水牛和黄牛种间体外受精的研究

水牛和黄牛种间体外受精的研究 () 文章编号: 1008 3464 200101 0006 04 水牛和黄牛种间体外受精的研究 谭世俭, 阳年生, 石德顺 () 广西大学 动物繁殖研究所, 广西 南宁 530005 摘要: 将从屠宰母牛卵巢上采集的水牛和黄牛的卵母细胞经 20, 24 体外成熟培养后, 分别用么拉水牛 h 或奶牛精液进行种间和种内体外受精。受精卵在体外条件下继续培养到囊胚和孵化囊胚阶段。结果 表 关于同志近三年现实表现材料材料类招标技术评分表图表与交易pdf视力表打印pdf用图表说话 pdf 明, 用 () () 黄牛精子受精水牛卵母细胞 黄×水或用水牛精子受精黄牛卵母细胞 水×黄的种间体外受精均有较高 的 ()卵裂率 分别为 4615% 和 6814% 。 但其体外囊胚发育率分别只有 315% 和 817% , 显著低于种内受精组 ()发现种间受水×水组为 1919% , 黄×黄组为 2810% , < 0105。在受精后 20 对受精卵进行固定、染色, P h 精的黄×水和水×黄组, 分别有 3618% 和 7510% 的受精卵形成有 1 个以上原核, 且这些受精激活卵中大部分 () 含 2 个原核以上 分别为 8019% 和 8010% , 说明种间受精的精子已进入到卵母细胞内受精并形成了雄性原 核。 关键词: 水牛; 黄牛; 体外受精; 种间受精 17813中图分类号: O 文献标识码: A Stud ie s of in terbreed in v itro f er t il iza t ion of swam buf fa lo an d bov in e gam e te s TA N Sh i jian , YA N G N ian sh en g, SH I D e sh u n ( ), . , 530005, In st itu te o f A n im a l R ep ro du c t io n Gu an gx i U n ivN an n in g C h in a : A bstra c tT h e o b jec t ive s o f th is stu dy w e re to ex am in e th e fe r t iliza t io n ra te an d th e fu r th e r deve l2 opm en t o f bo th in te rb reed ea r ly em b ryo s de r ived f rom b u ffa lo sp e rm fe r t iliza ted in v it ro w ith bo v in e . o vum an d bo v in e sp e rm fe r t iliza ted w ith b u ffa lo o vumIn v it ro m a tu red b u ffa lo oo cy te s w e re fe r t ilized u sin g f ro zen th aw ed b u ffa lo th aw ed bo v in e sp e rm , w h ile m a tu red bo v in e oo cy te s u sin g f ro zen sp e rm. P u ta t ive zygo te s w e re co cu ltu red w ith g ran u lo sa ce ll m o no laye r s u n t il th e h a tch ed stage. T h e re su lt s show ed th a t h igh p e rcen tage o f e ith e r b u ffa lo oo cy te s fe r t iliza ted w ith bo v in e sp e rm o r bo v in e () 4615% 6814% , , oo cy te s fe r t iliza ted w ith b u ffa lo sp e rm c leaved an d re sp ec t ive lyb u t m o st o f th em . co u ld no t deve lop to th e b la sto cy st stageS ix ty p e rcen t o f bo v in e o vum fe r t ilized w ith b u ffa lo sem en 30% , an d o f b u ffa lo o vum fe r t ilized w ith bo v in e sem en co n ta in ed a t lea st tw o p ro n n c le iin d ica t in g th a t .th e sp e rm h ave p en e t ra ted in to th e o vum an d fo rm s m a le p ro n u c leu s : ; ; ; Key wrod sb u ffa loca t t lein v it ro fe r t iliza t io nin te rb reed 1 业已证明, 某些家畜品种与其近缘野生物种虽然染色体数目不同, 但杂交后可产下后代, 如蒙古 () () () () 野马 染色体 66 条×家马 ?, 染色体 64 条, 杂种后代 染色体 65 条; 蒙古野驴 56×Q, α 2000 09 27 收稿日期: () 基金项目:国家教育部骨干教师基金资助项目 教技司 2000 65 号; 广西 “十百千”人才 工程 路基工程安全技术交底工程项目施工成本控制工程量增项单年度零星工程技术标正投影法基本原理 基金资助项目 () 谭世俭 1953 , 男, 广西贺州人, 广西大学副研究员。 作者简介: () () ()() () 家驴 62, 后代 59; 非洲野牛 60 60, 后代称为凯他洛牛 60等。 甚至还有一些动 ×家牛 () () () 物通过种间杂交也可获得后代, 如家驴62×家马 64, 后代为马骡 63; 家马×家驴, 后代叫 ( ) ( ) ( ) ( ) 驴 骡 ; 格 里 弗 斑 马 4 6 × 家 马 , 后 代 5 5 ; 及 非 洲 斑 马 4 4 条 × 家 驴 , 后 代 5 3 ; () () (家山羊 60×家绵羊 54, 后代 57, 但目前只能发育到胎儿阶段, 妊娠 6 周时流产, 尚无活仔出 )生。尽管这些杂种后代绝大多数均无生育能力, 但不少杂种生产性能得到很大提高, 同时也丰富了物 种的多样性。1983 年,英国剑桥的 等人利用胚胎嵌合的方法,获得了世界首批山羊和绵羊的嵌 F eh illy () 合体 4 头, 创造出某些物种在自然条件下无法办到的种间生殖的新途径。水牛和黄牛的嵌合体研究 2 () 也有成功的报道。水牛和黄牛同科 洞角科而不同属, 亲缘关系较远, 在自然条件下, 种间公母畜 不会进行交配, 但它们之间又有着不少相似之处。 如利用体外受精技术, 对其种间生殖的可能性进行 探讨, 并以此为模式, 应用于别的物种, 将有望人为打破物种间的生殖隔离, 创造出新的物种。目前, 出于拯救濒危动物的目的, 异种克隆已成为人们研究的热点。 要取得异种克隆的预期效果, 必须同时 对异种生殖的相关现象进行探索。 我区养有水牛 400 多万头, 数量上多于黄牛, 位居全国的前列。 水 牛的繁殖力较低, 肉用及奶用性能均比黄牛差, 若能通过黄牛与水牛种间受精, 产下杂种后代, 也可 为广西水牛的利用提供一条崭新的途径。为此, 我们于 1997 年 3, 5 月及 1998 年 6 月间, 应用体外受 精技术, 对水牛和黄牛的种间受精的可能性进行了初步的探索, 现将结果报道如下。 1 材料与方法 111 卵母细胞的体外成熟培养 从当地屠宰场收集本地母水牛和黄牛卵巢, 并在 5 内送达实验室。采用注射器抽取法采集卵巢表h 面直径 1, 8 卵泡中的卵母细胞,经洗涤一次后,放入含有 2 5% 发情牛血清的 成熟199 mm mL T CM 培养液中,3815? 、 含 5% 空气和最大相对湿度的 培养箱中进行 20, 24 的体外成熟培 在 CO 2 CO 2 h 养。 112 卵母细胞的体外受精 本 次实验所用精液分别为自行冷冻保存的细管荷斯坦奶牛和么拉公牛精液。使用前在37 ?水浴中 解冻, 采用’改 良 液 经1 5 悬 浮 法 分 离 上 层 活 精 子 , 然 后 离 心 浓 缩 待 用。受 精 液 为 修 正 的T y ro de s m in 3 ’液。将经过适当处理后的体外培养成熟的黄牛和水牛卵母细胞10, 15个一组放进预先制备好 T y ro des ( ) 的 受 精 液 滴 中 , 然 后 根 据 实 验 设 计 , 分 别 用 奶 牛 精 液 受 精 水 牛 卵 母 细 胞 黄 × 水 和 黄 牛 卵 母 细 胞 () () ()黄×黄以及用水牛精液受精黄牛卵母细胞 水×黄和水牛卵母细胞 水×水。 每个受精液滴加 6 入大约 4 上述处理好的精液, 精子的最终浓度大约为 1×10个ƒ。 然后放入 培养箱中进行 ΛL mL CO 2 体外受精培养。 113 早期胚胎的体外培养 精子和卵子共同孵育 20, 24 后, 将受精卵用培养液洗涤 1 次, 剥离外层卵丘细胞后臵于已制备h 4 好的颗粒细胞单层液滴中继续培养。在授精后 48 检查卵裂率, 6, 12 内观察囊胚的发育及孵化情 h d 3 况, 计算囊胚发育率和孵化率。部分批次的一部分卵母细胞在授精后 18, 20 按先前报道的方法进 h () (行固定 固定液为乙醇?乙酸, 3?1, ƒ并染色 染色液为含 110% 间苯二酚蓝的 4510% 的冰醋 V V ) 酸, 观察原核发育情况。 所有实验数据均采用卡方分析其统计学上的差异显著性。 2 结果与分析 211 水牛和黄牛种间及种内体外受精结果 利用奶牛精液对水牛卵母细胞进行种间体外受精, 获得 4615% 的卵裂率和 315% 的囊胚率, 均非 () 常显著地低于其种内受精结果 相应为 6011% 和 1919% , P < 01005, 囊胚孵化率也明显地低于种内 (())受精胚胎 分别为 25% 和 7019% , < 0105。而用水牛精液受精黄牛卵母细胞, 虽然其卵裂率 6814% P (() ) 与种内受精的结果 6916% 相似, 但种间受精的卵母细胞体外发育到囊胚的比率 817% 也极显著 () 地低于奶牛精液受精黄牛卵组 2811% , P < 01001, 种间受精胚胎的孵化囊胚比率也较低。结果见表 1。 表 1 水牛和黄牛种间及种内体外受精结果 Table 1 In v itro deve lopm en t of zygo te s der ived f rom in terbreed f er t il iza t ion of buf fa lo an d bov in e gam e te s ()()()处理重复次数 卵裂ƒ授精卵数 % 囊胚ƒ授精卵 % 孵化囊胚 % T rea tm en t C leavage B la sto cy st s H a tch ed R ep lica te s ()ƒ4 2510 () () 110 273 46154114 315127ƒƒ黄×水 Bo v ine sp e rm × B uffa lo o vum a e ()() () 水×水 × 3955 7019 10 ƒ178ƒ296 6011 ƒ276 1919 55B uffa lo sp e rm B uffa lo o vum bcf ()() () 48 5010 5 ƒ水×黄 × 134ƒ196 68148ƒ92 817B uffa lo sp e rm Bo v ine o vum cd ge () () 9 357ƒ513 6916118ƒ421 2810黄×黄 × d h 3 Bo v ine sp e rm Bo v ine o vum () ( ) (注 : 13 由 于 胚 胎 用 于 冷 冻 保 存, 无 法 观 察 到 孵 化 囊 胚 阶 段 th is g ro up w e re N o teA ll em b ryo s f rom ) () ????< 0101; ??< 0105., , , , , , ; 2??, ; adb defeh P fgfh P f ro zen ab ac 212 受精后原核形成情况 () 从受精后 18, 20 受精卵染色观察结果看, 用奶牛精子受精的水牛卵母细胞 黄×水有 3618%h () 具有一个以上原核, 而用水牛精子受精黄牛卵母细胞 水×黄有 75% 具有一个以上原核, 这说明这 些异种精子已穿过卵子的透明带激活卵子完成第 2 次成熟分裂并形成雌性原核。 其中, 在有原核形成 ( ) 的受 精 卵 中 , 用 奶 牛 精 子 受 精 水 牛 卵 的 有 8 1 1 0 % 1 7 ƒ2 1 、用 水 牛 精 子 受 精 黄 牛 卵 的 有 8 0 %( ) 1 2 ƒ1 5 含有2个以上原核, 说明种间受精的精子已进入卵子内受精并形成了雄性原核。用奶牛精子 ( ) ( ( ) 受 精 水 牛 卵 组 黄 × 水 有 2 9 1 8 % 1 7 5 7 的 受 精 卵 形 成 2 个 以 上 原 核 , 与 水 × 水 组 4 0 % , ƒ () () ) 20ƒ50的结果差别不大 = 0. 而用水牛精子种间受精黄牛卵母细胞 水×黄, 具有 2 个原 3679; P () ( )核的受精卵高达 60% 12ƒ20,显著地高于黄×水组 < 0105。 结果见表 2。 P 表 2 水牛和黄牛卵种间及种内受精后染色检查结果 Tba le 2 Fer t il iza t ion ra te of buf fa lo an d bov in e gam e te s f er t il ized in terbreed an d in trabreed 合子数 N o. o f zygo te s 处 理检查卵数 () ()()合计单个原核 % 两个原核 % 三个原核 % T rea tm en t O o cy te s .T h ree T o ta l S ing le Tw o in sem p ro n u c lea r p ro n u c lea r s p ro n u c lea r s () () ()() 1016 28111 118 21 361857 4 7黄×水 Bo v ine sp e rm ×B uffa lo o vum a a () 0 5010 () () 水×水 ×25 50 1020 40105 10B uffa lo sp e rm B uffa lo o vumbac bac ()(0 15 20 ) () 3 7510 12 水×黄 ×15106010B uffa lo sp e rm B uv ine o vumc c () 注 : ?, < 0105. N o teacP 3 讨论 一般认为, 哺乳动物卵母细胞的透明带由三种糖蛋白组成, 称为 1,2 和 3。 其中 3 是ZP ZP ZP ZP , 并且能触发顶体反应。 在受精时,精子首先与 结合,精子的特异受体3 粘在精子头部并刺激3 ZP ZP 精子顶体小泡的胞吐。 然后, 一种顶体内层蛋白暴露于精子顶部, 这种新暴露的蛋白质是精子细胞与 5 精子受体偶联的配基, 它使精卵细胞膜得以融合而发生受精。经体外成熟培养后的卵母细胞, 以受精 卵中含有 2 个以上原核判断为有雄性原核的形成, 异种精子的穿透率至少在 3010%, 6010% 之间。这 是否由于水牛和牛的卵母细胞上的精子结合蛋白的物种特异性不强, 或是由于体外培养成熟的卵母细 胞透明带上的精子结合蛋白结构上有变化尚有待证实。 当然, 种间体外受精的受精卵原核形成率还是 明 显低于种内受精。 据先前的实验观察, 牛 , 20 的种内受精卵, 含 2 个以上原核的占了18IV F h 3 8516% , 其中含 2 个正常原核的为 7013% , 明显高于种间体外受精结果。 ( 用 奶牛精子种间受精水牛卵母细胞, 其卵裂率很显著地低于用水牛精子的种内受精 分别为 () ) 4615% 和 6011% , = 010015, 也极显著地低于黄×黄的种内受精组 6916% , < 010001; 而用水 P P (() ) 牛精子种间受精黄牛卵母细胞的卵裂率 6814% 与其种内受精水牛卵细胞的卵裂率 6011% 差别 (() )不大 P = 010784。 对于经体外培养成熟的黄牛卵母细胞来说, 不管用水牛精子 种间还是用奶牛 () ()水精子 种内受精, 其卵裂率均差别不大 分别为 6814% 和 6916% , = 018222。这些结果说明, P 牛卵母细胞透明带上的精子结合蛋白的物种特异性可能要比黄牛的强, 以致降低了种间受精的精子穿 ()卵率, 导致卵裂率的明显下降。 这也与受精后检查原核形成的结果相符合 见表 2。 () 以受精的卵母细胞为基数, 来自种间受精 水×黄和黄×水组的早期胚胎在体外培养的条件下, () 绝大部分 分别为 9113% 和 9615% 不能发育到较高级的囊胚阶段, 体外囊胚发育率显著地低于来自 () 种内受精 水×水或黄×黄的胚胎。 据观察, 种间受精的胚胎大部分发育到 8 细胞阶段便退化, 这 正是胚胎由母源性基因向父母源性基因表达的过渡时期, 以及新的 、 和蛋白质合成启动m RN A rRN A 6 (的阶段。这是否由于种间受精导致杂种胚胎细胞核染色体数目异常 沼泽型水牛含 24 对染色体, 河 ) 流型水牛含 25 对, 而黄牛含 30 对染色体, 出现核质互作失调, 对培养环境的敏感性增大, 而导致早 期胚胎的发育阻断。 本次实验结果说明, 水牛和黄牛的种间体外受精可获得较高的卵裂率, 但来自种间受精的早期胚 胎体外继续发育的能力很低, 发育囊胚和孵化囊胚数量少。 今后仍需在方法学上继续改进, 以进一步 深入探讨种间受精的一些现象和机理。 参考文献: 1 许怀让, 范必勤组译.北京: 科学技术出版社, 1982. 731, 732.HA F E S E S 主编; 农畜繁殖学 [M . 2 郭志勤, 张继慈, 张沅, 等编著.北京: 中国科学技术出版社, 1998. 206.家畜胚胎工程 [M . () 3 谭世俭, 卢克焕. 受精用液种类对牛卵母细胞体外受精的影响 [. 中国兽医学报, 1994, 14 2: 140, 145. J 4 谭世俭, 卢克焕. 牛体外受精技术的研究一单层细胞予培养时间对牛早期胚胎体外发育的影响 [J . 广西畜牧兽 () 医, 1993, 9 1: 11, 14. 5 著. 发育生物学 [. 北京: 高等教育出版社, 1998. 112, 114.M U L L ER W A M 王建辰, 章孝荣主编. 动物生殖调控 [. 合肥: 安徽科学出版社, 1998. 224.6 M 广西大学六项科技成果荣获 2000 年度广西科技进步奖 2000 年度广西科技进步奖经专业组评审, 评审委员会综评核准, 共评出授奖项目 137 项, 其中一 等 奖 1 项, 二等奖 25 项, 三等奖 111 项。广西大学 6 项科技成果获奖, 其中二等奖 2 项, 三等奖 4 项。 广西大学获得 2000 年度广西科技进步二等奖的项目是: ?土木工程学院徐伟章教授课题组与南宁 水利电力设计院合作完成的开发项目《左江水利枢纽泄水建筑物体型优化研究》; ?生物技术实验中心 柏学亮研究员课题组与广西桂林正丰科技实业有限公司合作完成的开发项目《生物技术处理生活污水 污泥制造生态有机肥》。 获得三等奖的项目是: ?农学院赖传雅教授课题组与荔浦县农业局、 平乐县农业局、 荔浦县科学 技术协会等单位合作完成的开发项目《荸荠秆枯病病原、发病规律与防治研究》; ?农学院邓国荣研究 员课题组与国营桃城华侨农场、 国营武鸣华侨农场里建分场、 国营左江华侨农场等单位合作完成的综 合防治技术项目《龙眼新出现的几种有害生物综合防治技术研究》; ?林学院黄承标副研究员课题组与 广西桂平市金田林场合作完成的研究项目《广西桂平县马尾松工程林环境监测研究》; ?林学院徐峰副 教授课题组与广西国有东门林场、 广西林业学会标准化技术委员会合作完成的开发项目《中国及东南 ()亚商用木材 1000 种构造图象计算机光盘查询系统》。科技处 顾红