硝酸还原酶活性测定[教学]
实验八 硝酸还原酶活性测定
一、目 的
硝酸还原酶是植物氮素代谢中的关键酶之一,它与作物吸收利用氮肥有关,对作物的产量和品质有影响。因而可以把硝酸还原酶的活力当作植物营养或农田施肥的指标之一,也可作为品种选育的指标之一。通过本实验可初步掌握测定硝酸还原酶活性的原理与方法。
二、原 理
,, 硝酸还原酶能将NO还原成NO 32
,, 产生的NO的量与硝酸还原酶的活性相关。通过测定反应液中产生的NO22含量,即可确定酶活性大小。
,, NO含量可用磺胺显色法测定。NO与磺胺及 a,萘胺在酸性条件下生成红22
色偶氮化合物 其反应如下:
酶活性可用单位鲜重组织在单位时间内产生的亚硝酸量来
表
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示:
亚硝酸态氮微克数/克鲜重组织1小时。 三、实验材料、仪器和试剂
1(实验材料 植物的根、茎、叶,本实验选用白萝卜叶片
2(仪器
(1)分光光度计(2)离心机(3)真空泵和真空干燥器
(4)恒温水浴锅(5)恒温箱(6)刻度吸管(lml、2ml、5ml)
(7)试管 (8)天平 (9)三角瓶(50ml)
3(试剂
(1) 亚硝酸钠标准液:称取0.1000g亚硝酸钠(AR),用蒸馏水溶解并定容至100ml。然后吸取5ml再用蒸馏水定客至1000m1。即为浓度5μg,ml的亚硝酸钠标准液。
1,(2pH7.5磷酸缓冲液 )0.lmol?L
,1(3)0.2 mol?L的硝酸钾溶液
(4)1,对氨基苯磺磷酸
(5)2,α,萘胺
(6)30,三氯乙酸
四、操作步骤
1(标准曲线的制作
取6支试管,编号,按下表操作
管 号
操作项目 1 2 3 4 5 6
NaNO淀标准液 (ml) 0 0.4 0.8 1.2 1.6 2.0 2
蒸馏水(ml) 2.0 1.6 1.2 0.8 0.4 0
NaNO含量(μg) 0 2 4 6 8 10 2
磺胺(ml) 各4
α,萘胺 各4
摇匀在30?水浴中保温20分钟。然后在520ml波长下比色测定消光值。以亚硝酸钠含量为横坐标,消光值为纵坐标绘制标准曲线。
2(酶反应和酶活性测定
2 将白萝卜叶片洗静,剪成0.5cmh的小片,混匀后称三份,每份0.5,1.0g,分另放人50ml的三角瓶中,编号按下表加试剂
摇匀,置真空于燥器中,抽气10分钟。然后将三角瓶放人恒温箱,在30?暗条件下保温30分钟。取出后向2,3号瓶中分别加人 l ml 30,三氯乙酸终止反应,将反应液离心(3000rmp 10分钟)或过滤。分另吸取2ml反应液于三只试管中各加 4ml 1,磺胺和 0.2,a,萘胺。
摇匀在30?水浴中保温20分钟。然后在520ml波长下比色测定消光值。
五、结果与计算
酶活性(亚硝酸钠μg,g鲜重?h),亚硝酸钠微克数(μg)×稀
释倍数,样品重(g)×时间(h)
六、注意事项
1(酶促反应在暗条件下进行,以防光照下叶绿体形成还原型铁氧还蛋白,促
使亚硝酸还原酶把NO还原成NH。 23