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植物组织培养技术 教学课件 ppt 作者 王洪习 第四章:植物离体培养体系.ppt

植物组织培养技术 教学课件 ppt 作者 王洪习 第四章:植物…

希望
2019-05-28 0人阅读 举报 0 0 暂无简介

简介:本文档为《植物组织培养技术 教学课件 ppt 作者 王洪习 第四章:植物离体培养体系ppt》,可适用于高等教育领域

第四章:植物离体培养体系的建立主讲教师:王洪习联系方式:antaisohucom植物离体培养体系建立的五大技术模块植物离体培养的营养条件培养基的配制外植体的选择外植体的灭菌与接种外植体的培养技术炼苗移栽技术第一节:植物离体培养的营养条件mdash培养基主要内容培养基的营养组成常用培养基的类型与筛选培养基母液的配制培养基的配制、消毒与保存学习要求了解培养基的类型及组成掌握培养基及其母液的配制方法掌握培养基配方的筛选方法一、培养基的概念及组成培养基的概念培养基是植物组织培养的重要基质它提供植物生长所需的所有营养物质。培养基的成分无机营养有机营养琼脂糖激素无机营养大量元素微量元素大量元素浓度大于mmolL包括N、P、K、Ca、Mg、S等元素培养基中的供给状态:N:一般以硝态氮为主配合一定量的氨态氮P:以PO形式供给K:以K形式供给Ca、Mg:以Ca、Mg形式供给S:以SO形式供给MS大量元素KNONHNOKHPOMgSOmiddotHOCaCl﹒HO微量元素浓度小于mmolL包括Fe、Cu、Mo、Zn、Na、Mn、Co、B、I等元素培养基中的供给状态:Fe:以螯合铁形式提供(即FeSOmiddotHO和NaEDTA的螯合物)其它元素:均以无机盐形式提供MS微量元素KIHBOMnSOmiddotHOZnSOmiddotHONaMoOmiddotHOCuSOmiddotHOCoClmiddotHOMS铁盐FeSOmiddotHONamiddotEDTA有机营养维生素氨基酸有机添加物维生素VC:防止组织褐化VB:与愈伤组织的产生和生活力有关VB:促进根的生长烟酸:促进胚的发育肌醇:利于胚和芽的形成氨基酸甘氨酸丝氨酸酪氨酸谷氨酰胺天冬酰胺水解酪蛋白(CH)水解乳蛋白(LH)有机添加物椰乳香蕉马铃薯酵母提取液麦芽提取液苹果汁番茄汁柑桔汁MS有机物CHOmiddotHONHmiddotCHmiddotCOOHCHClNOSmiddotHClCHONmiddotHClNCHCOOH激素类mdash培养基的关键性物质激素影响到植物的细胞分化、分裂、发育激素影响到植物的形态建成、开花、结实、成熟、脱落、衰老和休眠以及萌发等的生理生化活动所以植物生长调节物是培养基的关键物质对植物组织培养起着决定性作用生长素诱导愈伤组织形成诱导根的分化促进根、茎、芽的生长种类:NAA(萘乙酸)IAA(吲哚乙酸)IBA(吲哚丁酸),D(,二氯苯氧乙酸)。活性强弱与活性比:DNAAIBAIAA活性比:IAA∶NAA∶D=∶∶。作用:诱导愈伤组织和根分化与CKT促进细胞分裂和伸长。稳定性与溶解性:除IAA外对热和光均稳定。多用酒精或稀NaOH溶液助溶。一般配成mgml的母液。浓度:-mgL组培中常用的生长素类调节剂NAAA:NAAmgL芽(少)根(无)B:NAAmgL芽(少)根(无)愈伤组织(少量)C:NAAmgL芽(少)根(多)愈伤组织(一定量)ABC细胞分裂素诱导不定芽的分化促进侧芽萌发生长抑制根的分化组培中常用的细胞分裂素常见种类BA(苄基氨基嘌呤)KT(激动素)ZT(玉米素)Zip(z异戊烯腺嘌呤)活性强弱:ipZTBAKT作用:抑制顶端优势促进侧芽的生长。多用于诱导不定芽分化和茎、苗增殖。稳定性与溶解性:CTK对光、稀酸和热均稳定溶解于稀酸和稀碱中配制时常用稀HCl助溶。通常配制成mgml的母液。浓度:-mgLBAA:BA(mgL)芽(减少)根(增多)愈伤组织(一定量)B:BA(mgL)芽(适量)根(适量)愈伤组织(一定量)AB赤霉素(GAs)种类:GA作用:促茎伸长促胚发育成植株打破休眠一般在器官形成后加入稳定性和溶解性:不耐热在低温条件下保存溶于酒精配制时可用少量酒精助溶。培养基凝聚物琼脂用量-gL种类琼脂粉琼脂条作用固化作用注意:琼脂使用有优缺点新买应试凝固力。其他物质玻璃纤维 滤纸桥 海绵等辅助性物质抗生素类物质种类:青霉素、链霉素、庆大霉素等用量:-mgL。作用:防污染减少材料损失注意:抗生素对组织生长有抑制作用使用要慎重。抗氧化物常用抗氧化剂:半胱氨酸、PVP、VC用量:-mgL作用:防止氧化褐变注意:可用抗氧化剂洗涤外植体伤口表面。辅助性物质活性炭作用:具吸附作用茎尖初代培养可防褐化促进新梢增殖(浓度-)促进生根减轻组培苗玻璃化(浓度)有利于胚胎培养。常用浓度:-gL注意:活性炭吸附性无选择性。二、培养基种类与筛选、培养基种类根据培养基的物理状态作分类液体培养基:呈液体状态的培养基为液体培养基。固体培养基:呈固体状态的培养基都称为固体培养基。固体培养基是加入凝固剂后制成的常用的固体培养基是在液体培养基中加入凝固剂(约%的琼脂或%~%的明胶)加热至℃然后再冷却并凝固的培养基。常用的凝固剂有琼脂、明胶等。其中琼脂是最优良的凝固剂。半固体培养基:半固体培养基是指在液体培养基中加入少量凝固剂(如%~%的琼脂)而制成的半固体状态的培养基。根据对培养基成分的了解程度作分类天然培养基:指一类利用动、植物或微生物体包括用其提取物制成的其营养成分既复杂又丰富、难以说出其确切化学组成的培养基。天然培养基的优点是营养丰富、种类多样、配制方便、价格低廉缺点是化学成分不清楚、不稳定。合成培养基:又称组合培养基或综合培养基是一类按植物的营养要求精确设计后用多种高纯化学试剂配制成的培养基。半合成培养基:又称半组合培养基指一类主要以化学试剂配制同时还加有某种或某些天然成分的培养基。严格地讲凡含有未经特殊处理的琼脂的任何合成培养基实质上都是一种半合成培养基。特点是配制方便成本低培养物生长良好。实验室中应用的大多数培养基都属于半合成培养基。根据培养基成分的含量分类高盐成分培养基:如MS,LS,BL,BM,ER硝酸钾含量高的培养基:如B,N,SH中等无机盐含量培养基:如H,Nitsch,Miller低无机盐培养基:如White,WS,HB培养基的筛选首先确定培养对象第二、查询相关文献第三、研究文献选择培养基类型并确定植物生长调节剂的种类。按照正交试验法设计培养基配方组合并进行培养试验。根据试验数据进行统计分析确定适合培养物的最佳培养基配方组合。再次进行验证培养试验。组培方案筛选步骤:参观咨询最佳组培 方案筛选 文献检索预备试验正交试验文献检索植物的学名、品种名、商品名此种植物组培的相关报道重点收集分析的技术信息外植体取样时间与外植体类型诱导、继代、生根培养基配方培养条件(温度、湿度、pH值等)移栽驯化条件及基质配比预备试验:针对某些关键因素简单拟定试验方案粗略判断某因素是否有影响及影响程度、剂量的大致范围。最佳组培方案的筛选一、单因子试验二、多因子试验三、逐步增减法四、广谱试验法正交试验L()正交表正交试验L()正交表L()正交表正交试验L()正交表正交试验L ()正交表正交表的代号试验方案形成的处理数试验因子数(列号数)试验因子的作用剂量水平数(可容纳的水平数)L()诱导苹果生根正交试验结果种激素种浓度的试验组合Ⅰ-BA(mgL)AAAAANAA(mgL)BBBBBBABABABABABABABABABABABABABABABABABABABABABABABABA种激素种浓度的试验组合ⅡNAA(mgL)-BA(mgL)低     中     高低中高低低低中低高中低中中中高高低高中高高逐步增减法筛选最佳有机营养添加量和最佳激素配比时常用此法。增加增加减少减少个试验处理无机盐有机物生长素细胞分裂素无机盐有机物生长素细胞分裂素LMHLMHLMHLMH个试验处理LMHLMHLMHLMH筛选出最好的试验处理试用不同类型的生长素和细胞分裂素筛选出最佳组培配方广谱试验法筛选及使用最佳组培方案应注意的问题找准主导影响因子是关键。试验有重复试材数量大于每处理瓶每瓶块培养物。试材须在相同培养上继代培养代以上才能保证试验结果可靠。最佳培养基配方长期使用后应视培养物的表现适当调整或校正。三、培养基母液的配制在植物组织培养工作中配制培养基是日常必备的工作。为简便起见通常先配制一系列母液即贮备液。所谓母液是欲配制液的浓缩液这样不但可以保证各物质成分的准确性及配制时的快速移取而且还便于低温保藏。一般母液配成比所需浓度高倍。母液种类营养元素母液大量元素母液微量元素母液铁盐母液激素母液配制营养元素的母液时注意一些离子之间易发生沉淀如Ca和SCa、Mg和PO一起溶解后会产生沉淀一定要充分溶解再放入母液中。配制母液时要用蒸馏水或重蒸馏水。药品应选取等级较高的化学纯或分析纯。药品的称量及定容都要准确。各种药品先以少量水让其充分溶解然后依次混合。营养元素母液的配制程序(以大量元素母液的配制为例)确定浓缩倍数和配制量计算所用化学药品的称取量准确称量化学药品分别溶解、定容、转移、保存。铁盐配法(MS为例):在装有ml蒸馏水的烧杯中加入粒苛性钠溶解后加入gEDTANa加热使其全部溶解然后边搅拌边慢慢加入gFeSOHO直至全部溶解冷却后定容至ml置于冰箱中备用。有机物质母液的配制维生素、氨基酸类可以分别配制也可以混在一起。植物生长调节剂母液的配制生长素配制时先用少量酒精助溶。D用mol/L的NaOH或KOH助溶加入温水定容。生长素常配成mg/ml的溶液贮于冰箱中备用。细胞分裂素类一般先用少量N盐配溶解后再加入温水冷却后定容。每种激素必须单独配成母液浓度一般配成mg/ml。用时根据需要取用。因为激素用量较少一次可配成ml或ml。另外多数激素难溶于水要先溶于可溶物质然后才能加水定容。配法:将IAA、IBA、GA等先溶于少量%的酒精中。再加水定容至一定浓度。NAA先溶于热水或少量%酒精中再加水定容到一定浓度。D可用少量molNaOH溶解再加水定容到一定浓度。将Kt和BA先溶于少量molHCI中再加水定容。将玉米素先溶于少量%的酒精中再加热水到一定浓度。MS培养基母液的配制四、培养基的配制、消毒与保存配制培养基的目的就是人为提供离体培养材料的营养源。配制的不同培养基是为满足不同类型离体材料的营养需要。培养基(固体)配制程序琼脂加热溶解定容调pH值分装灭菌糖适量水母液①③②④⑤⑥⑦预培养观察、使用、培养基配制程序示意图、琼脂、蔗糖的称量与溶解按要求用托盘天平称取琼脂和蔗糖加入适量的水然后加热溶解。磁力搅拌器的使用操作、培养基母液的移取、培养基的定容、培养基酸碱度的测定与调整pH计的使用、培养基的灭菌方法:高压蒸汽灭菌法、过滤灭菌等高压蒸汽灭菌法原理:密闭的蒸锅内在MPa的压力下锅内温度达℃。在此蒸汽温度下可以很快杀死各种细菌及其高度耐热的芽孢。(高压灭菌锅的使用)操作:完全排除锅内空气使锅内全部是水蒸气灭菌才能彻底。高压灭菌排净空气的做法:关闭放气阀通电后待压力上升到MPa时打开放气阀放出空气待压力表指针归零后再关闭放气阀。关阀再通电后压力表上升达到MPa时,开始计时维持压力~MPa分钟。可切断电源压力缓慢降零后才能开盖取出培养基摆在平台上以待冷凝。高压灭菌不变质的物品如无菌水、栽培介质、接种用具可以延长灭菌时间或提高压力。而培养基要严格遵守保压时间既要保压彻底又要防止培养基中的成分变质或效力降低不能随意延长时间。、培养基的预培养与保存灭菌后的培养基放在室温条件下预培养~d,观察未发现污染即可接种使用。灭菌后的培养基必须在周内使用完毕。

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