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124例耐多药结核分枝杆菌基因突变特征分析

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124例耐多药结核分枝杆菌基因突变特征分析124例耐多药结核分枝杆菌基因突变特征分析 梁亚萍11 赵丽丽 2 高漫1 摘要:目的对临床分离的耐多药结核分枝杆菌相关基因的突变特征进行分析。方法对124例耐多药结核分枝杆菌和50株敏感株的耐药相关基因(异烟肼inhA、 katG和oxyR-ahpC间隔区;利福平rpoB )进行序列测定,分析其基因突变情况。结果异烟肼耐药inhA基因突变率为14.5%;katG基因突变率为70.2%(87/124),主要位于315位;oxyR-ahpC间隔区突变率为15.3% ;inhA、 katG两种基因同时突变率75....

124例耐多药结核分枝杆菌基因突变特征分析
124例耐多药结核分枝杆菌基因突变特征 分析 定性数据统计分析pdf销售业绩分析模板建筑结构震害分析销售进度分析表京东商城竞争战略分析 梁亚萍11 赵丽丽 2 高漫1 摘要:目的对临床分离的耐多药结核分枝杆菌相关基因的突变特征进行分析。方法对124例耐多药结核分枝杆菌和50株敏感株的耐药相关基因(异烟肼inhA、 katG和oxyR-ahpC间隔区;利福平rpoB )进行序列测定,分析其基因突变情况。结果异烟肼耐药inhA基因突变率为14.5%;katG基因突变率为70.2%(87/124),主要位于315位;oxyR-ahpC间隔区突变率为15.3% ;inhA、 katG两种基因同时突变率75.0%,三种基因同时考虑突变率89.5%。利福平rpoB 基因突变的检出率高达95.2%,突变主要发生在531、526、516位点。结论我省耐多药菌异烟肼耐药相关基因最常见突变为katG 315、inhA C-T(-15)、axyR-ahpC间隔区(-10) C-T,利福平为rpoB531、526、516。结合MDR-TB耐药相关基因的特征分析,可以建立一种快速、准确、特异的适合于我省的检测结核耐多药性的新方法。 关键词:结核分枝杆菌耐多药基因测序突变 Analysis of characteristics of genetic mutation of 124 cases of multidrug-resistant mycobacterium tuberculosis Liang Yaping11Zhao Lili2Gao Man1 [Abstract]Objective:To analyze the mutation characteristics of multidrug-resistant mycobacterium tuberculosis related genes.Method:Resistant genes of 124 cases of multidrug-resistant mycobacterium tuberculosis and 50 sensitive strains (inhA,katG and oxyR-ahpC spacer of isoniazid;rpoB of rifampicin)were given sequence determination to analyze the gene mutation.Results:Gene mutation rate of inhA was 14.5%; gene mutation rate of KatG was 70.2% (87/124),mainly in the 315;gene mutation rate of oxyR-ahpC spacer was 15.3%;mutation rate of inhA, katG at the same time was 75.0%,mutation rate of the three genes at the same time was 89.5%.Gene mutation rate of rpoB of rifampicin was 95.2%,and mutation occurred mainly in the 531,526,516 sites.Conclusion:The most common mutation of multidrug-resistant isoniazid genes in our province were katG 315, inhA C-T (-15),oxyR-ahpC spacer (-10) C-T,and the rifampicin were rpoB531,526,516.The analysis of combining the feature of MDR-TB resistance related gene can establish a rapid, accurate, specific and suitable new method to detect multidrug-resistant tuberculosis. Key words: Mycobacterium tuberculosis ;Multidrug-resistant;Gene sequencing;Mutation 【中图分类号】:R52 【文献标识码】:【文章编号】: 我国的耐药结核病流行情况较为严重,是全球27个耐药结核高负担国家之一,据全国结核病耐药基线调查结果显示[1]:我国肺结核病患者中耐多药结核(MDR-TB,指结核分枝杆菌同时对异 1基金项目:陕西省卫生科研项目(No.2014D9) 作者简介:梁亚萍,女,本科,副主任检验师,主要从事结核病实验室诊断相关工作 烟肼、利福平耐药)耐药率为8.32%。我省是结核病的重灾区,耐多药率高达10.2%[2],MDR-TB 的增多严重影响了结核病的化疗效果,使患者治疗费用高治愈率低,死亡率高,已成为我省结核病控制的难题。结核分枝杆菌耐药通常与某些基因突变有关,但不同地区的耐药相关基因突变特征有所不同。本研究对我院来自我省各地的结核患者124株耐多药结核分支杆菌进行了耐多药相关基因测序,异烟肼耐药相关基因inhA、katG和axyR-ahpC,利福平耐药基因ropB,分析我省耐多药基因的突变特征,从而建立一种快速、准确、特异的适合于我省的检测结核耐多药的新方法。 1 材料和方法 1.1 标本来源:本研究菌株是收集本院2014年8月-2015年2月来自于我省陕北、陕南以及关中结核患者的174株结核分枝杆菌临床分离株,其中124株耐多药菌株和50株敏感菌株。 1.2 药敏试验:采用美国BD公司的BACTEC MGIT 960行利福平、异烟肼快速药敏实验,药物浓度及操作过程严格按照MGIT TM Procedure Manual要求进行[3]。 1.3 DNA 模板 个人简介word模板免费下载关于员工迟到处罚通告模板康奈尔office模板下载康奈尔 笔记本 模板 下载软件方案模板免费下载 的制备:采用CTAB法[4]提取结核分枝杆菌DNA。 1.4 P CR扩增及序列测定:聚合酶链反应(PCR)引物序列见表1,采用50ul反应体系。反应参数:95℃预变性5min;95℃变性40s,64℃退火40s,72℃延伸1min,35个循环,然后72℃延伸7min。PCR扩增产物经1.5%琼脂糖电泳后送北京擎科生物技术有限公司测序。 表1.PCR反应引物及目标片段位置 基因引物名称引物序列(5’-3’)位置片段大小(bp) inhA inh A-F TGC CCA GAA AGG GAT CCG TCA TC 1673278~1673732 455 inh A-R A TC AGG AA T GCG TCC GCG GA katG katG-F AAC GAC GTC GAA ACA GCG GC 2154886~2155340 455 kat G-R GCG AAC TCG TCG GCC AA T TC oxyR-ahpC oxyR-ahpC-F GAG ACC GGC TTC CGA CCA CC 2725943~2726235 293 oxyR-ahpC-R GCT GGT AGG CGG GGA A TT GAT rpoB rpoB-F CTT GCA CGA GGG TCA GAC CA 760829~761371 543 r poB-R A TC TCG TCG CTA ACC ACG CC 1.5 PCR序列分析:以H37RV作阴性对照,使用个性化perl脚本对序列结果进行对比分析。 2 结果 2.1异烟肼主要耐药相关基因突变分析异烟肼耐药机制较为复杂,对异烟肼耐药相关基因inhA、katG和oxyR-ahpC间隔区检测后显示,在124株耐多药菌株中18株inhA基因突变,主要发生在启动子区,其中12株发生 C-T(-15)突变,4株发生 T-C (-8) 突变和2株其他区突变,这些菌中还有12株联合 katG突变;87株发生了 katG基因突变,均为单个点突变,其中82 株为 katG315突变,5株联合了oxyR-ahpC间隔区的突变;19株 axyR-ahpC间隔区发生的突变,主要发生在(-10) C-T有6株,还有一些其他突变,5株联合 katG突变。 2.2 利福平主要耐药相关基因突变分析利福平耐药分子机制比较明确,主要由rpoB 基因突变引起,本实验扩增了543bp相关片段,包含了81bp耐药决定区,即密码子507-533区。124株耐多药菌中,118株发生了rpoB 基因突变,其中99株为点突变,19株联合突变,这些突变位点主要位于利福平耐药决定区,最多的是531位点突变62株,其次526位突变29株,516位点为14株。另外50株敏感菌在异烟肼、利福平扩增区未检出突变。 3 讨论 利福平、异烟肼是抗结核一线主要药物,在结核病的治疗中起着重要作用,MDR-TB是当今结核病化疗失败的重要因素之一,并被广泛重视,耐多药结核病的控制关键在于早期选择敏感药物联合治疗[5]。目前用BACTEC MGIT 960检测结核菌药物敏感性,前提是培养阳性才能进行药敏实验,总共需花费23天左右时间[6],临床医生对于没有药敏结果的这种病例,只能通过经验用药,难以满足临床需要,所以一种快速、简便的耐多药检测方法对于病人的及时有效的治疗极为重要。已有研究表明[7-9],利福平和异烟肼耐药性的产生主要与rpo B、kat G、inh A基因的突变有关,但由于结核分枝杆菌在生长过程中受到各种因素的影响,在不同地区其突变类型和频率还是存在差异性。研究我省主要基因突变发生的特征,可为今后建立敏感、快速和特异的耐药诊断技术提供理论基础。 其中异烟肼耐药机制相对较为复杂,本次研究对异烟肼耐药相关基因inhA、 katG和 oxyR-ahpC间隔区的分子特征进行分析,结果显示:124例耐多药菌中inhA基因突变的检出率为14.5%(18/124);katG基因突变率为70.2%(87/124),而且katG基因突变高度集中,主要位于315位点,占katG基因突变的94.2%(82/87),315位点密码子由AGC突变成ACC,丝氨酸变为苏氨酸,;oxyR-ahpC间隔区突变率为15.3%(19/124)。inhA、 katG两种基因突变同时检出率75.0%(93/124),三种基因检出率86.3%(107/124),这与中国疾病预防控制中心传染病预防控制所国家重点实验室报道基本一致[10]。 利福平耐药主要由rpoB 基因突变引起,本院124例利福平耐药的菌株中,118株发生突变, rpoB 基因突变的检出率高达95.2%(118/124)。118例耐药菌中,突变主要发生在 rpoB 531检出率52.5%(62/118),531位密码子由TCG突变为TTG,丝氨酸变为亮氨酸;rpoB 526检出率 24.6% ( 29/118 );rpoB 516 检出率11.9%(14/118)位点,rpoB531、526、516占全部rpoB基因突变的89.0%(105/118),这与陈燕、Yuan X及国外学者报道一致[11-13], 说明 关于失联党员情况说明岗位说明总经理岗位说明书会计岗位说明书行政主管岗位说明书 通过检测rpoB基因突 变来检测利福平结核分枝杆菌耐药的可靠性很高,另外还有6株未检测出rpoB突变的耐药菌,可能是其他基因突变引起。 通过对我省MDR-TB耐药相关基因的特征分析,说明异烟肼oxyR-ahpC间隔区突变在我省耐多药菌中也较常见,增加oxyR-ahpC间隔区的检测,可提高基因突变的检出率,仅考虑inhA、 katG 两个基因会对MDR-TB漏检,影响耐多药患者治疗。综上所述,对异烟肼从katG 315、inhA C-T(-15)、axyR-ahpC间隔区(-10) C-T这三个基因,利福平的rpoB531、526、516考虑建立一种快速、准确、特异的适合于我省的检测耐多药结核的分子生物学技术,对我省医疗卫生技术的进步以及结核病的控制具有积极促进作用和意义。 参考文献 [1] 中华人民共和国全国结核病耐药性基线调查报告(2007-2008)[R].北京:人民卫生出版社,2010. 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