利用双色荧光观察分析重组家蚕杆状病毒对昆虫细胞及蚕体组织的感染

634 蚕 业 科 学 CANYE KEXUE 2009；35(3) 利用双色荧光观察分析重组家蚕杆状病毒 对昆虫细胞及蚕体组织的感染 王文兵 马双双 李 兵 叶思思 高 静 沈卫德 ( 江苏大学生命科学研究院，江苏镇江 212013； 苏州大学生命科学学院，江苏苏州 215123； 江苏大学药学院，江苏镇江 212013) 摘 要 尝试将红色荧光蛋白(RFP)作为昆虫表达体 系的分子标签，克隆了 基因的读码框，通过 Bac—to—Bac杆 状病毒表达系统，将该基因插入家蚕核型多角体病毒(BmNPV)中，获得重组杆状病毒BmNPV一 。对家蚕细胞的 感染表明， 适于在昆虫细胞中表达，在显微镜下红色荧光很明显，说明 RFP可以作为杆状病毒表达的分子标签。 BmNPV一却 和另一种插入绿色荧光蛋白基因 的家蚕重组杆状病毒 BmNPV—gfp混合感染家蚕细胞和幼虫的实验 表明，二者的荧光很少在同一细胞中发生重叠，说明昆虫细胞大多只感受 1次同一来源的病毒。BmNPV—rfp、BmN— PV—gfp与AcNPV混合感染Sf21细胞的结果也证明了该推断，并且还显示AcNPV可以协助 BmNPV来源的病毒基 因在 Sf2l细胞中表达以及协助病毒增殖或产生杂交病毒，但尚未明确其机制。 关键词 红色荧光蛋白；绿色荧光蛋白；家蚕核型多角体病毒；苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒；细胞感染；组织感染 中图分类号 $884．5；$881．2 文献标识码 A 文章编号 0257—4799(2009)03—0634—04 Infection Analysis of Recombinant Bombyx mori Nucleop0lyhedr0Virus to Insect Cells and Bombyx mori Tissues by Observation of Red and Green Fluorescence WANG Wen～Bing MA Shuang—Shuang’ LI Bing YE Si—Si。 GAO Jing。 SHEN Wei—De ( Institute of Life Science，Jiangsu University，Zhenjiang Jiangsu 2 1 201 3，China； School of Life Sciences，Soochow University，Suzhou J~ngsu215123，China； 。School of Pharmacy ，Jiangsu University，Zhenjiang J~ngsu 212013，China) Abstract In order lO know whether the red fluorescent protein(RFP)could be used as a molecular marker in bac— ulovirus expression system ，the open reading frame of rfp gene was cloned and inserted into Bombyx mori nucle— opolyhedrovirus(BmNPV)genome The recombinant virus BmNPV—rfp was obtained．The results of infection in BmN cells demonstrated that the rfp gene was highly expressed and was suitable for application as a fusing marker When the mixed viruses of BmNPV—rfp and BmNPV—gfP infected BmN cells and Bombyx mori larvae ． separated fluorescenl light(red or green)was obse~ed in the infected cells，meaning that most insect cells are only sensitive by one time to the vi rions that derived fr0m lhe same type of baculovirus．Infection of Sf21 cells by mixed viruses of BmNPV—rfp． BmNPV—gfP and AcNPV(Autographa cafifomica NPV)also proved the above conclusion．Furthermore，it showed that 收稿日期：2009—05—29 资助项目：国家重点基础研究发展 计划 项目进度计划表范例计划下载计划下载计划下载课程教学计划下载 “973”项目(编号 2005CB12 1005)。 作者简介：王文兵(1966一)，男，江苏，副研究员。 Tel：05 1 1—88790629，E—mail：wenbingwang@ujs．edu．cn 通信作者：沈卫德，教授，博士生导师。 Tel：0512．65880182．E—mail：shenwd@suda．edu．cn AcNPV could help gene expression and viral amplificati— on of the viruses derived frOm BmNPV or tO fOrm hybrid viruses in Sf21 cells Yet the mechanism remains for fur— ther study． Key words Red fluorescent protein；G reen fluores— cent protein；Bombyx mori nucleOp0Iyhed rOVirus；Au— tographa californica nuc1eOpOlyhedrOVirus； Infection to cell：Infection to lissue 第 3期 王文兵等 ：利用双色荧光观察分析重组家蚕杆状病毒对昆虫细胞及蚕体组织的感染 635 杆状病毒(baculovirus)是有囊膜 的双链 DNA 病毒，为已知昆虫病毒中的最大类群，其宿主域仅限 于无脊椎动物⋯。迄今已报道有600种以上的昆虫 被杆状病毒所感染，包括鳞翅 目、膜翅 目、双翅 目、鞘 翅目和毛翅 目等7个 目的昆虫 j。在杆状病毒的二 相生活循环中产生了2种表型(virus phenotype)的 病毒粒子，即出芽型病毒(budded vires，BV)和多角 体衍生病毒(occluded virus，ov) 。 苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒(Autographa cal— ifornica nucleopolyhedrovirus，AcNPV)和家蚕核型多 角体病毒 (Bombyx mori NPV，BmNPV)是杆状病毒 的2个典型代表，2种病毒基因组全长核苷酸序列 的同源性约70％，而保守基因间的同源性则在 90％ 以上 J。尽管二者的关系很近，其天然宿主域却 不同，然而 AcNPV和 BmNPV共感染昆虫细胞产生 的新的重组病毒，可以同时感染家蚕细胞 BmN和草 地贪夜蛾(Spdopterafrugiperda)细胞 sf9_5 J。进一步 的研究表明，AcNPV基因组 中在解旋酶基因(heli． case，heli)产物第 556、564、577位点的 3个特异性 氨基酸被相应的 3个 BmNPV特异性氨基酸替代 后，其宿主范围可扩展到家蚕 J。BmNPV基 因组 DNA与包含 AcNPV heli基因的 5 kb片段共转染 后，也能感染 Sf细胞 j。但有报道表明，BmNPV不 能感染 Sf9和 High Five细胞的原因在于其 gp64产 物不能将病毒粒子转运到核内 。在早先的报道 中，BmNPV不能感 染柞蚕 (Antheraea pernyi)，但 BmNPV感染蓖麻蚕(Philosamia cynthia ricini)后，其 后代病毒就能感染柞蚕_2 J。这些证据表明在杆状 病毒的感染方面还有许多机制有待解析。 荧光观察是研究蛋白在细胞内的定位及蛋白之间 相互作用的重要手段之一。绿色荧光蛋白基因(green fluorescent protein，g7；))的应用优于来源于海洋生物香菇 珊瑚 Discosoma sp)的红色荧光蛋白基因(red fluorescent protein， )，前者信号强烈，曝光时间短。然而随着数码 科技的发展，对红色荧光的敏感度提高，西 显示与 相 当的应用价值。本实验构建以 基因取代多角体基因 的家蚕重组杆状病毒 BmNPV一却，并结合 BmNPV—gfp，进 行病毒感染昆虫细胞及蚕体组织的观察分析。 1 材料 关于××同志的政审材料调查表环保先进个人材料国家普通话测试材料农民专业合作社注销四查四问剖析材料 与方法 1．1 材料 含 基因(读码框长度为 681 bp，编码 226个 氨基酸)的质粒pDsRedl—N1购自CLONTECH公司， 家蚕 BmN细胞和重组杆状病毒转座载体 pFastBac 由中国科学院上海生物化学与细胞研究所吴祥甫课 题组馈赠；含 BmNPV杆粒的DH10菌由日本名古屋 大学 Park教授馈赠，BmNPV-gfp由本研究室构建。 1．2 携带 基因的重组家蚕杆状病毒的构建方法 根据 基因读码框的序列设计一对引物(For， TAT ! ATG GTG CGC TCC TCC CAA GAA； Rev，ACT垒垒 CTA CAG GAA CAG GTG GTG GC。)扩增片段。PCR产物经电泳鉴定以及 n I 和 Hind m 双酶切后，插入 pUC19质粒进行测序。 测序后的质粒 DNA经提取后，再以 I和 Hind Ⅲ 双酶切，分离 片段，并与同样酶切的杆状病毒 转移质粒 pFastBacl连接，转化大肠杆菌(E．coli)后 筛选重组质粒。重组质粒 DNA转化含 BmNPV杆 粒的 DHIO感受态菌，按 Invitrogen公司的相关说明 书进行重组病毒 DNA的提取和鉴定。 1．3 重组家蚕杆状病毒 BmNPV． 感染细胞的方法 将重组病毒 BmNPV—rfp DNA转染家蚕 BmN细 胞，3 d后观察细胞的感染症状及荧光产生情况，观 察用的显微镜为 Nikon Eclipse T／活细胞工作站。 以空斑法测定病毒的滴度。在病毒的混合感染中， 分别将病毒液经离心去掉细胞碎片后}昆合，并使总 病毒的 MOI为5，加入 BmN或 Sf21细胞培养液中， 于感染后72 h观察。 1．4 重组家蚕杆状病毒 BmNPV—rfp、BmNPV—gfp感 染家蚕幼虫的方法 将重组病毒 BmNPV—rfp及 BmNPV—gfp病毒液 混合后注射人家蚕 5龄起蚕体内，至出现明显症状 时解剖蚕体，取组织材料进行观察。 2 结果 2．1 重组 基因的家蚕杆状病毒的获得 利用 PCR方法扩增 基因片段后，通过经典 的 Bac—to—Bac重组杆状病毒体系，将 基因转移到 家蚕杆状病毒中，获得了感染后能产生红色荧光的 重组病毒 BmNPV—rfp(图 1一A)。病毒产生的红色荧 光较强烈，表明 基因的表达量较高，可用于昆虫 病毒感染细胞的观察或融合表达蛋白的示踪实验。 2．2 重组家蚕杆状病毒 BmNPV一却 和 BmNPV—gfp的 混合侵染观察 将滴度相近的 BmNPV—rfp和 BmNPV—gfp重组 636 蚕 业 科 学 2009；35(3) 病毒液同时感染家蚕细胞时，被感染的细胞 内呈 现出荧光，但几乎是单色荧光，而混合的荧光很少 观察到(图 1一B)。说明单个家蚕细胞融合病毒的 fA1 (C) (E) (G) 数目非常少，大多数细胞只能融合 1次。同样 ，在 感染家蚕幼虫组织的实验中也得出相似的结果 (图 1一C，D)。 (B) (D) A．BmNPV—rflJ感染家蚕细胞 B．BmNPV—rfp和 BmNPV一幽)混合感染家蚕细胞 C，D．BmNPV，rfp和 BmNPV—gfp混合感染 家蚕幼虫的血液细胞和脂肪体 E BmNPV—rfp和 AcNPV感染 Sf21细胞 F．BmNPV—gfp和 AcNPV感染 Sf21细胞 G．BraNPV一 、BmNPV—gfp和 AcNPV感染 Si21细胞 H．BmNPV-rfp、BmNPV—gfp和 AcNPV的感染液再感染 St21细胞 A．Cells inf cted with BmNPV—gp B．Cells inketed with mixed viruses of BmNPV—rfp and BmNPV—gfp C，D．Bomb~'x mo^ laⅣal blood(．e11s and fatty bodies in eted with mixed viruses of BmNPV．rfp and BmNPV．gi_p E．Sf21 cells infected with BmNPV．rrp and AcNPV Sf2l cells infeeted with BmNPV。gfp and AcNPV G．Sf21 cells infected with BmNPV．rfn ． BmNPV—gfp and AcNPV H．Sf21 cells infected again with the infected culture of BmNPV—rfp．BmNPV．gfD and AeNPV 图1 重组家蚕杆状病毒 BmNPV-rrp和 BmNPV—grp感染昆虫细胞及蚕体组织的荧光观察 Fluorescent observation of insect cells and Bombyx,nod tissues infected with recombinant baculoviruses of Bn~PV—rfp and BmNPV—gCp 第 3期 王文兵等：利用双色荧光观察分析重组家蚕杆状病毒对昆虫细胞及蚕体组织的感染 637 2．3 重组家蚕杆状病毒在 AcNPV的辅助下对 Sf21 细胞的侵染观察 当以 BmNPV—rfp或 BmNPV—gfp单独感染 Sf21 细胞时，几乎观察不到荧光的产生，但 BmNPV—rfp 或 BmNPV—gfp与 AcNPV病毒混 合后，在较多 的 Sf21细胞中均可观察到荧光(图 1一E，F，G)。该结 果表明 AcNPV的病毒粒子与 BmNPV的病毒进入 细胞的位点可能不在同一位置 ，而在混合感染的 细胞中，多角体的数目较少 说明病毒的混合感染 影响多角体的形成。同样，很难发现有 2种荧光 同时出现在单个细胞 中，进一步验证了同种病毒 只能融合细胞 1次。为 了解 BmNPV—rfp及 Bran— PV—gfp是否在 Sf'21细胞中增殖，取 5 L的混合感 染液再感染 Sf21细胞，3 d后观察发现荧光的细胞 数明显增加 ，表明家蚕重组杆状病毒在 Sf21细胞 中得到了扩增(图 1一H)。 3 讨论 本研究利用插入 基因的重组杆状病毒 BmN— PV—rfp感染昆虫细胞及蚕体组织的结果说明， 基 因也适于昆虫体系表达。杆状病毒感染机制的研究 一 直受到重视，主要的研究集中于病毒基因对病毒的 宿主域和病毒复制的相关性等 。本研究通过病毒 携带 及 基因的混合感染实验，推断一个细胞 几乎只能接受一个同种病毒。如果一个细胞能接受 多个病毒，理论上感染的细胞应几乎出现红色和绿色 叠加后的黄色；而显微镜观察的结果表明，红色与绿 色荧光的细胞很分明，2种荧光色分散在不同的细胞 中，说明只有 1种基因( 或 )表达。为排除细胞 系的原因，又将重组病毒混合后感染家蚕幼虫，结果 在家蚕血液细胞及脂肪体组织中都观察到类似情况。 同时，在非敏感细胞系的混合感染中也观察到类似现 象。这些结果都验证了我们的推断。 BmNPV不能感染 Sf细胞，但当与 AcNPV heli 基因(80 694—84 359 nt，基因登录号：122858)区域 5 kb左右的片段共转染后，可以感染 sf细胞 。该 区域 与 主要 的细胞 融 合 基 因 gp67(108 179— 109 769 nt)无关 ，与 Katou等 的研究结果不一致， 其原因可能还涉及到其他基因的协助转运机制等。 本实验的病毒混合感染结果表明，AcNPV至少可以 协助 BmNPV的多角体启动子的转录。为了解 Bm— NPV—rfp或 BmNPV—gfp是否复制，我们又吸取少量 的混合感染液进行第 2轮感染 ，结果发现发出荧光 的细胞增多，表明 BmNPV一却 或 BmNPV—gfp在 Sf21 细胞中进行了扩增，但这种扩增是 AcNPV的协助还 是不同病毒发生基因的部分重组所致，尚有待于深 入研究 参考文献 (References) [1j 吕鸿声．昆虫病毒分子生物学[M]．北京：中国农业科技出版 社，1998：149—153 [2] 吕鸿声．昆虫病毒与昆虫病毒病 [M]．北京：科学 出版社， 1982：183—184 [3] Ayres M D，Howard S C，Kuzio J，et a1．The complete DNA se— quence of Autographa califomica nuclear polyhedrosis virus[J]． Virology，1994，202(2)：586—605 [4] Gomi S，Majima K，Maeda S．Sequence analysis of the genome of Bombyx nmri nucleopolyhedrovirus[J]．J Gen Virol，1999，80(5)： l323 —1337 [5] Croizier G，Croizier L，Argaud 0，et a1．Extension of Autographa califomica nuclear polyhedrosis virus host range by interspeeifie re— placement of a short DNA sequence in the p143 helicase gene[J]． Proc Natl Acad Sci USA，1994，91(1)：48—52 [6] Argaud O，Croizier L，Lopez-Ferber M，et a1．Two key mutations in the host—range specificity domain of the p143 gene of Autographa californica nucleopolyhedrovirus are required to kill Bombyx mori larvae[J]．J Gen Virol，1998，79(4)：931—935 [7] 吴小锋，曹翠平，许雅香，等．BmNPV和 AcNPV扩大寄主域杂 交重组病毒表达载体的构建和改进[J]．中国科学 C辑生命科 学 ，2004，34(2)：156—164 [8] Katou Y，Ikeda M，Kobayashi M．Abortive replication of Bombyx nmri nucleopolyhedrovirus in Sf9 and High Five cells：Defective nuclear transport of the virions[J]．Virology，2006，347：455—465