滇重楼内生细菌分离及抑制人体病原菌活性菌株筛选

滇重楼内生细菌分离及抑制人体病原菌活性菌株筛选 滇重楼内生细菌分离及抑制人体病原菌活 性菌株筛选 昆明医学院2010.(3):21—23 JournalofKunmingMedicalUniversity CN53—1049/R 滇重楼内生细菌分离及抑制人体病原菌活性菌株筛选 宣群",王芳,杨娟 (1)昆明医学院微生物学暨免疫学教研室,云南昆明650500;2)昆明医学院科学技术处,云南昆 明650500;3)思茅师范高等专科学校生命科学系,云南普洱665000) [摘要]目的分离滇重楼内生细菌,研究其抑制人体病原菌的能力.方法从 表 关于同志近三年现实表现材料材料类招标技术评分表图表与交易pdf视力表打印pdf用图表说话 pdf 面消毒的滇重楼新鲜植 株中分离内生细菌.在体外,用提取物抑制金黄色葡萄球菌,伤寒沙门菌,普通变形杆菌,痢疾杆菌,大肠杆 菌及白色念珠菌生长.结果来自温室的植株分离到更多的内生细菌,植株地下部位中内生细菌比地上部位更 多;约60%内生细菌对指示菌有一定抑制作用,其中LRB11抑菌效果较明显.结论由于内生细菌与宿主相 互作用,故具抑菌作用的内生细菌可用于新药的开发或中药植物的生防. [关键词]滇重楼;内生细菌;抑菌活性 [中图分类号]R37[文献标识码]A[文章编号]1003—4706(2010)03—0021—03 IsolationandScreeningofEndophyticBacteriawith AntimicrobialActivityfromParisPolyphyllaSmithvar. nnanensis XUANQun",WANGFang,YANGJuan. (1)Dept.ofMicrobiologyandImmunology,KunmingMedicalUniversity,KunmingYunna n650500;2) TheDivisionofScienceandTechonology,KunmingYunnan650500;3)Dept.ofLifeScience,Simao NormalCollege,PuerYunnan665000,China) [Abstract]ObjectiveToisolateendophyticbacteriafromParisPolyphyllaSmithvar.yunnanensis, investigatetheabilityoftheseisolatestoinhibitpathogenicmicrobesofhuman.MethodsEndophyticbacteria wereobtainedfromsurface— sterilizedfleshplant.Inx,itro,theextractsofendoph~iebacteriawereusedtoinhibit thegrowthofStaphylococcusaureus,Salmonellatyphi,Proteusvulgaris,Shigelladysenteriae,E.coliand Candidaalbicans.ResultsIsolatesweremorefromtheplantsculturingingreenhousethanthatinforest. Endoph~icbacteriafromundergroundtissuesweremorethanthatfromover-groundtissues.About60%isolates hadinhibitoryactivityonmicrobestested,andamongthemLRB11haddistinctinhibitoryeffect.Conclusion Owingtointeractionsbetweenendophyticbacteriaandtheirhost,theendophyticbacteriawithinhibitoryactivity maybeusedinthedevelopmentofnoveldrugsorbiologicalcontro1. [Keywords]ParisPolyphyllaSmithvat.yunnanensis;Endophyticbacteria;Antimicrobialactivity [基金项目]云南省教育厅自然科学基金资助项目(06Y043C) [作者简介]宣群(1968,),女,云南昆明市人,医学硕士,讲师,主要从事微生物资源开 发利用及医学微生物 学暨免疫教学科研工作. 昆明医学院第31卷 植物内生细菌是指生活在健康植物组织中对 植物没有实质性损害,还有利于其生长的细菌Il1. 这些微生物普遍存在于高等植物体内,定居在细 胞中,细胞间隙或维管组织中,与宿主植物形成 和谐的联合关系.由于长期生活于植物内环境 中,细菌与植物之间相互影响,使内生细菌可能 获得新的抗逆特性.自弗莱明发现青霉素至今, 抗生素主要产自土壤微生物.然而近年来,从中 分离到的新药日益减少.为了避免重复分离已知 化合物,发现能有效治疗耐药菌株感染的新药, 必须寻找新的途径以发现新型生物活性产物.内 生细菌生活在植物体内,与植物之间存在复杂的 相互关系,可能从中发现新药或前体产物[21. 滇重楼是我国传统药用植物,是名贵中药云 南白药,热毒清等的主要组成成分,临床上用于 止血,抗肿瘤,腮腺炎,扁桃腺炎,喉头炎及上 呼吸道感染,为国家基本药物【31.目前国内对滇 重楼内生细菌及其代谢产物的报道较少,而对其 内生细菌抑菌活性情况未见报道.本文研究了林 下生态模拟及温室培养的滇重楼内生细菌的分布 及其抑制人体病原细菌的活性,为内生细菌资源 的开发利用提供科学依据. 1 材料 关于××同志的政审材料调查表环保先进个人材料国家普通话测试材料农民专业合作社注销四查四问剖析材料 与方法 1.1材料 健康滇重楼植株于2007年7月采自云南武定 云南白药集团优质种源繁育基地. 1.2内生细菌分离 采样24h内分离培养内生细菌.将滇重楼植 株冲洗干净并擦干后,切成小段,用75%乙醇消 毒3,5rain,无菌水冲洗2次,0.1%升汞浸泡 O.5—1rain,无菌水冲洗3次,用无菌纸吸干表面 水分.实验组植株样品剪开边缘,置于马铃薯葡 萄糖琼脂培养基(PDA)平板上,于27?黑暗培 养7d;空白组植株样品直接置PDA平板,于相 同条件下培养.实验组植株样品周围有菌落长出 即挑取,并转入新鲜营养琼脂进行纯化培养.在 培养期间,空白组未见微生物长出. 1.3内生细菌液体培养及代谢产物提取 挑取内生细菌于营养琼脂平板上,分别于27? 和37?复苏2d,观察内生细菌最适生长温度. 取生长良好的内生细菌接种于装有250mL蛋白胨 牛肉膏液体培养基(营养琼脂配方中不加琼脂) 的三角瓶中,27?,120r/min培养3d.3000 r/rain离心20rain,分别收集发酵液和沉淀.冷 冻研磨沉淀后与发酵液合并,加入等体积乙酸乙 酯萃取40h.于70cc常压蒸馏浓缩至2mL. 1.4抑菌试验 采用滤纸片(=5mm)法测定.把指示菌金 黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus),伤寒沙门 菌(Solmonellatyphi),普通变形杆菌(Proteus vulgaris),痢疾杆菌(Shigelladysenteriae),大肠 杆菌(E.coli)和白色念珠菌(Candidaalbicans) 悬液涂布于MuellerHinton(MH)/沙保弱平板表 面.用滤纸片浸透内生细菌发酵液提取物,待溶剂 自然挥发后贴于平板上,置37?黑暗培养17h, 测量抑菌圈直径. 2结果 2.1内生细菌分离结果 共分离到l0株内生细菌.其中从温室植株中 分离到6株,林下植株中分离到4株.所分离的 菌株主要来自植株地下部分.不同生境及不同部位 分离的菌株数,见表1.与一般细菌的最适生长 温度37?相比,滇重楼内生细菌更适宜生长在 27?环境中. 表1滇重楼内生细菌分离情况(株) Tab.1TheendophyticbacteriafromP.pllyphyllaSmithvar.ymmannesis(stain) 生境不同部位分离的菌株数 根状茎根茎萼片雄蕊合计 林下 温室 合计 O 2 2 3 2 5 1 0 1 O 1 l 4 6 1O 第3期宣群,等.滇重楼内生细菌分离及抑制人体病原菌活性菌株筛选23 2.2抑菌实验结果 6株内生细菌有一定抑菌效果,占分离菌株 的60%.WJB6对各种指示菌均有一定抑制作用; LRB11对金黄色葡萄球菌,普通变形杆菌和痢疾 杆菌的较明显抑制作用,见表2. 表2滇重楼内生细菌抑制人体病原菌的情况(抑菌圈:mm) Tab.2Theantimicrobialacti~tyofendophyticbacteriafromP.polyphyilavar.yunnanensis (inhibitionzone小:ram) 3讨论 在林下生态模拟环境中,由于气温较低及多 种其他生态因子的共同影响下,细菌繁殖速率较 慢,分离到的内生细菌数量相对较少;而在温室 人为控制的条件下,环境温度恒定,种植的植物 种类单一,细菌繁殖速率较快,分离到的内生细 菌数量就相对较多.从分离部位来看,滇重楼地下 部位分离到内生细菌数明显高于地上部位,这与 李春宏等【41的研究结果一致.由于地下部位的生理 作用及生态位置直接接触土壤,细菌容易经机械 或病虫害损伤进入植物体并寄居.由于内生细菌 长期生活在植物内,逐渐适应于植物的生长环境. 滇重楼生长在海拔700,3600mm,阴冷潮湿的 山区阁,因此从中分离到的内生细菌最适生长温度 较一般细菌低. 内生细菌对其他微生物的抑制作用有利于宿 主植物抵抗不良环境,促进植物生长发育.同时, 由于内生细菌的影响,使宿主滇重楼具有或提高 了抗病原菌的特性,增强了植物的药用价值.进一 步工作将研究内生细菌产生的抑菌活性物质用于 新药或中药植株生防的潜力. [参考文献] l1JDENISEKZ,PATL,NBETHH,eta1.Isolationandch— aracterizationofendophyticcolonizingbacteriafrom agronomiccropsandprairieplants[J].Appliedand EnvironmentalMicrobiology.2002(5):2198—2208. [2]NORAZHG,NORAZIAHMZ,VIKINESWARYS,eta1. Isolationandcharacterizationofanovelendophytic streptomycesSUK06withantimicrobialactivityfrom malaysianplant[Jj.AsianJournalofPlantSciences, 2008,7(2):189—194. [3]卫生部药政管理局.国家基本药物中药分册[M].香 港:香港中国新闻出版社,1996:149. [4]李春宏,邓渊钰,赵明文,等.棉花内生细菌数量动态 及其对棉花黄,枯萎病菌的拮抗作用[J].微生物学 报,2009,49(9):1196—1202. [5]黎光南主编.云南中药志[M].昆明:云南科技出版 社(第1卷),1990,8:413—414. (2010一O1—24收稿)