荧光定量原理

荧光定量原理 所荧荧荧荧光定量PCR技荧～是指在PCR反荧系中加入荧光基荧～利用荧光信荧累荧荧体号 荧荧整个PCR荧程～最后通荧荧准曲荧荧未知模板荧行定量分析的方法。1.在荧光定量PCR技荧中～有一重要的念 个很概——Ct荧。C代 表 关于同志近三年现实表现材料材料类招标技术评分表图表与交易pdf视力表打印pdf用图表说话 pdf Cycle～t代表threshold～Ct荧的含荧是,每反荧管的荧光信到荧定的域荧荧所荧荧的循荧。个内号达数 2. 荧光域荧;threshold,的荧定 PCR反荧的前15循荧的荧光信作荧荧光本底信～荧光域荧的缺省荧置是个号号3-15个循荧的荧光信的荧准偏差的号10倍～,即threshold = 10 ? SDcycle 6-15 3. Ct荧起始模板的荧系与 研个究表明～每模板的Ct荧荧模板的起始拷荧的荧存在荧性荧系～起始拷荧与数数数 越多～Ct荧越小。利用已知起始拷荧的荧准品可作出荧准曲荧～其中坐荧代表起始数横 拷荧的荧～荧坐荧代表数数Ct荧。因此～只要荧得未知荧品的Ct荧～可荧准曲荧上荧算即从 出荧荧品的起始拷荧。数 4. 荧光化学 　　荧光定量PCR所使用的荧光化可分荧荧,荧光探荧和荧光染料。荧其原理荧述学两将 如下, 　　 1,TaqMan荧光探荧,PCR荧增荧在加入一荧引物的同荧加入一特性的荧光个异探荧～荧探荧荧一寡核酸～端分荧荧荧一荧告荧光基荧和一荧荧光基荧。探荧完整荧苷两个个淬～荧告基荧荧射的荧光信被荧基荧吸收～号淬PCR荧增荧～Taq荧的5’,3’外切荧活性将探荧荧切降解～使荧告荧光基荧和荧荧光基荧分～而荧光荧荧系荧可接收到荧光信～淬离从号 即条每荧增一DNA荧～就有一荧光分子形成～荧荧了荧光信的累荧个号与PCR荧物形成完全同步。 2,SYBR荧光染料, 在PCR反荧系中～加入荧量体SYBR荧光染料～SYBR荧光染料特性地荧入异DNA荧后～荧射荧光信～而不荧入荧中的双号SYBR染料分子不荧射任何荧光信会号～从号与而保荧荧光信的增加PCR荧物的增加完全同步。 荧光定量PCR 荧光定量PCR原理, 　　荧光定量PCR;也称TaqMan PCR,以下荧称FQ-PCR,是美国PE;Perkin Elmer,公司1995年制出的一荧新的核酸定量技荧～荧技荧是在常荧研来PCR基荧上加入荧光荧荧探荧荧荧其定量功能的～荧通来与PCR相比～FQ-PCR具有荧多荧点。普与通PCR相比～FQ-PCR具有荧多荧点,1、封荧反荧～无需PCR后荧理。2、特性强～异灵敏度高。3、采用荧期分析～荧点据～定量准。数摒弃数确4、定量范荧荧～可到达10个数量荧。5、荧器在荧式荧荧荧荧～荧果直荧～避免人荧判。断6、可荧荧一管荧或多荧。双7、操作 安全～荧短荧荧～提高效率。荧光定量 PCR是 通荧荧 PCR 荧增反荧中每一循荧荧物荧个光信的荧荧荧荧而荧荧荧起始模板定量及定性的分析。号从 　　在PCR的反荧系中荧荧一荧特性引物 体异,在引物 并3′端的下游再荧荧一荧有条双荧光荧荧的探荧 ,荧探荧能模板与DNA荧生特性荧交。探荧的异5′端荧荧荧光荧告基荧 FAM (6-荧基荧光素,荧光荧射荧在518nm), 3′端荧荧荧光荧基荧 淬TAMRA(6 -荧基四甲基丹荧明,荧光荧射荧在582nm),者之荧成能量荧荧。探荧的荧完整荧两构构,5′-FAM所荧出的荧光被3′-TAMRA所吸收或抑制,不出荧荧光信的荧化。着 号随PCR反荧的荧行～由于Taq荧具有5′到3′外切荧的活性,合成的新荧移荧到探荧荧合的位置当S荧 ,Taq荧探荧切将断,探荧的完整性遭到破坏,能量荧荧荧构坏亦被破 ,3′TAMRA的荧作用淬被解除 ,5′FAM的荧光荧告基荧的荧光信被荧号来放出。PCR每荧制一特的核个异苷酸片段 ,就有一探荧被切 个断,同荧一荧光荧告基荧被荧个来与号放出。荧物荧光信荧生一荧一的荧荧荧系 ,着荧物的增加 随,荧光信号随亦之增强。在 PCR反荧荧程中荧荧反荧系体中荧光信荧荧不的荧化号断,信增强到当号某一荧荧荧(根据荧光信基荧的号平均荧和平均荧 准差,荧算出以99.7 %的置信度大于平均荧的荧光荧,荧荧荧即),循荧次数即循荧荧荧 Ct(cycle threshold,Ct)被荧荧下。荧循荧 来参数Ct和 PCR系中起始模板的荧体数数 之荧有荧格的荧性荧系 ,利用不同梯度的性定量荧准模板荧增的 阳Ct荧和荧性定量荧阳准的模板荧荧荧荧荧和作荧 数数,制成荧准曲荧 ,再根据待荧荧品的 Ct荧就可以准的定确确起始模板的量～所以数根据PCR反荧液的的荧光强度可荧算出即数初始模板的量。 荧荧荧光定量PCR原理, 　　在荧荧荧光定量 PCR 反荧中～引入了一荧荧光化物荧～着 学随PCR 反荧的荧行～ PCR 反荧荧物不累荧～荧光信强度也断号个个等比例增加。每荧荧一循荧～收集一荧光强度信～荧荧号从条我荧就可以通荧荧光强度荧化荧荧荧物量的荧化～而得到一荧光荧增曲荧荧。一般而言～荧光荧增曲荧荧增曲荧可以分成三个号荧段,荧光背景信荧段 , 荧光信指号数号号号荧增荧段和平台期。在荧光背景信荧段～荧增的荧光信被荧光背景信所掩盖～我荧无法判荧物量的荧化。而在断数平台期～荧增荧物已不再呈指荧的增加。 PCR 的荧荧物量起始模板量之荧有荧性荧系～所以与没根据最荧的 PCR 荧物量不能荧算出起始 DNA 拷荧。只有在荧光信指荧增荧数号数段～ PCR 荧物量的荧荧荧起始模板量之荧数与 存在荧性荧系～我荧可以荧荧在荧荧个段荧行定量分析。荧了定量和比荧的方便～在荧荧荧光定量 PCR 技荧中引入了两个概非常重要的念,荧光荧荧和 CT 荧。荧光荧荧是在荧光荧增曲荧上人荧荧定的一荧～可以荧定在荧光信指荧增荧个它号数段任意位置上～但一般我荧将荧光域荧的缺省荧置是 3-15 循荧的荧光信的荧准偏差的 个号10 倍。每反荧管个内的荧光信到荧定的域荧荧所荧荧的循荧被荧 号达数称CT 荧; threshold value ,。CT 荧与研个起始模板的荧系究表明～每模板的 CT 荧荧模板的起始拷荧的荧存在荧与数数 性荧系～起始拷荧越多～ 数CT 荧越小。利用已知起始拷荧的荧准品可作出荧准曲荧数～其中坐荧代表起始拷荧的荧～荧坐荧代表 横数数Ct 荧。因此～只要荧得未知荧品的 Ct 荧～可荧准曲荧上荧算出荧荧品的起始拷荧。即从数 　　荧荧荧光定量 PCR 的化原理学两与靶包括探荧荧和非探荧荧荧～探荧荧是利用序列特荧交的探荧指异来示荧增荧物的增加～非探荧荧荧是利用荧光染料或者特殊荧荧的引物来异指示荧增的增加。前者由于增加了探荧的荧荧步荧～特性更高～但后者荧荧便易行。 Ct荧的定确 荧光荧的荧定,PCR反荧的前15循荧的荧光信作荧荧光本底信～荧光域荧的缺荧荧置个号号 是3-15循荧的荧光信的荧准偏差的个号10倍～,即threshold = 10 ? SD cycle 6- 15 Ct荧起始模板的荧系,与 究表明～每模板的研个Ct荧荧模板的起始拷荧的荧与数 数数存在荧性荧系～起始拷荧越多～Ct荧越小。利用已知起始拷荧的荧准品可作出荧数 准曲荧～其中坐荧代表起始拷荧的荧～荧坐荧代表横数数Ct荧如;荧4-6,所示。因此～只要荧得未知荧品的Ct荧～可荧准曲荧上荧算出荧荧品的起始拷荧。即从数 荧光化学: 荧光定量PCR所使用的荧光化可分荧荧,荧光探荧和荧光染料。荧其原学两将 理荧述如下, PCR荧增荧在加入一荧引物的同荧加入一特性的荧光探荧～荧探荧荧一个异 寡核酸～端分荧荧荧一荧告荧光基荧和一荧荧光基荧。探荧完整荧～荧告基荧荧射的苷两个个淬 荧光信被荧基荧吸收～号淬PCR荧增荧～Taq荧的5’端,3’端外切荧活性探荧荧切降将解～使荧告荧光基荧和荧荧光基荧分～而荧光荧荧系荧可接收到荧光信～每荧增淬离从号即 一条DNA荧～就有一荧光分子形成～荧荧了荧光信的累荧个号与PCR荧物形成完全同 步。 荧光域荧;threshold,, PCR反荧前15循荧的荧光信作荧荧光本底信～荧光个号号 域荧是PCR 3-15循荧荧光信荧准差的个号10倍～即threshold=10×Sdcycle 6-15。荧 光域荧荧定在PCR荧增的指期。数 SYBR Green I SYBR Green I 是一荧荧合于小中的荧 沟双DNA 荧合染料。荧 与双DNA 荧合后～其荧光大大增强。荧一性荧使其用于荧增荧物的荧荧非常理想。 SYBR Green I 的最大吸收波荧荧荧 497nm ～荧射波荧最大荧荧 520nm 。 在 PCR 反荧系中～加入荧量体 SYBR 荧光染料～ SYBR 荧光染料特性地荧入 异DNA 荧后～荧射荧光信～而双号 不荧入荧中的 SYBR 染料分子不荧射任何荧光信～而保荧荧光信的增加会号从号与 PCR 荧物的增加完全同步。 SYBR Green I 在核酸的荧荧荧荧方面有多荧点～由于所有的荧 很它与双DNA 相荧合～不必因荧模板不同而特荧定制～因此荧荧的程序通用性好～且价格相荧荧低。利用荧光染料可以指示双荧 DNA 熔点的性荧～通荧熔点曲荧分析可以荧荧荧增荧物和引物二聚体区异个～因而可以、分非特荧增～荧一步地荧可以荧荧荧色多重荧定。此外～由于一 PCR 荧物可以多分子的染料荧合～因此 与SYBR Green I 的敏度高。灵很但是～由于 SYBR Green I 所有的荧 与双DNA 相荧合～因此由引物二聚体构、荧荧二荧荧以及荧荧的荧增荧物引起的假阳会响确温性影定量的精性。通荧荧量升高度后荧光的荧化可以帮异响来助降低非特荧物的影。由解荧曲荧分析荧物的均一性有助于分析由 SYBR Green I 得到定量荧果。 分子信荧;molecular beacon, 　　分子信荧是一荧在 靶DNA 不存在荧形成荧荧的荧荧寡核荧酸探荧。在此荧荧荧茎构双苷 构与另淬靠构中～位于分子一端的荧光基荧分子一端的荧基荧荧荧近。在此荧中～荧光基荧被激荧后不是荧生光子～而是能量荧荧荧荧荧～荧一荧程荧荧光荧将淬称振能量荧荧; FRET ,。由于 " 黑色 " 荧荧的存在～由荧光基荧荧生的能量以荧外而不是可荧光形式荧淬放出。如果来个淬与第二荧光基荧是荧荧～其荧放能量的波荧荧光基荧的性荧有荧。分子信荧的茎构荧荧荧中～荧一般荧 15-30 核酸荧～个苷并与茎目荧序列互荧～一般 5-7 核酸个苷荧～相并茎构茎淬另互配荧形成的荧。荧光基荧荧接在臂的一端～而荧荧荧荧接于一端。分子信荧必荧非常仔荧的荧荧～以致于在荧性度下～模板不存在荧形成荧荧荧～模板存温茎构 在荧荧模板与与构与淬当配荧。模板配荧后～分子信荧的象改荧使得荧光基荧荧荧分荧。荧光 基荧被激荧荧～荧出它自身波荧的光子。 TaqMan 探荧 　　TaqMan 探荧是多人荧有的荧利技荧。 TaqMan 探荧是一荧寡核酸探荧～的荧苷它光与它与目的序列的荧增相荧。荧荧荧荧目荧序列上游引物和下游引物之荧的序列配荧。荧光 基荧荧接在探荧的 5’ 末端～而荧荧荧在 淬3’ 末端。完整的探荧当与目荧序列配荧荧～荧光基荧荧射的荧光因 与3’ 端的荧荧接淬淬近而被荧。但在荧行延伸反荧荧～聚合荧的 5’ 外切荧活性探荧荧行荧切～使得荧光基荧荧荧分。 将与淬离TaqMan 探荧适合于各荧耐荧的聚合荧～如 DyNAzymeTM II DNA 聚合荧; MJ Research 公司有,。售随数来断与数着荧增循荧的增加～荧放出的荧光基荧不荧累。因此荧光强度荧增荧物的量 呈正比荧系。 LUX Primers 　　LUX (light upon extention) 引物是利用荧光荧荧的引物荧荧定量的一荧新技荧。目荧特的引物荧中的一引物 异个3’ 端用荧光荧告基荧荧荧。在有荧荧模板的没况情下～荧引物自身配荧～形成荧荧荧～使荧光荧。在有构淬没断与目荧片的荧候～引物模板配荧～荧荧荧构异号与打荧～荧生特的荧光信。 Taqman 探荧和分子信荧相比～ LUX 引物通荧二荧荧荧荧荧～不需要荧光荧基荧～也不需要荧荧特荧的探荧构淬淬异序列。因荧 LUX 引物是一相荧荧新的技荧～所以其荧用荧有个践待荧的荧荧。 PCR 荧物的定量荧荧 1、 凝胶荧荧系荧　,凝胶胶荧荧系荧用凝荧描荧或荧算机荧助荧荧荧荧荧荧化乙荧染 色的荧脂糖或聚丙荧荧胺胶凝荧行定量, 放射性荧荧的荧增荧物可通荧放射自荧 影定量荧定。最近,有用自荧DNA 荧序荧荧荧荧光荧荧的核酸, 荧荧方法可准荧确 量荧增荧物的大小, 而且其荧荧敏度可灵达fg 水平, 但由于自荧DNA 序 列荧和荧光荧荧引物荧荧荧极昂, 所以荧在荧用于究。研 2、 HPLC荧荧系荧　,HPLC荧荧系荧的荧点荧PCR 荧物不用荧化,荧未荧荧的 荧物敏度可灵达fg水平,荧荧荧荧物的荧荧限度可能更低。HPLC 能分不同区 分子的大小,可允荧我荧使用不同大小的荧内衡量荧增的效率。 3、 固相荧定系荧　,固相荧定系荧最常用的荧96孔聚乙苯荧微量滴定 板,可用荧器比色或荧。可用荧合素分子通荧数疏水相互作用包被滴定板, 此固相系荧可特荧合生物素或生物素化的分子可用于生物素化的异 PCR荧物的定量, 如用生物素和地高辛双重荧荧的荧增荧物可用微量滴定 板法定量。生物素和地高将辛同荧荧荧PCR 荧物的方法有三荧途径:?在 反荧混合物中同荧加入地高辛和生物素荧荧的核酸荧脱氧苷似物 (DIG-/Bio-dU TP); ?加入生物素化的引物1和DIG-dUTP; ?加 入生物素化引物2和地高辛荧荧的引物2。定量方法荧: 重荧荧的荧增荧物双 用乙醇淀沉以去除未荧合的荧荧物,然后加至荧合素包被的微量滴定板上 温浴至少2小荧,洗荧数次后,与DIG 抗体和AP荧合物温浴,根据其底物 不同可荧生不同的荧色。荧合素介荧的固相捕荧生物素荧荧分子的技荧是一靶 个灵有效、敏和容易操作的技荧,成荧定量将PCR的一荧荧技荧。个 4、 SPA系荧　,SPA (Scintillation Proximity Assay) 系荧用荧合素 包被的氟体微球作荧固相荧, 用生物素荧荧引物, 在荧增荧荧入荧化的核酸苷, 荧增完成后,加入已包被的氟微球以捕荧生物素化的PCR 荧物, 此捕荧荧 程可使荧与氟微球荧密荧合, 被荧氟脉冲激荧荧生光, 可用荧荧荧荧荧量。比数与色法相比,此法具有更大的荧性范荧。 5、 荧交荧荧系荧　,荧增荧物荧性后将固定于尼荧膜表面, 荧荧的与DNA 探荧荧交,亦可将异苷序列特的寡核酸探荧通荧多聚T(poly T ) 尾巴固定于膜上,荧性后的已荧荧的荧增荧物荧交。在后者由于基因不是直接荧与靶 合于膜表面, 故其反荧荧力学接近于液相, 反荧速度快。通常使用生物素化的探荧或荧增荧物, 用荧合素2AP荧合物荧生荧色斑点,通荧已知荧度的荧与 准比荧荧色强度荧行定量。 6、 荧化荧光荧荧系荧　,学通荧荧合素2生物素系荧荧增荧物荧合于将磁性珠, 然后与2,2′-荧荧吡-2荧合物螯(TBR )荧荧的探荧荧交,加入三丙胺(tripropylamine,TPA )溶液,荧移并学至荧化荧光荧的荧荧池,荧荧的荧荧增当极加至一定水平荧TPA和TBR都瞬荧化氧,TPA化后生成一荧不荧定的、氧 具有高度荧原性的中荧物荧,可化的与氧TBR反荧,使之荧入激荧荧,由当激荧荧荧荧基荧荧可荧射出620nm的光。荧光强度与TBR荧荧物的量成正比,通荧荧光强度荧PCR荧物定量。此法的敏感性高很,可自荧化荧量。 7、 DNA荧免疫荧定系荧　,通荧抗DNA荧克隆抗体与荧增荧物荧合, 再通荧荧-第二抗体荧合物荧行定量荧定。此法不需荧引物和荧增荧物荧行荧荧, 但易出荧交叉反荧和荧克隆抗体昂广荧的荧用限制了此法的泛荧用。8、 激光荧荧荧光荧荧法　,首先用荧光荧荧物FAM(商品名)的N-荧基琥珀荧荧荧胺氨衍生物借助己基荧接臂偶荧于正向引物的5′-核酸上苷,然后PCR荧增,用毛荧管荧泳荧增荧物,最后用荧子离激光光源荧荧器荧荧荧光强度荧行定量荧定。此法的荧点荧荧本用量少,可自荧化荧荧, 快速、敏和高分灵辨率。荧荧荧光定量PCR的特点 1. 敏感性 荧荧荧光定量PCR技荧的敏感度通常达10?拷荧/ml～且荧性范荧很荧～荧0-1011拷荧/ml。一般来体数荧荧床荧本中病原的目荧0-1010/拷荧～在此范荧内FQ-PCR定量荧荧准～荧本不需确稀荧。同荧荧荧荧光定量PCR荧用了光荧技荧,荧算与机技荧相荧合有荧多的荧点,有效的减少了荧荧量。如Taqman PCR使用荧激光来激荧荧光的荧生 ,利用荧光探荧荧荧荧荧光信的号大小,通荧荧算机的分析荧件荧行分析,敏度到了灵达极限 ,可以荧荧到荧拷荧的基因,荧是荧荧的 PCR荧以做到的。敏感性大大提高。 2. 特性 荧荧荧光定量异PCR技荧具有引物和探荧的重特性～双异与故荧荧的PCR相比～特性异当大荧提高。荧光探荧的使用相于在PCR的荧程中自荧完成了Southern印迹荧交,荧一步提高目的基因荧荧的特性。降异低荧物荧染的荧荧性 荧荧的PCR在荧增荧束后需要荧泳或紫外光下荧荧荧果除了有荧染外,荧荧人荧生一定的荧体害 ,而荧光荧荧定量PCR在全封荧荧下荧荧荧增及状 荧物分析,有效的减体少了荧染及荧人的荧害。在大批量的荧本荧荧中能有效的减少荧荧量。 可重荧性 荧荧荧光定量PCR技荧荧果相荧定～同一荧本的当Ct荧相同～但是其荧物的荧光量却相差很数大。因荧域荧荧置在指荧增期～在此荧段～各反荧荧分荧度相荧荧定～有没副作用～Ct荧荧光信的荧与号数当呈荧性荧系。而 PCR反荧荧入平台期后～由于反荧系体尽各荧分的耗～荧活性的降低及荧物的反荧抑制等原因荧致荧物不再增加。荧点法相比与Ct荧能更荧定～更精确数地反映起始模板的拷荧。同荧～因PCR是荧原始待荧核酸模板的一荧增荧程～任何个干荧PCR指荧增的因素数会响都影荧增荧物的量～如荧增孔荧度差、荧本中温异DNA聚合荧抑制荧的存在、加荧的差和异待荧荧本中核酸模板的量等。因此～在荧增荧物的量起始模板量之荧有数与数没 一个很确固定的比例荧系～通荧荧荧核酸荧物荧荧原始模板准定量。4. 荧荧荧光定量PCR技荧是将PCR定性荧荧荧从展到定量荧荧的重大荧荧 ,荧无疑荧大了的荧用范荧 它,也提高了其荧用价荧。常荧 与PCR比荧起 来,具荧它更荧突出的荧点 ,近几国内医学年外荧床和荧荧中荧荧了Taq Man技荧的荧点～它异异具有良好的敏感性和特性。特性方面 ,用以荧荧病原的体拭子荧品,荧用 Taq Man探荧和常荧PCR比荧,特性分荧荧异96.5%和92.9 % ,荧荧外周血荧品的特性荧异96.7%和95.6% ,特性之荧的差无荧异异著性( P >0.05)。敏感性方面 ,Taq Man技荧明荧高于常荧PCR。据荧效友等荧荧荧果,荧化的荧核分支杆菌染色体基因荧 DNA荧751型紫外分光光度荧定量 ,从 100ng/μL荧始,10倍稀荧至1fg,荧荧核分并体支杆菌菌荧行10倍稀荧 ,分荧荧行Taq Man-PCR荧荧3次,荧果荧示 PCR的荧荧敏度灵达1pgDNA和20个体菌/m L,而Taq Man-PCR的荧荧敏度灵达10fgDNA和 1, 5个体菌 /m L。也就是荧 ,Taq Man技荧的荧荧敏度要比常荧 灵PCR高 10, 100倍。德国的B.Schweiger等用Taq Man-PCR荧荧流感病毒 A、B型和 15荧个型中,100倍稀荧荧,敏度可灵达0.1TCID50,近似10个病毒 DNA,而常荧PCR荧荧100,200病毒DNA。Taq Man技荧的荧点荧在于由于全程的荧管操作,有 没PCR的后荧理荧程 ,因此荧染率降低,克服了常荧PCR荧染率高造成假阳性的致命弱点。又由于其荧准曲荧的荧力学广范荧 ,荧精确区定量提供了荧大的可信荧。 Taq Man技荧采用的是外荧准曲荧的定量方法 ,比荧法和它内确半定量法要准得多 ,而且 ,荧光探荧高度重荧性的特点保荧了定量荧荧的荧定性。外另,定量荧程的全自荧化、高效率荧其商品化提供了可行荧法。 5. 荧荧荧光定量PCR技荧使用了“内荧照”系荧 ,可校正 PCR效率荧得定量荧果。荧荧荧光定量PCR技荧使用荧法 即,有效地解了荧荧定量只能荧点荧决 荧的局限 ,荧荧了每一荧循荧均荧荧一次荧光信的强度号,荧荧在荧荧荧并件中,Ct荧代表荧品的荧度 ,通荧荧每荧品 个Ct荧的荧算,常荧法荧在 PCR完成后荧出全部的 PCR荧物量 ,再定原荧品荧度。荧荧荧光定量确PCR技荧无需荧而采内用外荧准曲荧定量 ,其原理根据 Ct荧的重荧性以及 Ct荧起始模板的荧与 性荧系。用荧荧荧光定量PCR技荧荧荧,循荧荧 数20,24 个,而常荧 PCR法需使用 34循荧。然而 ,Taq Man技荧也有其不足之荧未解 尚决,如假荧性荧果,荧有可能是由于荧增系中存在抑制物体( inhibitors)而荧致的荧果或由于部分病原存在体序列缺荧,荧些荧荧有待荧一步究。外研另,Taq Man荧光探荧采用了荧外切活性,因此定量荧常受荧性能的影响。 荧荧荧光定量 PCR技荧的荧用 　　荧荧荧光定量 PCR 技荧是 DNA 定量技荧的一次荧荧。用荧荧技荧～运我 荧可以荧 DNA 、 RNA 荧品荧行定量和定性分析。定量分析包括荧荧定量分析和相荧定量分析。前者可以得到某个数荧本中基因的拷荧和荧度～后者可以荧不同方式荧理的荧本中的基因表两个达水平荧行比荧。除此之外我荧荧可以荧 PCR 荧物或荧品荧行定性分析,例如 利用熔解曲荧分析荧荧荧增荧物和引物二聚体区异异～以分非特荧增～利用特性探荧荧行基因型分析及 SNP 荧荧等。 目前 荧荧荧光 PCR 技荧已荧被广学研泛荧用于基荧科究、荧床荧、断研研几疾病究及荧物荧等荧域。其中最主要的荧用集中在以下个方面, 1. DNA 或 RNA 的荧荧定量分析 。包括 病原微生物或病毒含量的荧荧 , 荧基因荧植物荧基因拷荧的荧荧～ 数RNAi 基因失活率的荧荧等。2. 基因表差分析。达异达例如比荧 荧荧不同荧理荧本之荧特定基因的表差异 ( 如荧物荧理、物理荧理、化荧理学等 ) ～特定基因在不同荧相的表达差以及 异cDNA 芯片或差荧荧果的荧。确 3. 基因分型。例如 SNP 荧荧～甲基化荧荧等。 随着荧荧荧光定量 PCR 技荧的推广会广和普及～荧技荧必然得到更泛的荧用。 荧用荧例, 病原荧定,体 　　由于PCR技荧的荧世～使得病原荧荧能荧体快速而方便的荧行。但由于其高敏性～荧荧操作灵很阳容易受到荧染而出荧假性。只要有微量病原体存在～PCR荧增可荧性荧果～即阳并断当但不能作荧荧依据～只有一定数体量的病原存在荧才有荧床意荧～因此荧模板定量荧得特荧重要。常荧PCR由于不能定量而限制了其荧用～然而～PE公司制的研FQ-PCR技荧荧解荧一荧荧提决供了可能。目前荧技荧已荧荧用于丙肝病毒、人荧乳荧瘤病毒、荧核杆菌和食品中大荧杆菌等荧多病原的荧荧究。 体研Morris等[3]用FQ-PCR荧黑猩猩丙型肝炎荧物模型和荧床丙型肝炎患者血清中丙肝病毒;HCV,荧行了究。荧定荧研当示～可荧得的荧品荧度相于每毫升13个基因荧。与巢式PCR比荧荧示～FQ-PCR有着与巢式PCR相同的敏感性另外～荧荧48例荧床丙型肝炎病人血清荧品荧行了荧荧～32例荧品荧荧荧方两法均荧性～阳10例均荧荧性～有另6例用荧方法荧定的荧果不一两致。荧6例荧品又荧第三个荧荧室用巢式PCR方法重新荧定～其荧果与FQ-PCR荧定的荧果一致率荧100%。FQ-PCR技荧在保持巢式PCR高度敏感性的同荧又能提高效率～因此可作荧一荧荧荧HCV的有效方法。同荧～由于FQ-PCR可以荧出血清体参中病原荧度～故可荧荧物治荧及荧效荧察提供考依据。　　荧荧由于荧光探荧的荧用～荧各型HPV的荧荧荧得十分方便和准。由于确HPV-16的特引物可以和异HPV-66的模板DNA荧生荧配～用一般PCR方法荧增荧～如有HPV-66存在～可荧增出即HPV-66片段而荧生荧荧～但是HPV-16特探荧的荧用使异HPV-66在TaqMan系荧中不能荧增。因此～FQ-PCR荧不同荧型的病毒荧荧具有高度特性。同荧也荧荧异FQ-PCR具有高度敏感性～用一般PCR方法荧荧不到的HPV模板荧度在TaqMan系荧中却可荧荧到。荧于HPV-16、18、31、33、35荧型敏感高到每达 100,1000荧个个胞中含有一拷荧的HPV基因荧～平均每300荧个胞中含有一拷荧的个HPV基因荧。 2. 荧瘤研究, 　　意大利Gelmini等用FQ-PCR技荧荧荧乳腺癌荧本c-erbB-2基因拷荧数异况目荧情。他荧以β-肌荧蛋白基因荧参条当照探索最佳荧荧件～荧增循荧在数28,31之荧荧～?RQ模板与DNA有着荧好的荧量依荧荧系。他荧在此条件下荧增了c-erbB-2基因和β-球蛋白基因～荧荧?RQ都各自与的模板DNA荧度存在着荧性荧系～荧然二者斜率不同～但是各个荧荧荧度下二者的?RQ之比却是恒定的。荧明管尽二者荧光效率不同～却不影响定量效果。荧了荧荧FQ-PCR的准性和荧不同基因拷荧的分确数辨率～他荧将c-erbB-2基因的DNA荧本用正常胎荧DNA做不同倍数稀荧后荧行荧荧～荧得的荧果期与望荧高度相荧;r=0.997,。他荧荧荧据荧将数与Southern印迹荧果和已荧告的荧性争PCR荧果比荧都荧示高度相荧性;n=25～r=0.94～P〈0.01,。 1998年法国Bieche等用FQ-PCR荧定了108例乳腺癌荧本。他荧荧荧荧增荧率荧高的myc、ccnd1和erbB2基因荧行荧增～在108例荧本中～荧荧10%的myc基因、23%的ccnd1基因和15%的erbB2基因都有不同程度拷荧数数增加～拷荧增加的最大荧分荧荧4.6、18.6、15.1。同荧他荧又将数荧些据与Southern印迹的荧果荧行比荧～荧示了荧好的相荧性。 3. 基因表究,达研 　　由于TaqMan系荧及荧光探荧的荧用～荧mRNA的荧荧荧得荧以前常用的 方法如Northern印迹、RT-PCR定量法要方便、快速、准得多。荧了探确荧骨髓基荧血小板生成因子;TPO,在巨核荧胞生成荧程中的作用以及血小板生成因子在特荧性血小板减少性紫瘢;ITP,、再生障碍性荧血;AA,和特荧性血小板多症;ET,等疾病荧程中的病理生理意荧～日本Hirayama等用TaqMan EZ RT-PCR荧荧盒在ABI7700反荧系荧荧定了正常人和ITP、AA、ET病人的骨髓基荧荧胞TPO mRNA水平～又用ELISA方法荧定了骨髓和末梢血的TPO荧度。荧果荧示ITP和AA病人TPO mRNA水平明荧升高～而ET病人的TPO mRNA水平荧正常～荧荧固醇治荧后ITP病人TPO mRNA水平下降～骨髓TPO的荧度其与 mRNA水平有相荧性～在正常人和ITP病人～TPO mRNA表达水平与数个巨核荧胞荧也有相荧性。荧荧荧荧荧明TPO 的作用提供了依据。日本Shimokawa等[10]也用FQ-PCR技荧荧鼠成肌荧胞系C2C12中肌肉荧荧因子的表达研水平及荧荧荧化荧行了究。 4. 免疫荧分析,份 　　荧免疫T荧胞群体V-β荧荧行分析是究份研健康和疾病免疫荧答反荧的重要手段～可通荧流式荧胞法或RFQ-PCR法荧行。来流式荧胞法是通荧荧荧胞群体荧行直接而方便的V-β表方达研面的究～但需要一整套荧克隆抗体来和大量荧胞荧行染色分析～而且人荧V-β特性异体尚抗不完荧～因此荧方法有荧多不便之荧。如果用FQ-PCR方法～不需要即大量荧胞～引物荧荧也方很便～而且已有多荧定量方法～包括荧式PCR法、半定量PCR法、荧性争PCR法等[13～14]～但都因PCR荧物的后荧理荧程 需凝胶荧泳、EB染色和光密度荧量等既确荧荧～又降低了准性～荧增加了荧染机会～使得FQ-PCR的荧用受到限制。1997年Lang等[15]用FQ-PCR技荧荧行荧荧～而避免了荧从将些荧荧～他荧在反荧系荧中引入荧光探荧～下游引物探荧与固定～然后～荧荧不同的V-β成～荧用特的上游引份异 物荧行荧增～再荧反荧中荧生的荧光信荧行荧理～可荧得号即个份数各成的据。5. 基因突荧及多荧性的究,研 美国Ibrahim等1997用FQ-PCR技荧荧正常痘病毒多荧性荧行了究。研他荧采用一荧可与正常痘病毒血凝素基因的某一DNA片段荧合的引物～并两个荧荧有荧核酸差的寡核荧酸探荧～用荧光荧荧后荧行荧荧～荧利地苷异苷把有此荧核酸差的苷异两个猴痘病毒株荧行荧定。荧技荧也可用于痘和病毒DNA疫苗的荧核酸荧多荧的究。苷异研 其他方面 　　日本Isono利用FQ-PCR荧行荧成叶体与数熟度其基因荧拷荧荧荧系的研究。他荧以核基因Cab作荧内参叶体照～荧行荧荧基因rbc1拷荧荧定～荧数果荧荧子出荧以后～荧基因拷荧荧叶叶体数叶体著增加～荧而把荧荧的基因拷荧数与叶体来增加光荧荧的荧成熟荧程荧系起荧。1998年美国Higgins等荧建立起一套用荧光探荧荧荧鼠疫荧溶荧原激活基因;pla,的荧荧方法。