( ?OO Z ) E@55@?D81;0/8A;@A 28AA< B?>5 $+’9@D 1?8F:@:0 5>7<8 Z8?8 27A07?89 ;:MR$) 589;75 B>? )G />7?<， @:9 B;X89 @:9 <0@;:89 Z;0/R!Q*’_O‘’O6 Q/8 :72A8; Z8?8 <0@;:89 Z;0/ MP_!6 Q/8BA7>?8<28:0 5;2?><2>1;2 ;5@F8< Z8?8 @2d7;?89 7<;:F ‘8;2@"_S 2>:B>2@A :0?>A，根据_?>58F@ 公司的双荧光素酶检测试剂盒提供的方法
检测荧光素酶活性 6 测定 !FB’$’1E!O’O\_bOQ( =$ )
和海肾荧光素酶表达载体( =)) 的活性，计算 =$ -=)
比值表示相对荧光素酶活性 6结果显示: 实验组较对
照组相对荧光素酶活性明显降低 ( R;F6 )，F w%a %$) 68: ? 实时荧光定量技术鉴定小鼠各时期乳腺组织
中 K-!G78PGL< 的含量
摘取小鼠 G 个成长时期青春期"妊娠期"泌乳
期"退化期的乳腺组织，提取总 O#P，应用 dOQ’_*O
方法检测小鼠乳腺组织中 5;O’$)H’S1 的表达量，可
见内源性 5;O’$)H’S1 在小鼠乳腺组织中的各时期
均有 表 达，在 青 春 期 的 表 达 量 最 高 ( R;F6 +，F w %a %$) 6
%SS
第 ( 期 丁 巍等: 5;O’$)H’S1 调节小鼠乳腺上皮细胞内 !FB’$ 的表达
D-/E 8 V%%$2+ "% K-!G78PGL< "’ ,$#*+-I$ #)2-%$,*($*2+-I-+4 "% &/%G7GB0Z@?86 Q/8 9@0@ @?8 >40@;:89 B?>5 +8X18?;58:0<6 e@A78< @?8 58@:< i "M6 ";F:;B;2@:0AD9;BB8?8:28 480Z88: P @:9 C，F w %a %$a $ : \X18?;58:0@AF?>71; ) : #8F@0;[8 2>:0?>A F?>71
D-/E 9 !$#*+-I$ $S<,$((-"’ "% K-!G78PGL< -’ K")($K*KK*,4 +-(()$ "% $*2F <$,-"6 Q/8 9@0@ Z8?8@:@ADK89 Z;0/ "_"" <>B0Z@?86 Q/8 9@0@ @?8 >40@;:89 B?>5 +<81@?@08 8X18?;58:0<6 Q/8D Z8?8 98082089 4D ?8@A’0;58_*O6 Q/8 9@0@ Z8?8 Z89 0/@0 5;O’$)H’S1 ;: 5>7<85@55@?D 0;<<78 /@9 9;BB8?8:0;@A 8X1?8<<;>:，5;O’$)H’S1/@9 /;F/8<0 8X1?8<<;>: ;: [;?F;:6 e@A78< @?8 58@:< i "M6Q/8?8 Z8?8 <;F:;B;2@:0AD 9;BB8?8:28< @5>:F @，4，2 @:9 96F w %a %$a $ : e;?F;:; ) : _?8F:@:2D; + : ‘@20@0;>:; G :!:[>A70;>:8: L 实时荧光定量技术鉴定 K-!G78PGL< -’F-1-+",
转染后的 K-!G78PGL< 的表达变化
分别以 5;O’$)H’S1 ;:/;4;0>? 及阴性对照转染小
鼠乳腺上皮细胞，G, / 后收获细胞，_C" 清洗后，Q?;K>A 法提取总 O#P，应用实时荧光定量技术检测
转染后 5;O’$)H’S1 表达量 6 结果显示，转染 ;:/;4;0>?
实验组内源性 5;O’$)H’S1 在小鼠乳腺上皮细胞中
表达量低于对照组，说明 5;O’$)H’S1 ;:/;4;0>? 可有
效抑制小鼠乳腺上皮细胞内源 5;O’$)H’S1 表达(R;F6 G，F w %a %$) 68: M ]$(+$,’ 印迹测转染后 &/%G7 的表达变化
转染 5;O’$)H’S1 ;:/;4;0>? 和 #8F@0;[8 *>:0?>A 的
小鼠乳腺上皮细胞培养 G, / 后，提取总蛋白，
D-/E ? VS<,$((-"’ "% K-!G78PGL< -’ K")($ K*KK*,4$<-+F$#-*# 2$##( *%+$, K-!G78PGL< -’F-1-+", $’6"/$’")(Q/8 9@0@ Z8?8 @:@ADK89 Z;0/ "_"" <>B0Z@?86 Q/8 9@0@ @?8>40@;:89 B?>5 + <81@?@08 8X18?;58:0<6 e@A78< @?8 58@:< i<6 E>7<8 5@55@?D 81;0/8A;@A 28AA< Z8?8 0?@::0?>A @:9 5;O’$)H’S1 ;:/;4;0>?6 PB08?0?@:: B>? G, />7?<， ;0 Z@< 98082089 4D ?8@A’0;58_*O6 ";F:;B;2@:0AD 9;BB8?8:28 480Z88: P @:9 C，F w %a %$a$ : #8F@0;[8 2>:0?>A F?>71; ) : 5;O’$)H’S1 ;:/;4;0>? F?>71
( S% 05>A -‘)
T8<08?: 印迹鉴定 !FB’$ 的表达，可见 ;:/;4;0>? 作用
的小鼠乳腺上皮细胞中 !FB’$ 蛋白表达高于阴性对
照处理的小鼠乳腺上皮细胞，说明 5;O’$)H’S1 可抑
制小鼠乳腺上皮细胞中 !FB’$ 的表达( R;F6 S) 68: N K-!G78PGL< -’F-1-+", 转染后小鼠乳腺上皮细
胞的生长趋势及活性分析
分别转染 5;O’$)H’S1 ;:/;4;0>? 及其 #8F@0;[8*>:0?>A，转染 G, / 后，*P"f 细胞分析仪检测细胞
数及其活性 6 结果可见，5;O’$)H’S1 抑制组小鼠乳
腺上皮细胞数高于对照组 ( _ w %a %$ ) ，并且 S%05>A -‘ 浓度转染的细胞数最多，说明 5;O’$)H’S1
抑制后小鼠乳腺上皮细胞增殖能力高于对照组，即5;O’$)H’S1 有降低小鼠乳腺上皮细胞增殖能力 (R;F6 (，Q@4A8 $) 69 讨论5;O#P 是一种广泛存在的对基因表达进行微
调的分子，主要通过抑制靶基因来起调控作用［H］，
从 5;O#P 水平研究其对乳腺发育与泌乳的影响还
处于开始阶段，目前对于 5;O’$)H’S1 的研究也很
少 6 5;O#P 与目标基因转录的 5O#P 的 +L cQO 区
特定序列结合，形成 5;O#P’O#P 复合体［$%］6 目前，
对于多数 5;O#P 而言，它们调节目标基因的精确作
用方式还不清楚 6 乳腺发育经历胚胎期"青春期"妊
娠期"泌乳期"退化期等多个时期，而且是雌性动物
出生后唯一可以多次重复发育的器官 6 大量的激素
与细胞因子的共同参与完成乳腺的生长发育［$$］6
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中国生物化学与分子生物学报 第 )& 卷
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!FB’$ 是一种结构类似胰岛素的多肽类细胞生长因
子，是具有细胞分化和增殖作用单链蛋白 6 !FB’$ 能
促进成纤维细胞"成骨细胞"平滑肌细胞"乳腺上皮
细胞"胰岛 ! 细胞等多种细胞增殖［ $)，$+］6 5;O#P 与
其靶基因的 5O#P 的 +L cQO 互补结合阻止了5O#P 的翻译，抑制蛋白的表达，最终表现为阻止细
胞增殖的作用［$G］6
本 研 究 应 用 生 物 信 息 学 方 法，结 合5;OC@<8Q@?F80 数据库分析，以小鼠乳腺组织总 O#P
为模板，根据 !FB’$ 5O#P 的 +LcQO 序列设计引物，
构建荧光素酶表达载体，通过脂质体转染技术研究5;O’$)H’S1 在细胞中的表达和 !FB’$ 的变化 6 研究
结果证明，5;O’$)H’S1 ( SL’PPPUUPUPPPU*PPPU*PPPPP*’+L) 与预测靶基因 !FB’$ 5O#P 的 +LcQO
序列 ( SL’UQUPU*PPU*PUU*PPPUPU +L) 结 合，5;O’$)H’S1 沉寂后，使 !FB’$ 表达量显著升高，细胞
增殖加快，细胞活力增强 6 实验结果提示，!FB’$ 表达
可能受到 5;O’$)H’S1 的抑制，5;O’$)H’S1 可能通过
调控 !FB’$5O#P 的翻译影响乳腺细胞的增殖和分
泌，与实验预期相符 6 研究证实，5;O’$)H’S1 对乳腺
上皮细胞的增殖和分泌的作用可能通过调控 !FB’$
信号转导分子而实现 6在小鼠乳腺发育"泌乳及退化
过程中，5;O’$)H’S1 调控的靶基因为 !FB’$，进而通
过表达产物与受体的结合调节乳腺发育与泌乳，其
调节机理有待进一步研究 6
参考文献( !$%$,$’2$()
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