阿维菌素的液相色谱
分析
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.1.阿维菌素介绍阿维菌素的产生菌———阿维链霉菌(Streptomycesavermitilis)是1975年日本北里研究所从日本静岗县的一个土壤样品中分离得到的.阿维链霉菌自发现以来,以日本北里大学和北里研究所以及美国Merk公司为主的研究小组分别对它开展了深入研究,形成了一个重要的抗生素研究领域.与其他链霉菌一样,阿维链霉菌不仅具有复杂的形态分化,也具有合成多种次级代谢产物的能力,由它产生的阿维菌素在医药、农业及畜牧业上有着重要的商业价值.目前对阿维链霉菌的研究主要集中在阿维菌素的生物合成领域..2.阿维菌素结构阿维菌素的天然发酵产物共有8个组分A1a,A21,A2a,A2b,B1a,B1b,B2a和B2b,它们的区别主要在于C25,C222,23和C226位所连接的基团不同。.3 仪器和试剂高效液相色谱仪:具有紫外可变波长检测器;(岛津公司LC-10A色谱数据处理机;(CLASS-10A工作站。)色谱柱:150mm×3.9mm(id)不锈钢柱,内装Nova-PakC18、5μm填充物;(Waters)过滤器:滤膜孔径约0.45μm;微量进样器:50μL;定量进样管:5μL;超声波清洗器;甲醇:色谱级;水:新蒸二次蒸馏水;乙腈:色谱级;阿维菌素标样:已知阿维菌素(B1a+B1b)质量分数≥98.0%。.4. 色谱操作条件流动相:甲醇+乙腈+水=38+38+24,膜过滤,并进行脱气;流量:1.0mL/min;柱温:室温(温差变化应不大于2℃);检测波长:245nm;进样体积:5μL;保留时间:B1a15.6min,B1b11.3min。.典型阿维菌素乳油高效液相色谱图见图.5.溶液的配制5.1标样溶液的制备称取阿维菌素标样0.05g(精确至0.0002g),置于100mL容量瓶中,用甲醇溶解并稀释至刻度,摇匀。5.2试样溶液的制备称取含阿维菌素0.05g的试样(精确0.0002g),置于100mL容量瓶中,用甲醇溶解并稀释至刻度,摇匀。.6.测定在上述操作条件下,待仪器稳定后,连续注入数针标样溶液,直至相邻两针阿维菌素峰面积相对变化小于1.5%后,按照标样溶液、试样溶液、试样溶液、标样溶液的顺序进行测定。.7.计算试样中阿维菌素(B1a+B1b)的质量分数X1(%)按式(1)计算式中:A1———两针标样溶液,阿维菌素B1a与B1b峰面积和的平均值;A2———两针试样溶液,阿维菌素B1a与B1b峰面积和的平均值;m1———标样的质量,g;m2———试样的质量,g;p———标样中阿维菌素(B1a+B1b)的质量分数,%。.8.结果和讨论8.1线性关系试验在一定质量范围内,按照浓度递增的顺序配制数个已知样,按上述操作条件进行分析。以阿维菌素标样质量为横坐标,峰面积为纵坐标绘制标准曲线。此标准曲线通过原点。计算得回归方程为Y=2.52×108X+4.69×103,线性相关系数r=0.9999。试验证明当阿维菌素浓度在0.004g/100mL~0.2g/100mL之间(进样体积5μL)与其相应的峰面积呈现良好的线性关系。.8.2 方法精密度试验对阿维菌素原药、乳油按上述操作条件进行多次重复测定,试验表明该定量方法具有较好的精密度。其标准偏差分别为0.32、0.0089,变异系数分别为0.34%、1.1%。8.3 方法准确度试验称取数个已知含量的阿维菌素原药、阿维菌素乳油试样,分别加入一定量的阿维菌素标准品,按本方法测定其中阿维菌素总质量并计算回收率。阿维菌素原药、乳油的平均回收率分别为99.9%、100.4%,表明该方法具有良好的准确度。.8.4 最佳操作条件的选择8.4.1 检测波长的确定由阿维菌素的紫外光谱图可以看出,阿维菌素B1a和B1b的最大吸收波长均在245nm附近,由于流动相在该波长处无吸收且对B1a和B1b峰位置无干扰,故检测波长确定为245nm。.8.4.2 流动相的选择我们首先用单纯的甲醇+水作流动相,结果部分厂家的乳油产品中B1a和杂质峰分离不开。因此又改用乙腈+水作为流动相,但B1a和B1b不能与杂质完全分离。最后尝试用乙腈+甲醇+水作流动相,改变乙腈和甲醇之间的比例,发现当乙腈与甲醇比例小于1时,B1a和杂质不能完全分离。当乙腈与甲醇比例大于1时,B1b和杂质不能完全分离,当乙腈和甲醇比例在1附近时B1a和B1b均能与杂质完全分离,因此确定采用甲醇+乙腈+水=38+38+24为最佳流动相配比。在采用不同的色谱柱分析时发现:为得到合适的保留值和分离度可适当的改变体积比为1的乙腈甲醇溶液与水的比例和(或)流速。..谢谢！.
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