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基因佐剂注射时相对HBV preS2S疫苗免疫作用的影响

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基因佐剂注射时相对HBV preS2S疫苗免疫作用的影响基因佐剂注射时相对HBV preS2S疫苗免疫作用的影响 基因佐剂注射时相对HBV preS2S疫苗免疫 作用的影响 陈红梅等基因佐剂注射时相对HBVpreS2S疫苗免疫作用的影响第l0期 基因佐剂注射时相对HBVpreS2S疫苗免疫作用的影响 陈红梅白雪帆黄长形李光玉(第四军医大学唐都医院感染病中心,西安710038) 中国图书分类号R392.3文献标识码A文章编号1000484X(2006)10-0895-03 [摘要】目的:HBVpreS:S基因疫苗接种不同时相应用佐剂pcDNA3.1IL-2/Fe...

基因佐剂注射时相对HBV preS2S疫苗免疫作用的影响
基因佐剂注射时相对HBV preS2S疫苗免疫作用的影响 基因佐剂注射时相对HBV preS2S疫苗免疫 作用的影响 陈红梅等基因佐剂注射时相对HBVpreS2S疫苗免疫作用的影响第l0期 基因佐剂注射时相对HBVpreS2S疫苗免疫作用的影响 陈红梅白雪帆黄长形李光玉(第四军医大学唐都医院感染病中心,西安710038) 中国图书分类号R392.3文献标识码A文章编号1000484X(2006)10-0895-03 [摘要】目的:HBVpreS:S基因疫苗接种不同时相应用佐剂pcDNA3.1IL-2/Fe,观察 其对诱导免疫反应效果的影响. 方法 快递客服问题件处理详细方法山木方法pdf计算方法pdf华与华方法下载八字理论方法下载 :采用HBVpreS2SDNA基因疫苗作为基础免疫,重组质粒pcDNA3.1IL-2/Fe 作为佐剂加强免疫,设计实验组与HBV preS:S基因疫苗同时及在注射BALB/e小鼠后第3天加用佐剂,采用O,2,4周的方 案接种,检测各次接种后抗体水平,免疫脾 细胞的杀伤活性,增殖活性和细胞因子分泌水平.结果:HBVpreS:S注射3天后应用 佐剂的免疫小鼠,其抗体滴度,免疫脾细 胞杀伤活性,增殖活性和Th1型细胞因子分泌水平均比同时免疫组,单独应用 HBVpreS:S组及空载体对照组明显增强.结 论:预先接种疫苗后加用IL-2/Fe佐剂,能明显增强疫苗免疫效应. [关键词]HBVDNA疫苗;IL一2;基因佐剂 Raisedimmuneresponses0fHBVpreS2SDNAvaccinesbyadministratinggenet- icadiuvantatdifferenttime CHENHong-Mei,BAIXue-Fan,HUANGChang— Xing,LIGuang-Yu.DepartmentofInfectiousDiseases.Tangdu Hospital,FourthMilitaryMedicalUniversity.Xan710038.China [Abstract]Objective:TostudythedifferenteffectoffusedgeneIL.2/Feadministratedatdiffer enttimeonimmuneresponses inducedbyHBVpreS2Sgeneticvaccine.Methods:BALB/cmicewereimmunizedwithpuri fiedrecombinantplasmidsat0,2,4 weeks.Twogroupsweredesigned,OnegroupwereinjectedwithpeDNA3.1S2Satfirst,then pcDNA3.11L-2/Fewasadministratedaf- terthreedays.Whiletheothergroupwereinjectedtwoplasmidsatthesametime.Wecompare dtheimmuneresponsesthroughdetee. tingtheanti— HBstiters,CTLeytotoxieitylevel,proliferationoflymphocytesandcytokineslevelssecrete dbyculturalsplenocytes.Re- suits:ThedatademonstratedthatthehumoralandeeUularimmuneresponsesinducedbypcD NA3.IIL-2/Feasadjuvantandadminis. tratedafterHBVpreS2SDNAvaccine3daysmiceweredominanthigherthanothergroups.C onclusion:Geneticadjuvantadministrated afterAgprimingcanenhanceitseffect. [Keywords]HBVDNAvaccine;IL-2;Geneticadjuvant 乙型肝炎病毒慢性感染是严重威胁人群健康的 重要疾病,迄今尚无特效治疗药物.上世纪9O年代 出现的基因治疗性疫苗,可诱导体液和细胞免疫反 应,兼具预防和治疗作用.然而DNA疫苗诱导免疫 应答的效率相对较低,体内仅能检出少量表达抗原 (尤其对大动物和人类),因此限制了其实际应用. 提高其免疫效率的方法之一即应用基因佐剂.本研 究在不同时间应用基因佐剂,旨在优化选择最佳的 应用时相. 1 材料 关于××同志的政审材料调查表环保先进个人材料国家普通话测试材料农民专业合作社注销四查四问剖析材料 与方法 1.1材料 1.1.1动物和靶细胞BALB/c小鼠15只,均为 雌性,6,8周龄,l7,21g,第四军医大学动物中心 提供.DBA/2小鼠肥大细胞瘤细胞系P815,购自第 作者简介:陈红梅(1975年一),女,医学博士,现为解放军第302医 院ll科医生; 指导教师及通讯作者:自雪帆(1951年一),男,教授,博士生导师,主 要从事流行性出血热及病毒性肝炎方面的研 究.E-mail:xtbai@fmmu.edu.cn. 四军医大学免疫教研室. 1.1.2质粒重组质粒pcDNA3.1IL-2/Fc为自行 构建…. 1.1.3试剂大提质粒试剂盒和CytoTox96Non. RadioactiveCytotoxicityAssay试剂盒(Promega公 司);抗.HBs试剂盒(华美公司);FITC标记山羊抗 鼠IgG(北京中山生物技术有限公司进口分装);IL- 2,IL4,IFN-仪检测试剂盒,重组鼠源性IL-2(晶美公 司);DMEM培养基(GIBCOBRL公司);胎牛血清 (杭州四季青生物制品公司). 1.2方法 1.2.1重组质粒的大量制备和纯化用Wizard? PlusMaxiprepsDNAPurificationSystem制备和纯化 质粒,按操作说明书进行. 1.2.2动物分组及免疫接种20只BALB/c小鼠随 机分为4组(5只/组):?注射pcDNA3.1S:S3天 后+pcDNA3.11L-2/Fc组;?同时注射pcDNA3.1S2S 和pcDNA3.11L-2/Fc组;?单独注射pcDNA3.1S2S 组;?空载体对照组.按O,2,4周免疫 方案 气瓶 现场处置方案 .pdf气瓶 现场处置方案 .doc见习基地管理方案.doc关于群访事件的化解方案建筑工地扬尘治理专项方案下载 进行免 疫.每次免疫前24小时,股四头肌注射0.25%布 比卡因100Ixl预处理;次Et在同一部位进行免疫, 注射100g/Ixl质粒. 1.2.3免疫小鼠抗体水平检测分别在初次免疫 后2,4,6周剪尾取血,离心分离血清,1:10或1:20 稀释后一70?冻存,统一检测.血清抗一HBs检测按 操作说明书进行. 1.2.4免疫小鼠脾细胞CTL杀伤功能检测小鼠 初次免疫后第7周,眼球取血后拉颈处死,按照《分 子克隆指南》制备免疫脾细胞悬液.台盼蓝染料排 斥法计数活脾细胞数目,一般每只小鼠可获1×10, 2.5×10个脾细胞.置37?,5%CO,的孵箱中培养. 1.2.4.1效,靶细胞制备?效应细胞制备:用含 5mlHBV亚单位多肽抗原,50U/rnl鼠源性rIL一 2,100U/ml青霉素,100g/ml链霉素,10%2 mmol/LL一谷氨酰胺,10%FCS的RPMI1640培养上 述免疫小鼠脾细胞5,7天,收集作为效应细胞.? 靶细胞制备:取生长良好的P815细胞,用含HBsAg 多肽的培养液在37?,5%CO培养2小时,调整细 胞浓度至1×10.ml备用. 1.2.4.2CTL活性测定用乳酸脱氢酶法,参照试 剂盒说明书操作.结果计算:特异性释放(%):(实验释 放一培养液背景释放一效应细胞自发释放一靶细胞自发释放)/(靶 细胞最大释放一体积校正释放一靶细胞自发释放)X100%. 1.2.5增殖试验采用M1TI,比色法检测细胞增殖 反应:?将各组DNA免疫鼠获得的脾细胞,分别取 10,10个脾细胞(100Ix1)/孔接种于96孔板;? 各孔内按2.0,0.4,0.1或0g/ml浓度加入重组 HBVS多肽,每一浓度设3,4个复孔,同时设只加 培养液的空白对照孔;?湿润,37?,5%CO培养4 天;?各孔加入MTr(5~g/m1)20Ixl;?湿润,37?, 5%CO,孵育4小时;?1000r/rain离心5分钟,小心 弃孔内培养液;?每孔加入150DMSO,震荡10分 钟,使结晶充分溶解;9onm比色,以空白孔调零. 1.2.6ELISA取4×10个脾细胞接种于24孔板 内.各孔培养液含2g/ml重组HBVS多肽,1ml RPMI1640(含5%FBS).湿润,37?,5%CO2培养 72小时后收集上清.试剂盒检测上清中各细胞因 子含量,按说明书操作.结果判断:?每一 标准 excel标准偏差excel标准偏差函数exl标准差函数国标检验抽样标准表免费下载红头文件格式标准下载 品和 标本的A值应减去零孔的A值.?绘制标准曲线: 标准曲线使用以下浓度:1000,500,250,125,62.5, 31.25,15.625和0pg/ml.按标准曲线计算细胞因 子含量. 1.3数据 分析 定性数据统计分析pdf销售业绩分析模板建筑结构震害分析销售进度分析表京东商城竞争战略分析 各组采用SPSS10.0统计软件进 行分析. 中国免疫学杂志2006年第22卷 初次免疫后第2周,各实验组抗体滴度即不同程度 升高,随免疫次数增加,抗体滴度逐渐增加.通过t 检验分析,注射pcDNA3.1s2S3天后+pcD— NA3.1IL2/Fc组与其他各组比较,抗体滴度明显提 高(P<0.05). 2.2免疫小鼠CTL杀伤活性见图2.小鼠免疫3 次后获脾细胞,用HBVS抗原多肽刺激后制成效应 细胞,检测其杀伤活性.通过SPSS10.0的t检验分 析表明,注射pcDNA3.1s2S3天后+pcDNA3.1IL一 2/Fc组CTL杀伤活性比其他各组比较有明显提高 (P<0.05),且效:靶比为20:1时杀伤活性较高 (56.27%). 2.3免疫小鼠脾细胞增殖活性分析见图3.小 鼠免疫3次后,取脾细胞用重组HBVS蛋白多肽 (4种浓度)刺激,注射pcDNA3.1SS3天后+pcD— NA3.1IL-2/Fc组特异性淋巴细胞增殖明显提高 (P<0.05). 2.4免疫小鼠细胞因子分泌水平检测小鼠经3 I_1 4th?eek 6th?cek iJ__—— .厂盯i,厂IL.2/FcS2S+IL.2,FcS2SBlank afterS2Splasmid 小鼠抗-耶s抗体滴度(平均值) 1Mellnfitersofanti.HBsAb 60 50 40 30 20 l0 0 图2效:靶比为20:1.10:1,5:1.Z5:1时的Cn杀伤活性(%) 2结果Fi昏2cyt0toxicityassayresIlltsatE:Tcellratiosof20:1. 2.1免疫小鼠血清抗.HBs抗体滴度检测见图1.10:,5:and2?5:respe.y(%) 98765432?0 000000000 (v)s耸=-llI磊J0sJlllI器一,f晦(0/0)1巴JI】参荟llolu 陈红梅等基因佐剂注射时相对HBVpmS2S疫苗免疫作用的影响第lO期 IL一2/FcS2S+S2S aftel"S2SIL一2/Fc 图3小鼠脾细胞的增殖活性 Fig.3Proliferationabilityofsplenocytes Blank plasmid 表1免疫小鼠脾细胞培养上清中细胞因子含量 Tab.1CytoI【ineslevelsinsupernatantsofc~turespleno- cytesfromtheimmunizedmice 次免疫后,取免疫脾细胞,用含5g/ml的重组HBV S抗原多肽刺激,检测各组细胞因子分泌水平.注 射pcDNA3.1S2S3天后+pcDNA3.1IL?2/Fc组以分 泌IFN.和IL.2,I'hl型细胞因子为主,且分泌水平 比其他组明显升高,Th2型细胞因子(IL4)分泌水 平较低. 3讨论 研究表明,HBV膜蛋白55氨基酸的preS2区有 强免疫原性,含T和B细胞表位,相应抗体能对 HBV感染提供保护作用.但多数情况下,在人 类仅能激发弱的免疫应答.重组表达preS2与 天然病毒preS蛋白糖基化的不同可能是原因之 一 【6] ,但也可能是preS2区难以被免疫细胞接近,故 难以激发强的抗体反应.后者的原理是:观察到人 血清白蛋白特异结合于HBVpreS序列,这可能掩盖 了B细胞识别的表位'.由于只有多聚人血清白 蛋白和非人灵长类血清蛋白结合于preS2J,这种 表位掩盖可能解释在鼠有强的抗.preS2抗体而在人 没有.为克服此局限性,韩国研究者Park等设计 了单个氨基酸替代preS2区,这种变异preS2序列, 失去与人血清白蛋白结合特性但仍保持其原有的强 免疫原性,使之在人类也可能诱发强的抗.preS2抗 体反应. 本研究应用含HBVpreSS的DNA疫苗作为基 础免疫,引入preS2基因区增强免疫原性.从初次 免疫后2周开始,各实验组小鼠均出现高比率的抗 体阳转,且随着免疫次数增加,抗体滴度亦增加. 我们构建了含IL.2/Fc的真核表达载体,注人 体内可增强HBVpreSS基因疫苗的免疫效果.鉴 于注射Ag.细胞因子的时间选择是决定细胞因子生 物学效应的重要参数,本实验将HBVpreSS基因疫 苗同时或在注射后第3天加用pcDNA3.1IL.2/Fc质 粒佐剂.结果显示:同时应用时,其抗体滴度,CTL 杀伤活性,脾细胞增殖反应及细胞因子分泌水平,均 比后者明显减弱.IL.2/Ig具有长半衰期,使得有可 能维持持续的细胞因子治疗水平.融合质粒提供了 一 种更简单经济的方法应用细胞因子,且全身毒性 较小. 细胞因子作为基因疫苗佐剂,可能与其影响免 疫应答类型有关,而预先接种抗原后加用IL.2/Fc 佐剂可能诱导免疫应答级联放大.但确切机理当有 待进一步研究. 4参考文献 l陈红梅,白雪帆,黄长形eta1.IL-2/Fc融合基因真核表达载体的 构建和表达[J].医学研究生,2004;17(1):l2一l4. 2MilichDR,McLachlanA,ChisariFVeta1.Immuneresponseto thepre—S(1)regionofthehepatitisBsurfaceantigen(HBsAg):a preS(1)specificTcellresponsecallbypassnonrespensivenesstothe pre—S(2)andSregionsofHBsAg[J].JImmunol,1986;137:3l5— 322. 3CuppsTR.TibblesJ.HumiWMeta1.InvitroTcellimmunere- spensestothepreS2antigenofthehepatitisBvirusenvelopeprotein inpreS2+Svaccinerecipients.Absenceofcross—reactivityofsub— typesatamajorTcellrecognitionsite[J].JImmunol,1993;15l (6):3353-3360. 4BucherB.FrancioliP.GeudelinBeto2.Immunogenicityofarecom— binantpreS2一containinghepatitisBvirusvaccine[J].EurJClinMi— cribiolInfectDis,1994;l3:212-217. 5PillotJ,PoynardT,EliasAeta1.WeakimmunogenicityofthepreS2 sequenceandlackofcircumventingeffectontheunresponsivenessto thehepatitisBvirusvaccine[J].Vaccine,1995;l3:289?294. 6SchmittS,GlebeD,AlvingKeta1.AnalysisofthepreS2N—and0一 giycansoftheMsurfaceproteinfromhumanhepatitisBvirus[J].J BiolChem.1999;274:11945-11957. 7SobottaD.SominskayaI.JansonsJeta1.Mappingofimmunodomi— nantB-cellepitopesandthehuman8~rumalbumin—bindingsitein naturalhepatitisBvirussurfaceantigenofdefinedgenosubtype[J]. JGenVirol,2000;81:369-378. 8MachidaA.KishimotoS,OhnumaHet.Apolypeptidecontaining55 aminoacidresiduescodedbythepre-SregionofhepatitisBvirusde— oxyribonucleotideacidbearsthereceDtorofpolymerizedhumanaswellas chimpanzeealbumins[J].Gastroenterology,1984;86:910-918. 9ParkJH,LeeMK,KimHSeta1.Targeteddestructionofthepoly- merizedhumanserumalbuminbindingsitewithinthepreS2regionof theHBVsurfaceantigenwhileretainingfullimmunogenicityforthis epitope[J].JViralHepat,2003;10(1):70-79. [收稿2005-05.18修回2005—12—12] (编辑许四平) 如如如巧0 0000000000 lII,_:C
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