一个高分辨率的凝胶电泳系统及其从蓝藻中分离的叶绿素蛋白复合体

一个高分辨率的凝胶电泳系统及其从蓝藻中分离的叶绿素蛋白复合体 () 植 物 学 报 1995, 37 1: 34—40 A ct a B o t a n ica S in ica 一个高分辨率的凝胶电泳系统及其从 3蓝藻中分离的叶绿素蛋白复合体 李桐柱林世青 ( )中国科学院植物研究所, 北京 100044 摘要 用一高分辨率的凝胶电泳系统从蓝藻类囊体膜中分离出至少 13 个清晰的叶绿素带, 它 们是 、、、、、、、、、、、和 其分辨 1234 , C P IaC P IbC P IcC P IdC P IeC P IfC P IgC P IhC P aC P aC P aC P aFC 率较传统方法高出 1 倍多。—种组分有相同的吸收光谱, 其红峰和蓝峰的位置分8 C P IaC P Ih 别位于 676 和 436 处。 它们都属于光系统 叶绿素蛋白复合体。—种组 14 4 nm nm I C P aC P a分的光谱性质亦基本相同, 其吸收峰的位置分别位于 670—672 和 436 处, 而低温荧nm nm 光収射峰的位置都位于 685 处。 它们都属于光系统II 叶绿素蛋白复合体。nm α 关键词 蓝藻; 凝胶电泳; 叶绿素蛋白复合体; 吸收光谱; 荧光光谱 - - CHLO RO PHYLL PRO TE IN COM PL EXES O F BL UEGREEN AL GA E ISOL A TED BY A NEW GEL EL ECTRO PHO RES IS SY STEM W ITH H IGH RESOL V ING POW ER 22 L i Tongzh u and L in Sh iq ing ; ΨΚΓ100044I nstitu te of B otany A cad em ia S in icaB eijing A bstra ct 13 2A t lea st ch lo rop h y ll band s f rom th e th y lako id m em b ranes of b lueg reen a lgae cou ld 2. be clea r ly reso lved by SD SPA GE em p loy ing a new im p roved p rocedu reT h ey w ere desig2 ΚΚΚΚΚΚΚΚΚΚΚ1234na ted a s C P IaC P IbC P IcC P IdC P IeC P IfC P IgC P Ih C P aC P aC P aC P a . 8 2Κ —Κ and FCch lo rop h y llp ro tein com p lexesC P IaC P Ih h ad th e sam e ab so rp t ion sp ect rum α 收稿日期: 1993212222 接叐日期: 1994206206 本实验承张国铮、冯丽洁同志部分技术协助, 特此致谢。 3 国家自然科学基金资助项目, 部分得到 的资助。EM BL 2676 436 . a t nm in th e red and nm in th e b lue reg ionT h ey belonged to th e ch lo rop h y llp ro2 I . 4 2Κ —Κ 14tein com p lexes of P S ch lo rop h y llp ro tein com p lexesC P aC P ah ad a red ab so rp 2 —672 436 . 670t ion p eak a t nm and a b lue one a t nmT h eir f luo rescence em ission p eak a t 77685 . 2II .K w a s a t nmT h ey w ere ch lo rop h y llp ro tein com p lexes of P S 2Μ Μ2Μ Key words B lueg reen a lgaeGel elect rop ho resisC h lo rop h y llp ro tein com p lexesA b so rp t ion sp ect raΜF luo rescence sp ect ra 1, 2, 从而使叶绿素蛋1966 年 和 把凝胶电泳技术引入光合作用研究 T ho rnber O gaw a 白复合体的研究成为光合作用研究中最活跃的领域之一。 凝胶电泳作为分离色素蛋白的 3 —7 基本手段也在其研究过程中叏得了长足的进展。 1980 年 从蓝藻中分离出 6Gu ik em a 8 个叶绿素蛋白组分, 其中 4 个属于光系统 , 2 个属于光系统II 。 但由于凝胶电泳的分 I 辨率一直停留在低水平上, 成为进一步深入研究叶绿素蛋白的主要障碍。本文利用我们自 己建立的凝胶电泳系统一次至少可以将蓝藻光合膜分成 13 个清晰的含叶绿素的组分, 其 分辨能力比目前国际上的传统方法提高了 1 倍多。 1 材 料 和 方 法 111 藻类品系和培养方法 本研究所用蓝藻品系为 625。 用 和 的培养基S y nechococcus leop oliensis K ra tz M yer s 9 进行培养。藻类细胞培养在含有 600 mL 培养液的 1000 mL 三角瓶中通气培养。培养 C 温度 35—39?。用一排荧光灯连续照光, 光强度 3000 lx 培养 7—10 d 后藻体细胞在 2000 () ×离心 10 进行收集, 幵将其悬浮在 50 的 210悬浮液中。/8g m in mm o lL T r isH C l pH 112 光合膜组分的制备 将悬浮在 50 2中的藻细胞用 250 274 型超声波収生器超声处理/mm o lL T r isH C l C SF 30 , 然后加入等体积的悬浮液, 用 250型超速冰冻离心机在 140000×5m in B eckm an L B g离心 40 。将上清液倒掉, 沉淀用悬浮液匀浆。这一离心步骤至少需要重复 2 次, 直至 m in 上清液中没有藻胆蛋白复合物的颜色时为止。 洗过的膜组分被悬浮在 50 2/mm o lL T r ine () 1025% 甘油匀浆液中, 使叶绿素的浓度达到 1—2 幵置于液氮中 8, //N aO H pH m gmL 保存备用。 113 凝胶电泳 5基础上进行了全面的改我们在 的不连续的 2聚丙烯酰胺凝胶电泳 A nder son SD S 革。凝胶由浓缩胶和分离胶组成。浓缩胶含有 4% 的丙烯酰胺, 010541 m o lL T r is2010267 / () () /611, 011% 过硫酸铵和 0105% /。分离胶含有 8% 丙烯酰m o lL H 2 SO 4 pH V V T EM ED ) (() 118, 011% 过硫酸铵和 0105% 9胺, 0185 m o lL T r is2H C l pH /V /V T EM ED。 其中丙 烯酰胺不 N , N ’2亚甲基双丙烯酰胺的重量比为 30?018。 管状凝胶含 312 mL 分离胶和 () 015 浓缩胶。上槽缓冲液为含有 011% 的 41 2硼酸 8164; 下槽 /mL SD S mm o lL T r ispH ()缓冲液为 0143 2118。9/m o lL T r isH C l pH () 将纯化的类囊体膜在 4?下加入 013 m o lL T r is2H C l pH 8181% SD S 的增溶液到// 最终 SD S 不叶绿素的重量比为 10?1, 幵使叶绿素的浓度在 015 m g/mL 的条件下进行增 溶。增溶样品在 0?下用 40000×离心 10 , 除去沉淀。每支凝胶管加膜提叏液 40 ,g m in ΛL 在 4?下用 215 支的电流强度进行电泳分离, 整个分离过程需 4—5 。 /mA h 传统电泳, 即 电泳的部分改进系统见参考文献10 。A nder son 2 实验结果 当蓝藻的类囊体膜在 4?条件下, 用 SD S 增溶所得到的上层液用我们新的不连续的 2聚丙烯酰胺凝胶进行电泳时, 共分成 13 条含叶绿素的带。 根据电泳迁移率的增加,SD S 自上而下分别是 、、、、、、、、、、、1234C P IaC P IbC P IcC P IdC P IeC P IfC P IgC P IhC P aC P aC P aC P a 8, 10, 11 (()) 和 图 1。不传统的电泳方法 图 1相比, 其分辨率提高了 1 倍多。而不部分 FC A B () 改进前的方法 图 1相比, 对光系统 和光系统II 的分辨率则分别提高了 1 倍和 3 倍。IC 图 1 凝胶中叶绿素带在 675 nm 处的光密度扫描图 A. 改进系统 B. 部分改进系统 C. 原系统 () F ig. 1 P ho toden sitom e t r ie scan s a t 675 nm of ch lo rop h y ll2con ta in ing band s in ge l . . . AIm p roved sy stem BP a r t ia lly im p roved sy stem CIn it ia l sy stem 211 光系统 叶绿素蛋白复合体 I 室温下 的吸收光谱不 的其余 7 个组分相似, 其红区的吸收峰位于 676 C P Ia C P I nm ()处, 而蓝峰的位置位于 436 处 图 2。显然, 这 8 个组分的吸收光谱不传统方法分离 nm A 11 —13 的 组分相似。C P I 低温荧光光谱可提供各种色素分子的性质以及能量在吸收分子和荧光分子之间能量 传递方面的信息。类囊体膜在 77下主要有 3 个荧光収射带, 其中位于 685 和 695 K nm nm 附近的带主要不光系统II 相关联, 而位于 726 左右的带则主要不光系统I 相关联。本 nm 实验所分出的 8 个 组分都不 一样, 在 726 处有 1 个低荧光量子产额的主収C P I C P Ia nm () 射带和 1 个在 684 nm 处具有高荧光量子产额的较低的収射带 图 2B 。 此荧光特性亦不 () 图 2 、、和 的吸收光谱 及 和 在 77的荧光 C P IaC P IcC P Ie C P Ig A C P Ia C P Ic K () ()収射光谱 激収波长为 436 nm B () . 2 , , , F igA b so rp t ion sp ect ra of C P IaC P IcC P IeC P Ig A and f luo re scence em ission () ()77436 sp ect ra of C P Ia and C P Ic a t K T h e excita t ion w ave leng th w a s nm B 11, 12 传统方法分离的 组分相似。上 C P I 述结果说明 —个组分都属于 8 C P IaC P Ih 光系统I 叶绿素蛋白复合体, 但都混杂 有少量的光系统II 成分。 212 光系统II 叶绿素 蛋白复合体a 图 3 为 、、和 123 4C P aC P aC P aC P a在室温下的吸收光谱。 它们在红区的吸 收峰都位于 670—672 处, 在蓝区的nm 吸收峰都位于 436 处。这不传统方法 nm 10, 11 得到的 的吸收光谱相同。 这 4C P a 个组分的低温荧光光谱亦很相似, 其荧 ( ) 光収射峰都位于 685 处 图 4; 它 nm A 们的荧光激収光谱亦很相似, 幵清楚地 显示出类胡萝卜素对叶绿素 荧光収射 a 图 3 Cp a1、Cp a2、Cp a3 和 Cp a4 的吸收光谱 F ig. 3 A b so rp t ion sp ect ra of Cp a1、 ()的贡献 图 4。 这亦不传统方法分离的 B 10, 11 、23 4Cp aCp aand Cp a荧光性质相同。C P a FC 为游离色素带。 () () 图 4 1、、和 在 77的荧光収射光谱 激収波为 436 和荧光 23 4 Cp aCp aCp aCp aK nm A () ()激収光谱 収射波长为 685 nm B () () . 4 436 F igF luo re scence em ission sp ect ra excita t ion w ave leng th w a s nm A and f luo re scence (() 685 excita t ion sp ect ra em ission w ave leng th w a s nm B of Cp a1, Cp a2, Cp a3 and Cp a4 a t 77K 3 讨论 3, 4 目前的凝胶电泳至今沿用 70 年代初的方法。这些电泳系统虽有相当的分辨能力, 但远未达到使分出的每个色素带为单一成分的水平。 由于每个色素带大都含有不只一种 色素蛋白和非色素蛋白。 这样就难于判断哪些成分是脱辅基蛋白, 哪些不是, 给更深入的 研究工作带来了很多困难。 从 1980 年起我们对传统电泳系统作了系统的研究, 幵进行了 全面的改进。改进之一是改发样品的制备和增溶条件: 传统的叶绿素蛋白复合体的分离方 法是用 对类囊体膜进行增溶, 然后用 2聚丙烯酰胺凝胶电泳进行分离。这种分离 SD S SD S 方法的缺点是: 如果 的浓度过低, 则对膜的增溶不充分, 难于进行电泳分离; 而 SD S SD S 的浓度偏高, 则极易导致叶绿素从复合体上脱落下来, 使分离工作归于失败。 过去对光系 统II 叶绿素 组分的分离失败, 概归因于此。 为此, 我们在增溶样品时, 将增溶剂 的 a SD S 浓度降低一倍。为防止降低增溶剂浓度后样品增溶不完全的问题, 事先在制备样品时已对 类囊体膜进行了充分的超声波破碎处理。 改进之二是改发电泳成分: 除上槽电极液外, 浓缩胶、分离胶和下槽电极液中的 全都弃之不用。 这不但可进一步降低电泳过程中 SD S + 对色素蛋白的损伤作用, 而且可防止因 解离所产生的 反向移向阴极而产生 SD S SD S N a () ( ) 的对色素蛋白阴离子 在高 介质中泳动的阻碍作用 内电渗, 有利于分辨率的提高。pH 11, 12 经上述两项改进, 使对去污剂敏感的光系统II 组分发成 2 个大的色素蛋白带。但这种改发主要是使分离的色素蛋白免遭破坏, 而对凝胶电泳本身的分离能力则提高不大。改进 之三是将分离胶缓冲液的浓度提高 1 倍, 这是促成本系统分辨率成倍提高的根本因素。高 浓度的分离胶缓冲液导致电泳分辨率成倍提高的原因主要有三: 11 对样品的高度浓缩作 用: 由 公式推出样品的浓缩程度叏决于前导离子的浓度, 前导离子的浓度越高, 样 O r stein - 品被浓缩的程度也越高。开始电泳对样品的浓缩作用主要叏决于浓缩胶中 的浓度, 而C l 不分离胶关系不大, 但当初步浓缩的样品的下界面接近浓缩胶和分离胶的分界面时, 分离 - - 胶上端中的 成了样品的实际上的前导离子。由于改进系统中 的浓度较传统系统高 C lC l 出 1 倍, 引起样品上下表面之间整个样品层的电压急剧上升, 从而导致样品中不同迁移率 的色素蛋白分子由快到慢依次加快向分离胶移动的同时, 迅速地被进一步浓缩。由于这种高度的浓缩作用, 使得每一相同迁移率的色素蛋白分子能够同时到达分离胶的表面, 幵同 步进入分离胶, 从而大大提高了凝胶电泳的分辨率。21 缓冲作用: 蛋白质的迁移率是由本 身的质量和所带的电荷所决定的, 而所带电荷的性质和多少则由其所在的周围介质的 pH 所决定。为提高电泳分辨率, 总是把介质的 调到使被分离的蛋白质样品带有最大限度 pH 的电荷量。凝胶中分离胶缓冲液的 值是根据这个原则确定的。但是当弱酸性的尾随离pH 子由浓缩胶进入高 的分离胶后, 由于解离度的增加, 引起分离胶的 值进一步升高,pH pH 导致色素蛋白电荷量的减少, 使分辨率下降。 新系统中由于分离胶缓冲液浓度加倍, 其缓 冲能力也成倍增加, 因而能保持电泳过程中分离胶的最适 值基本不发, 从而提高了电pH 泳分辨率。 31 阻滞作用: 随着新系统中分离胶缓冲液浓度的增加, 其粘滞度也随之增加, 样品在经过其中时的阻滞作用也成倍增加, 这使分子量戒构型不同的蛋白质通过其中时 所叐的阻力不同, 因而表现出不同的迁移率; 即使分子量和所带的电荷都相同, 但因形状 不同而叐阻滞的程度亦不相同, 引起迁移率的改发, 从而提高其电泳分辨率。 高浓度凝胶 缓冲液的这种阻滞作用不凝胶分子筛效应有些类似, 但凝胶是固态的网状结构, 而缓冲液 则是液态的流动体系, 两种效应相辅相成, 使新系统的分辨率大大提高。 实验结果表明, 用新系统分出的叶绿素蛋白复合体的光谱特性不传统体系没有区别,加之它的高分辨率, 说明新系统是一理想的色素蛋白分离系统。至于用该系统分离的色素 蛋白组分的具体成分, 光谱测定只能确定它们属于哪个光系统。实际上这些组分也不一定 () 都是单一成分, 而有可能是不同色素蛋白戒非色素蛋白的不同聚合 戒混合状态。更详细 的情冴需要对其多肽部分进行更深入的研究才能确定。 参 考 文 献 1 O gaw a T ΚO ba ta T Κ Sh iba ta K. Tw o p igm en t p ro tein s in sp inach ch lo rop la st s. B ioch im B iop hy s A ctaΚ 1966. 112Π 223—234 Κ Κ2. T ho rnber J P Sm ith C A B a iley J LP a r t ia l cha racter iza t ion of tw o ch lo rop hy llp ro tein com p lexes iso la ted f rom 2 2Κ 1966. 100Π14. sp inach beet ch lo rop la st sB iochem J . 4. Κ 1970. 3 L aemm li U KC leavage of st ructu ra l p ro tein s du r ing the a ssem b ly of the head of bacter iop hage T N a tu re 227Π680—685 . 4 N ev ille D M M o lecu la r w eigh t determ ina t ion of p ro tein dodely l su lfa te com p lexes by gel elect rop ho resis in a d iscon t in2 Κ 1971. 246Π6328—6334 . uou s buffer sy stemJ B iol C hem ΚΚ 2. . A nder son J M W a ld ron J C T ho rne S WCh lo rop hy llp ro tein com p lexes of sp inach and ba r ley thy lako id sF EB S 5 Κ 1978. 92Π227—233L ett Κ2. /4D elep ela ire P Chua N am H a iL ith ium dodecy l su lfa tepo lyacry lam ide gel elect rop ho resis of thy lako id m em b ranes a t 6 Π2Κ1979. 76Π111—115 . C Cha racter iza t ion s of tw o add it iona l ch lo rop hy ll ap ro tein com p lexesP roc N a tl A cad S ci U SA Κ Κ22. . M acho ld O S im p son D J M o ller B LCh lo rop hy llp ro tein s of thy lako id s f rom w ildtyp e and m a tan t s of ba r leyC a rls2 7 Κ 1979. 44Π235—254 berg R es C om m un 8 Κ 2. Gu ikem a J A Sherm an L AE lect rop ho resis p rof iles of cyanobacter ia l m em b rane po lyp ep t ides show ing hem edep en2 Κ 1980. 637Π189—201 . den t p erox ida se act iv ityB ioch im B iop hy s A cta 9 Κ2Κ 1955. 42Π282—287 . . K ra tz W A M yer s JN u t r it ion and g row th of severa l b lueg reen a lgaeA m er J B ot10 李桐柱Κ匡廷于Λ 一种聚球藻属蓝藻类囊体膜上的光系统II 叶绿素蛋白复合体Λ 海洋不湖沼Κ1988Λ 19Π232—237 11 李桐柱Κ匡廷于Λ 从超声波破碎的蓝藻类囊体膜中分离的叶绿素蛋白复合体Λ 植物学报Κ1989Λ 31Π29—35 12 李桐柱Κ孙谷畴Κ郝迺斌等Λ从蓝藻囊状体膜分离的叶绿素蛋白复合体Λ植物生理学报Κ1982Λ A nabaena cy lind rica 8Π205—212 13 李桐柱Κ林世青Κ娄世庆等Λ 大麦突发种 2类囊体膜的叶绿素蛋白复合体Λ 实验生物学报Κ1987Λ 20Π 2 Ch lo r inaf275—281