PCR设计引物时酶切位点的保护碱基

PCR 设计引物时酶切位点的保护 酶 寡核苷酸序列 切割率% 2 hr 20 hr Acc I GGTCGACC CGGTCGACCG CCGGTCGACCGG 0 0 0 0 0 0 Afl III CACATGTG CCACATGTGG CCCACATGTGGG 0 >90 >90 0 >90 >90 Asc I GGCGCGCC AGGCGCGCCT TTGGCGCGCCAA >90 >90 >90 >90 >90 >90 Ava I CCCCGGGG CCCCCGGGGG TCCCCCGGGGGA 50 >90 >90 >90 >90 >90 BamH I CGGATCCG CGGGATCCCG CGCGGATCCGCG 10 >90 >90 25 >90 >90 Bgl II CAGATCTG GAAGATCTTC GGAAGATCTTCC 0 75 25 0 >90 >90 BssH II GGCGCGCC AGGCGCGCCT TTGGCGCGCCAA 0 0 50 0 0 >90 BstE II GGGT(A/T)ACCC 0 10 BstX I AACTGCAGAACCAATGCATTGG AAAACTGCAGCCAATGCATTGGAA CTGCAGAACCAATGCATTGGATGCAT 0 25 25 0 50 >90 Cla I CATCGATG GATCGATC CCATCGATGG CCCATCGATGGG 0 0 >90 50 0 0 >90 50 EcoR I GGAATTCC CGGAATTCCG CCGGAATTCCGG >90 >90 >90 >90 >90 >90 Hae III GGGGCCCC AGCGGCCGCT TTGCGGCCGCAA >90 >90 >90 >90 >90 >90 Hind III CAAGCTTG CCAAGCTTGG CCCAAGCTTGGG 0 0 10 0 0 75 Kpn I GGGTACCC GGGGTACCCC CGGGGTACCCCG 0 >90 >90 0 >90 >90 Mlu I GACGCGTC CGACGCGTCG 0 25 0 50 Nco I CCCATGGG CATGCCATGGCATG 0 50 0 75 Nde I CCATATGG CCCATATGGG CGCCATATGGCG GGGTTTCATATGAAACCC GGAATTCCATATGGAATTCC GGGAATTCCATATGGAATTCCC 0 0 0 0 75 75 0 0 0 0 >90 >90 Nhe I GGCTAGCC CGGCTAGCCG CTAGCTAGCTAG 0 10 10 0 25 50 Not I TTGCGGCCGCAA ATTTGCGGCCGCTTTA AAATATGCGGCCGCTATAAA ATAAGAATGCGGCCGCTAAACTAT AAGGAAAAAAGCGGCCGCAAAAGGAAAA 0 10 10 25 25 0 10 10 90 >90 Nsi I TGCATGCATGCA CCAATGCATTGGTTCTGCAGTT 10 >90 >90 >90 Pac I TTAATTAA GTTAATTAAC CCTTAATTAAGG 0 0 0 0 25 >90 Pme I GTTTAAAC GGTTTAAACC GGGTTTAAACCC AGCTTTGTTTAAACGGCGCGCCGG 0 0 0 75 0 25 50 >90 Pst I GCTGCAGC TGCACTGCAGTGCA AACTGCAGAACCAATGCATTGG AAAACTGCAGCCAATGCATTGGAA CTGCAGAACCAATGCATTGGATGCAT 0 10 >90 >90 0 0 10 >90 >90 0 Pvu I CCGATCGG ATCGATCGAT TCGCGATCGCGA 0 10 0 0 25 10 Sac I CGAGCTCG 10 10 Sac II GCCGCGGC TCCCCGCGGGGA 0 50 0 >90 Sal I GTCGACGTCAAAAGGCCATAGCGGCCGC GCGTCGACGTCTTGGCCATAGCGGCCGCGG ACGCGTCGACGTCGGCCATAGCGGCCGCG GAA 0 10 10 0 50 75 Sca I GAGTACTC AAAAGTACTTTT 10 75 25 75 Sma I CCCGGG CCCCGGGG CCCCCGGGGG TCCCCCGGGGGA 0 0 10 >90 10 10 50 >90 Spe I GACTAGTC GGACTAGTCC CGGACTAGTCCG CTAGACTAGTCTAG 10 10 0 0 >90 >90 50 50 Sph I GGCATGCC CATGCATGCATG ACATGCATGCATGT 0 0 10 0 25 50 Stu I AAGGCCTT GAAGGCCTTC AAAAGGCCTTTT >90 >90 >90 >90 >90 >90 Xba I CTCTAGAG GCTCTAGAGC TGCTCTAGAGCA CTAGTCTAGACTAG 0 >90 75 75 0 >90 >90 >90 Xho I CCTCGAGG CCCTCGAGGG CCGCTCGAGCGG 0 10 10 0 25 75 Xma I CCCCGGGG CCCCCGGGGG CCCCCCGGGGGG TCCCCCCGGGGGGA 0 25 50 >90 0 75 >90 >90 注释： 1．如果要加在序列的 5‘端，就在酶切位点识别碱基序列（红色）的 5’端加上相应的碱基（黑色），相同如果要在 3‘端加保护碱 基，就在酶切位点识别碱基序列（红色）的 3’端加上相应的碱基（黑色）。 2．切割率：正确识别并酶切的效率 3.加保护碱基时最好选用切割率高时加的相应碱基。 一般情况下，普通的内切酶只加入两个保护碱基，其内切反应就可以正常进行；而有一类，仅仅只加入两个保护碱基，其内切反 应就不能正常进行，这是因为内切酶不能正常结合 DNA 段上。如 NdeI就属这类，需要加入至少 6个保护碱基，常用的 HindIII也要三 个。添加什么保护碱基，如果严格点，是根据两条引物的 Tm值和各引物的碱基分布及 GC含量。如果某条引物 Tm值偏小，GC%较低， 添加时多加 G或 C，反之亦反。 当在引物 5’端添加酶切位点时要考虑： a)该目的序列内部不得含有相同的酶切位点，这样的错误会给将来的克隆造成麻烦。 b)如果打算 PCR 后直接酶切，不要忘了在酶切位点的外侧再加上保护碱基，不同的酶对于保护碱基的要求是不同的。如果不设计保护 碱基，则多半要用 TA 克隆的方式连接到质粒上，这时要注意 Taq 酶的选择，若想在目的序列上附加上并不存在的序列，如限制位点 和启动子序列，可以加入到引物 5'端而不影响特异性。当计算引物 Tm 值时并不包括这些序列，但是应该对其进行互补性和内部二级 结构的检测。