cAMP应答元件结合蛋白在左旋多巴诱发异动症大鼠发病机制中的作用

cAMP应答元件结合蛋白在左旋多巴诱发异动症大鼠发病机制中的作用 cAMP应答元件结合蛋白在左旋多巴诱发 异动症大鼠发病机制中的作用 中西医结合心脑血管病杂志2006年4月第4卷第4期?313? cAMP应答元件结合蛋白在左旋多巴诱发异动症 大鼠发病机制中的作用 孙斌,陈广新,张瑛玉,苏崇一,司毅 摘要:目的探讨纹状体内注射转录 调控因子应答元件结合蛋白 (c舳)基因对左旋多巴诱发异动症 (LID)帕金森病大鼠前强啡肽原基因 表达的影响.方法6一羟基多巴胺 (6—0}?)A)立体定位注射制备偏侧 帕金森病大鼠模型,左旋多巴腹腔注 射治疗4周诱发LlD大鼠模型.向 各大鼠模型纹状体内分别注射1肚L 的反义,正义?,进行异常不自主 运动(AIM)功能评分,并采用原位杂 交方法观察大鼠纹状体内前强啡肽原 基因的变化.结果正常大鼠纹状体 内注射反叉CREB后前强啡肽原mRNA 水平明显增加(P<O.O1),LID大鼠 给予正义,反叉a也B治疗后,AIM 评分与前强啡肽原mRNA水平均无 明显变化(P>0.05).结论在LID 大鼠中,CREB失去了正常的前强啡 肽原mRNA调控功能.是发生LID的 关键因素之一. 关键词:左旋多巴诱发异动症;帕金森 病;反义寡核苷酸;前强啡肽原 EffectofAntisenseCREBontheExpressionofProdynor- phinGeneinRatswithLevodopaInducedDyskinesis SmiBing,ChenGuangxing,ZhangYingyu,etal//TheThirdPeople'SHospi— talofZiboCity,Shandong(Zibo255029) At:0bjecti,JeToexploretheeffectsofanfisense,sensere印.nsed~ent—bind— ingprotein(CREB)ontheexpressionofprodynorphin(PDyn)geneinstriatal neuronsoflevodopa—induceddyskinesias(LID)ratswithParkinsondisease fPD).MethodsPDratswereestablishedby6—0}II=IAmicroinjectionstereo- taxically.TheyweretreatedwithchronicintermittentLevodopaceliacinjec— tionfor28daystogettheLIDrats.Antisense.senseCI也B(1I~L)werein— iectedintostriatumofallrats.Hybridizationinsituwasusedtomeasurethe changesintheexpressionsofPDynmRNAinstriatumandbehaviorchanges wereobserved.ResultsThelevelofPDynmRNAincreasedsignificantlyafter administrationofantisenseCREBincontrolrats(P<0.01).AIMscorend levelofPDynmRNAhadnochangedafteradministrationofsenseandanti— senseCREBinLIDrats,ConclusionCREB,whichregulatethea迎Bthe expressionofPDynmRNAincontrolrats.hadnoeffectonthelevelofPDyn mRNAinLIDrats. Keywords:levodopainduceddyskinesias;parkinsondisease;Antisenseoligonu— cleotide;prodynorphin 中图分类号:R392.5R286.5文献标识码:A文章编号:16721349(2006)03—0313—03 左旋多巴是目前治疗帕金森病(PD)最有效的药物,但是长为5'T(脚AT(AG1? ACCG(订?一3',正义CREB序列 期治疗会出现一些严重的并发症,其中最突出的为异动症(1ev为5'一 CACCf3GTGACTAGATGACcA一3',所有寡核苷酸序列 odopa—induceddyskinesias.LID),严重影响了PD病人的日常生均进行两端硫代修 饰,溶于无菌PBS内配制成浓度为2.5mM. 活.近年来研究结果表明,LID的发生与基底核纹状体内丫一氨前强啡肽原探针序列为5'一CATr(;ATc0盯AAAL]vr一3'. 基丁酸(丫一aminobutyricacid,GABA)神经元发出的直接通路与1.2大鼠模型制备成年sD大鼠,雌雄不限,重量180g, 间接通路的失衡有密切关系.长期的左旋多巴治疗可能改变了250g,山东大学实验动物中心提供.6一OHDA脑内立体定向 纹状体GABA神经元内基因转录调控机制,从而导致两条通路注射术制作偏侧PD大鼠模型.将6,OI-IDA分两点分别注入 的改变…I.强啡肽是纹状体直接通路内的特异性神经递质,而左侧腹侧被盖部和黑质致密部,每点10,坐标为:?前囟后 前强啡肽原(prodynorphin,PDy11)是其前体物质,脚mRNA4.8rllrn,中线旁1.2rllrn,颅骨表面下8.2mm;?前囟后4.8 水平被认为是衡量直接通路活性的标志.LID时直接通路活rnlrl,中线旁2.0mm,颅骨表面下8.0mm.2周后进行行为学 化,PDynmRNA水平增高It?2_,cAMP应答元件结合蛋白(the观察:腹腔注射阿朴吗啡O.5mg/kg, 记录 混凝土 养护记录下载土方回填监理旁站记录免费下载集备记录下载集备记录下载集备记录下载 1h内大鼠旋转总圈 cyclicAMPresponse—dementbindingpmtein,CREB)为PDy11数,每小时大于100圈即为PD模型制作成功.取PD模型鼠, mRNA表达的关键调控因子,它在LID形成机制中的作用仍未予以左旋多巴/苄丝肼治疗(10mg/mL左旋多巴和2.5mg/mL 完全阐明.为此,本实验应用反义CREB来阻断CREB的表达苄丝肼溶于含O.05%乙醇和0.1%抗坏血酸的消毒生理盐水 后,观察脚mRNA的表达变化,进一步研究LID的发生机中),左旋多巴注射剂量为每天20mg&g,每日2次进行腹腔注 制.射,持续4周.在治疗过程中,进行行为学观察,每周2次.根 1材料与方法 1.1主要试剂6一羟基多巴胺(6一OHDA),阿朴吗啡,左旋 多巴甲酯,苄丝肼均购自Sigma公司;正义,反义寡核苷酸 CREB,前强啡肽原探针由上海生工公司合成.反义CREB序列 据Lee报道的LID大鼠评分方法,在注射药物后每35min 进行评分,持续140min,4次评分之和为最终得分.治疗结束 后行为学评分总计?20分者为典型的LID模型鼠. 1.3动物分组及处理大鼠共分为6组:对照组(纹状体内注 ? 314?CI-tINFSEjOURNALOF"INTE(;RATIVEMEDICINEONCARDIO一 /CEREBROVASCULARDISEASEAprll2006Vo1.4No.4 射PBS),对照加反义C脚组(纹状体内注射反义?),对 照加正义CREB组(纹状体内注射正义CREB),LID组(纹状体 内注射PBS),LID加反义CREB组,LID加正义CREB组,前3 组为正常大鼠,后3组为LID大鼠,均为随机分组.慢性左旋 多巴治疗28d后向各组大鼠纹状体内分别注射反义,正义 CREB,剂量为1L,注射时问在2min以上,并留针2min.纹 状体坐标:前囟前0.5rnnl,中线旁开3.5rnnl,硬膜下4.61Tffn. 12h后再腹腔注射左旋多巴,进行行为学评分. 1.4原位杂交最后一次左旋多巴注射3h后,大鼠腹腔注射 10%水合氯醛,立即开胸,经左心室灌注生理盐水100mL洗去 全身血液,继之灌注含4%多聚甲醛的0.1tool/LPB500mL, 固定90min,取全脑做冠状冰冻切片,片厚30/an,挑选反义寡 核苷酸注射点周围的脑区切片经多次固定漂洗后准备杂交.放 入脑片,地高辛标记的PDynmRNA探针杂交20h.经漂洗,平 衡等步骤,加入碱性磷酸酶标记的抗地高辛抗体Fab段 (1:500),室温2h,再经漂洗,平衡,于NBT和BCIP显色液中室 温下避光显色6h,贴片后在光镜下观察并拍照.凡发现纹状体 区有明显出血者均不计入统计中. 1.5图像分析与统计学处理用HPIAS一1000高清晰彩色病 理图像分析系统进行图像分析,所有切片均采用同一放大倍数 (×200),同一光强度下进行,经灰度调节后按设定程序自动测 出阳性反应细胞平均光密度值.PDynmRNA的光密度值与大 鼠行为学评分用均数? 标准 excel标准偏差excel标准偏差函数exl标准差函数国标检验抽样标准表免费下载红头文件格式标准下载 差(i?S)表示,大鼠反义CREB治 疗前后的行为学评分变化及健侧与毁损侧的光密度值比较应用 配对资料的,检验,组问差异的显着性用单因素方差分析进行 检验,两两比较用'『检验法. 2结果 2.1行为学检查治疗前后LID加反义CREB组评分分别为 (4O.5?1O.0)分,(43.2?11.8)分;LID加正义CI也B组为 (42.0?12+0)分,(46.4?13.1)分,比较均无统计学意义 (P>0.05). 2.2反义CREB治疗后正常大鼠纹状体内PDynmRNA表达 水平的变化原位杂交结果显示,对照组大鼠PDynmRNA杂 交反应物呈棕色颗粒状沉积于神经元核周围胞浆内,阳性染色 神经元主要分布在腹外侧纹状体,且分布不均匀,而内侧和背侧 纹状体分布相对较少.对照加反义CREB组大鼠损毁侧腹外侧 纹状体阳性染色神经元明显减少,着色变浅,PDynmRNA的表 达水平低于健侧(P<0.01).对照组,对照加正义CREB组大 鼠双侧PDynmRNA表达水平无明显变化(P>0.05). 表1反义CREB治疗后正常大鼠纹状体内 脚n~RNA表达水平的变化(j?5) 与健侧比较,1)尸<0.Ol 2.3反义CREB治疗后LID大鼠纹状体内PDynmRNA表达 水平的变化LID组大鼠损毁侧腹外侧纹状体阳性染色神经元 明显增加,着色加深,PDyT1mRNA的表达水平高于健侧 ,毁损侧 (P<0.01).LID大鼠经反义,正义CREB治疗后 PDynrnRNA表达水平无明显变化,仍高于健侧(P<0.01). 表2反义CREB治疗后LID大鼠纹状体内 脚mRNA表达水平的变化(i?) 组别鼠数毁损侧健侧 与健侧比较,1)P<0.Ol 3讨论 6一OHDA毁损偏侧PD大鼠模型已被广泛用于PD发病机 制的研究,慢性左旋多巴治疗诱导PD大鼠出现的异常不自主 行为与灵长类的LID具有许多重要的相似性,可作为LID的啮 齿类模型L4j.因此本研究用出现异常不自主行为的PD大鼠模 型来研究PD病人LID发生的可能机制. 纹状体内95%为GABA神经元,它包括纹状体黑质神经元 和纹状体苍白球神经元.前者发出纤维投射至黑质网状部与苍 白球内侧部,构成直接通路.后者发出纤维投射至苍白球外侧 部和丘脑底核,构成间接通路.两条通路的平衡对维持纹状体 的正常功能至关重要. 正常情况下,CREB中特定的丝氨酸和(或)苏氨酸残基被 磷酸化后形成同源二聚体.与DNA上的应答元件(cRE) 结合,从而激活受CRE调控的基因转录.Pi~,n基因启动子内 含有CRE位点,因而CREB可以调节pi~,nmRNA的表达.本 研究表明,在正常大鼠,反义CREB减少了PDynmRNA的表 达,而应用反义CREB后对LID大鼠的症状,强啡肽基因的表 达并无明显影响.这提示正常动物纹状体内的基因调控机制可 能并不适用于去多巴胺支配后的纹状体,LID大鼠中aB的 作用已发生了改变. cREB作用改变的原因目前仍不清楚.FosB蛋白可能与此 有关.FosB属于即刻早期基因Fos家族中的一员.编码CREB 蛋白(FosB与?FosB).FasB蛋白与JunD结合形成二聚体 , AP一1,后者与PDyn基因中的AP一1位点及CRE位点结合从而调节PDynmRNA的表达l4j.在正常大鼠纹状体内,FosB 样蛋白表达水平很低.LID时FosB蛋白表达则明显增加,并与 PDynmRNA水平的增高密切相关l5J.大量研究证实F础样 蛋白在慢性刺激引起的长期神经元和行为学可塑性变化中发挥 重要作用l6l7_,LID大鼠的纹状体GABA神经元的可塑性发生 了明显变化【,引.而且二聚体AP一1的半衰期要比磷酸化的 CREB长得多,在慢性左旋多巴治疗期间和停药后的很长一段 时间都维持高水平存在.因此推测在慢性左旋多巴治疗的PD 大鼠纹状体内,由于B蛋白增多,AP一1水平增高,后者可以 与CREB竞争性结合CRE位点.因此AP一1可以绕过CREB 直接调控PDyn基因的转录,从而导致PDynmRNA的异常增 高,进而引起直接通路的活化.这需要今后进一步研究证实. 正常大鼠纹状体内主要由CREB来调节PDynmRNA的表 达.慢性左旋多巴刺激下CREB失去了对PDynmRNA的调 拄,引起纹状体内神经元基因转录调控机制的改变, PDynmRNA水平增高,直接通路活化.但是引起基因转录调 控机制非常复杂,PD大鼠纹状体内的去多巴胺支配导致了基因 表达,功能及多巴胺受体与谷氨酸受体磷酸化状态都有不同程 中西医结合心脑血管病杂志2006年4月第4卷第4期?315? 度的改变.这些都是神经元细胞信号传导发生变化的关键.他 们在LID形成机制中的作用如何,均需进行更深入的研究. 参考文献: ]BrotchieJM,LeeJ,VmderovaK.Levodopa—induceddyskinesiain Parkinmn'sdisea~[J].JNeuralTransm.2005,112:359391. [2]徐岩.孙圣刚,曹学兵.左旋多巴诱发异动瘫夫鼠模型纹状体神经 元可塑性的研究[J].中国神经科学杂志,2004,20:252--256. 13jLeeCS,CeneiMA,Schu~erM,eta1.Embryonicventramesen cephalicgraftsimprovelevodopa—induceddyskinesiainaratmodelof Parkinson'sdisea~[J】.Brain,2000,23:1365—1379. 【4JLundbladM.AndeRsonM,WinklerC,eta1.Pharmaeologiealvailda tionofbehaviouralmeasuresofakineaiaanddyskineaiainaratmodelof Parkimon'sdisease[JJ.EurJNeurmci,2002,15(1):120132. 15JAnder,~'-onM,WestinJE,CenciMA.TimecourseofstriatalDelta RB—likeimmunoreactivityandprodynorphinmRNAlevelsafterdis continuationofchronicdopaminomimetietreatmentlJJ.EurJNeu- roscl,2003,17:661—666. 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(收稿日期:2006一O1—19) (本义编辑王雅沽) 脑心通胶囊对拟血管性痴呆大鼠学习 记忆及抗氧化作用的影响 何明大,刘石梅,苏南湘 摘要:目的研究脑心通胶囊 对拟血管性痴呆(VD)大鼠的 学习记忆行为及超氧化物歧化 酶(S()D)活性,丙二醛(MI)A) 含量的影响.方法选用纯系 vD大鼠采用大脑中动脉梗死 (M('AO)法制成?)大鼠模型 后随机分为脑心通组(中药 组),西药组,模型组,另设假手 术组和正常组,共治疗28d.治 疗后以Morris水迷宫实验检 测其学习记忆行为能力,并检 测脑内)活性,MDA含量. 结果与模型组比较,中药组 和西药组均能提高Morris水 ,降 迷宫成绩,提高SOD活力 低MDA含量.反映中药组具 有抗自由基损伤作用;与正常 组相比,模型组脑组织的SOD 活性显着下降,MDA含量显着 增加,反映了自由-基损伤明显, 抗自由基损伤能力下降.结论 脑心通胶囊可提高自由基清 除酶的活力,减轻自由基损伤. 关键词:脑心通胶囊;血管性痴 呆;记忆障碍;超氧化物歧化 酶;大鼠 TherapeuticEffectsofNaoxintongCapsuleonRatModelwith VascularDementia HeMingda,LiuShimei,SuNanxiang//SecondXiangyaHospital,CentralSouth University(Changsha410011) Abstract:ObjectiveTostudytheeffectsofNaoxintongcapsuleonbehaviorandhip— pocampalhistomorphologyinratswithvasculardementia.MethodsThevascular dementiamodelwasestablishedbyocclusionofthemiddlecerebralarteryinrats. Thefacultyoflearningandmemorywasevaluatedbystep—downavoidancetest. Thebraintissueswereremoved.Frozensectionsweremadeandstainedwithhema— toxylin—eosin(HE).Thehippocampalhistomorphologywasobservedandanalyzed bylightmicrocopy.ResultsTheresultsofstepdownavoidancetestshowedthat comparedwithsham—operatedgroup,modelgrouppresentedsignificantlythelearn— ingandmemoryimpairments.Comparedwithmodelgroup,learningandmemory improvedinNaoxintongcapsulegroupandHyderginegroup.Therewasnosignifi— cantdifferencebetweentwotherapygroups.Underthelightmicroscope,hippoeam— palCA1fieldsofratsinthesham—operatedgroupexhibitedcloselyandneatlyspaced pyramidalcells,andinsignificantneuronloss.Sparseanddisturbedpyramidalcells, noticeableneuronlossandneuralgiacellproliferationcouldbeseeninthehippocampal CA1fieldsofratsinthemodelgroup.Neuronlossreducedsignificantlyinthehip— pocampalCA1pyramidaleellfieldsintwotherapygroupandcellmorphologypre— senl:edrelativenorma1.ConclusionNaoxintongcapsulewaseffectiveforratmodel withvasc1】lardementia. Keywords:Naoxintongcapsule;vasculardementia;learningandmemory;SOD;rat 中圈分类号:R743R289.5文献标识码:A文章编号:1672—1349(2006)04—0315—03 血管性痴呆(VaSCulardernentia,?)是指各种脑血管疾病引起的脑功能障碍而产生 的获得性智能损害综合征.国外研究表