特殊染色

A AgNOR染色法: 1、试剂配制: (1)AgNOR染色液: 甲液:明胶2 g 溶于双蒸水至99 ml,在60℃使之完全溶解,再加入纯甲酸1 ml 摇匀待用。乙液:硝酸银50 g 溶解于双蒸水中至100 ml,4℃冰箱保存。 (2)AgNOR工作液 取甲液10 ml,乙液20 ml 临用前混合。 2、步骤: (1)切片脱蜡至水 (2)双蒸水洗2次 (3)AgNOR 工作液中(25℃)浸染30分钟(暗处进行)(镜下观察) (4)双蒸水洗3次 (5)脱水,透明,封固 3、结果:油镜观察,细胞核及胞质背景为淡黄色,AgNOR呈棕黑色颗粒状。 B 鞭毛染色法: 1.试剂配制: 甲液:丹宁酸5克 氯化铁(FeCl3)1.5克 福尔马林(15%)2.0毫升 氢氧化钠(NaOH)1%1.0毫升 乙液:硝酸银(AgNO3)2克 蒸馏水100毫升 制备乙液时,待硝酸银溶解后,取出10毫升备用,向余下的90毫升硝酸银液中滴加浓氢氧化铵,先呈很浓厚的沉淀,再继续滴加至刚刚溶解沉淀成澄清液为止。再将备用的硝酸银溶液慢慢逐滴加入澄清液中,先呈现薄雾,但轻摇则消失,继续边滴加边摇动,待澄清液呈现略有轻微不消散的薄雾状为止。如雾重,则银盐沉淀,不宜使用。 2.染色 方法 快递客服问题件处理详细方法山木方法pdf计算方法pdf华与华方法下载八字理论方法下载 : (1)将待检菌接种在新制备的肉汤琼脂斜面上,置37°培养16—20小时,备用。 (2)在载玻片的中部相隔一厘米处,用接种环各沾一滴蒸馏水,然后用接种环挑取湿润处的菌苔少许于一端的水滴中,倾斜玻片使培养物流至另一水滴中,两水滴自然相通,菌体从上位自然扩散到下位水滴中,待干燥后染色。 (3)在干燥涂片上加甲液3—5分钟,用蒸馏水冲洗。将残水沥干或用乙液冲去残水后,加适量乙液保持30—60秒钟。染色时在酒精灯上稍加热,使染液出现蒸汽即可,用蒸馏水冲洗。 (4)镜检:菌体及鞭毛皆染成茶色。 3. 注意事项 软件开发合同注意事项软件销售合同注意事项电梯维保合同注意事项软件销售合同注意事项员工离职注意事项 : (1)染液最好随用随配,存放至次日效果则差。 (2)一定要充分洗净甲液后再加乙液,否则背景较脏。 (3)防止水及培养物沾有氯化物。 (4)切忌用接种环涂抹培养物。 (5)载玻片一定要洗净。先用洗衣粉煮沸,再水洗,干后放在洗液中,浸泡24小时,取出水洗除去残酸,沥干,存放于95%乙醇中备用。 (6)加热时最好置金属板上,使载玻片受热均匀。 β-半乳糖苷酶可以催化二糖乳糖水解为单糖:葡萄糖和半乳糖。 β-半乳糖苷酶的活性可以用X-gal(5-溴-4-氢-3-吲哚-β-D-半乳糖苷)等显色底物加以检测,β-半乳糖苷酶可将X-gal转变为不溶性的深蓝色沉淀。 X-gal可以做为组织染色剂,可以在所有表达β-半乳糖苷酶的植物和动物组织上产生颜色。 应该是可以用来病毒感染组织切片染色的。 C CAE染色步骤 1、试剂配制: (1)A液:萘酚-AS—D氯醋酸10mg溶于N,N-二甲基甲酰胺1ml中。 (2)4%副品红液:取盐酸副品红(EM级)1g,溶于蒸馏水20ml内,再加入10m1/L的HCl 5m1,稍加温以增加溶解度,过滤、贮室温下。于使用前,取等量副品红液与新鲜的4%亚硝酸钠混合,之后用淀粉碘化物试纸测试,瞬间试纸应变为蓝色才合格,如果不变色,应加入更多的亚硝酸盐。 (3)B液:o.1mol/L的Michaelis Veronal-醋酸缓冲液(PH 7.6)30ml,加入新配制的副品红液3滴,用1moI/L HCl使PH值调至6.3。 2、染色步骤: (1)将A.、B二液混合,过滤,加入氟化钠(17mg/10ml), 使之最后浓度为0.04mol/L. (2)切片置于上述溶液内孵育1h(30℃) (3)流水冲洗。 (4)苏木素复染。 (5)空气干燥后封固。 G Grimelius硝酸银反应法(嗜银反应): 1、试剂配制: 硝酸银液: 1%硝酸银水溶液3毫升蒸馏水87毫升 0.2M醋酸缓冲液(PH5.6) 10毫升 还原液: 对苯二酚1克亚硫酸钠5克蒸馏水100毫升 2、染色步骤: (1)切片脱蜡至蒸馏水 (2)60℃硝酸银液内3小时 (3)用滤纸吸去周围银液,蒸馏水速洗 (4)入45℃的还原液处理1分钟 (5)蒸馏水洗 (6)5%硫代硫酸钠处理1 分钟(可不做) (7)水洗,脱水,透明,封固 3、结果:嗜银颗粒呈棕黑色。正常时嗜银颗粒存在于神经内分泌细胞,故此法主要用于神经内分泌肿瘤的诊断。 H HID染色法1、染色步骤: (1)切片脱蜡至蒸馏水 (2)放入预热的1当量盐酸中10分钟 (3)蒸馏水洗 (4)Schiff液中染10分钟 (5)自来水洗15分钟至细胞核红色(如2~5步不做,可在染好爱先蓝后染核固红2分钟) (6)蒸馏水洗 (7)高铁二胺液18~24 小时 (8)爱先蓝液(pH2.5)染10~20分钟 (9)蒸馏水洗 (10)脱水,透明,封固 2、结果: 硫酸化酸性粘液呈棕黑色,羧基化酸性粘液(唾酸粘液)物质蓝色。硫酸化酸性粘液可见于大肠粘膜,而小肠粘膜仅出现唾酸粘液,此法多用于确定肠化的分型。 HP(硝酸银法) 1、试剂配制: (1)醋酸缓冲贮备液,PH3.6 0.2N醋酸缓冲液,PH3.6 10 ml 蒸馏水240 ml 以下各液均用此液配制 (2)1 %硝酸银液 硝酸银 1 g 醋酸缓冲贮备液,PH3.6 100 ml (3)2 %硝酸银液 硝酸银0.2 g 醋酸缓冲贮备液,PH3.6 10 ml (4)5 %明胶液 明胶 5 g 醋酸缓冲贮备液,PH3.6 100 ml 先把醋酸缓冲贮备液加温至40℃左右,然后倾入明胶,于37℃温箱内慢慢溶解,搅 拌。 (5)3 %对苯二酚液 对苯二酚0.3 g 醋酸缓冲贮备液,PH3.6 10 ml (6)明胶对苯二酚液 3 %对苯二酚液1 ml 5 %明胶液15 ml (7)显影液 明胶对苯二酚液16 ml 2 %硝酸银液 3 ml 在操作到第4步完成前5分钟充分混合,置于56℃水浴箱中保温待用。 2、操作方法: (1)组织脱蜡至蒸馏水 (2)醋酸缓冲贮备液洗2次 (3)入1 %硝酸银液中,56℃,1小时 (4)切片不水洗,直接放入预热的显影液中56℃,肉眼呈黄棕色为止。 (5)倾去显影液,于56℃的水中浸洗2分钟 (6)水洗 (7)脱水,透明,封固。 3、结果:幽门弯曲菌呈棕黑至黑色。 Highman甲醇刚果红染色法(类淀粉染色) 1、试剂配制: 甲醇刚果红染液: 刚果红0.5 g 甲醇80 ml 甘油20 ml 碱性乙醇分化液: 氢氧化钾0.2 g 80%乙醇100 ml 2、染色步骤: (1)切片脱蜡至水 (2)甲醇刚果红染液染10~20分钟 (3)用碱性乙醇分化液分化数秒 (4)水洗 (5)苏木素复染2分钟 (6)水洗 (7)脱水,透明,封固 3、结果:淀粉样物呈桔红色。 4、类淀粉染色的应用: 确定淀粉样变性及玻璃样变性的胶原组织,后者在刚果红法染色后呈淡桔色,常用于诊断甲状腺髓样癌和胰岛细胞瘤等。 L 六胺银染色法1、试剂配制: 六胺银液配制: 3%六次甲基四胺水溶液5 ml 2.5%硝酸银水溶液0.5 ml 摇晃,变清,再加2.5%四硼酸钠1.5~2 ml加蒸馏水至30~40 ml 2、步骤: (1)切片脱蜡至水,蒸馏水洗 (2)0.5%高碘酸浸15分钟,蒸馏水洗 (3)六胺银液60℃,1-2小时,(或六胺银液80-90℃,半小时左右)蒸馏水洗(镜下基底膜呈黑色) (4)0.2% 氯化金调色数秒 (5)丽春红淡染 (6)水速洗 (7)烘干,透明,封片。 3、结果:肾小球基底膜呈黑色,霉菌,弹力纤维及一些网状纤维也呈黑色。 M Mallory 三色法1、步骤 (1)切片脱蜡至水 (2)0.5%酸性复红水溶液1 min (3)蒸馏水洗 (4)入下液1-2min 苯胺蓝0.5g,桔黄G 2g,磷目酸或磷钨酸1g,蒸馏水100ml。 (5)蒸馏水洗 (6)95%乙醇分色 (7)脱水,透明,封片。 2、结果:胶原纤维蓝色,红细胞桔黄色,核红色。 M allory磷钨酸~苏木素染色法(PTAH) 1、试剂配制: 苏木素0.1 g 磷钨酸 2.0 g 蒸馏水100 ml 先将苏木素加热溶于20毫升蒸馏水,再将磷钨酸溶于80毫升蒸馏水。等苏木素冷却后,加入磷钨酸溶液,混合,放置数星期后,才可使用。如急用,可加入0.2 g高锰酸钾,加速其成熟。2、染色步骤: (1)切片脱蜡至蒸馏水。 (2)放入0.25%高锰酸钾水溶液5分钟。 (3)蒸馏水洗。 (4)2.5%草酸漂白5分钟。 (5)蒸馏水洗多次。 (6)置于磷钨酸苏木素溶液12~24小时。 (7)95%酒精快速分化,滤纸吸去剩余酒精,置60℃温箱中烘干。 (8)二甲苯透明,封固。 3、结果:纤维胶质,肌胶质,神经胶纤维,纤维素,横纹肌等均染成蓝色。胶原,网状纤维和骨基质着黄色或砖红色。在工作中常用于观察横纹以证实肿瘤细胞是否有横纹肌分化特征。 Masson 三色染色法、 1、试剂配制: 丽春红酸性品红液:丽春红0.7 g 酸性品红0.3 g 蒸馏水99ml 冰醋酸 1 ml 苯胺蓝液: 苯胺蓝 2 g 蒸馏水98 ml 醋酸 2 ml 亮绿液:亮绿0.2g 蒸馏水100 ml 冰醋酸0.2 ml 苦味酸酒精液:苦味酸在95%酒精中的饱和液20 ml,加95%酒精10 ml 2、染色步骤: (1)切片脱蜡至蒸馏水 (2)苏木素染5~10分钟 (3)盐酸酒精分化 (4)流水蓝化,蒸馏水洗(苏木素可不染) (5)丽春红酸性品红液中染5~8分钟 (6)蒸馏水洗 (7)1% 磷钼酸中染1~3分钟 (8)不用水洗直接入苯胺蓝液或亮绿液5分钟(如染色效果不佳,可在冰醋酸内脱色后重染) (9)水速洗,置60℃温箱中烘干,二甲苯透明,封固 3、结果:胶原纤维蓝色(苯胺蓝复染)或绿色(亮绿复染),肌纤维、纤维素红色。 4、注意: (1)此法广泛用于胶原纤维和平滑肌的鉴别,也为肾组织活检,观察肾小球病变的重要染色法,常用于观察缺血病变的心肌。用于观察肾小球病变时,一定要用2um以下半薄切片。 (2)细胞核染色后分化很重要,观察控制着色程度。而HE染色则是最常用的一种常规染色方法,但无法区别胶原纤维和肌肉。 N 粘液染色 (一)PAS染色法 与染糖元的方法相同。 (二)AB(pH2.5)染色法 1、试剂配制: 爱先蓝8GX 1 g 蒸馏水97 ml 冰醋酸 3 ml 核固红液: 核固红0.1g 硫酸铝5g 麝香草酚50mg 蒸馏水97ml 2、染色步骤: (1)切片脱蜡至蒸馏水。 (2)爱先蓝液染10~20分钟 (3)蒸馏水洗 (4)核复染(核固红5分钟),水洗 (5)脱水,透明,封固。 唾液酸及弱硫酸化粘液及一般粘液呈蓝色。常用于确定胞浆内空泡的性质,特别是当细胞呈现印戒样特征时。 J 甲基绿派洛宁法(改良Cook,1974) 1、试剂配制: (1)2%甲基绿水溶液: 甲基绿(methyl green)1g 蒸馏水加至50ml 用三氯甲烷抽提,方法详后。 (2)5%派洛宁水溶液: 派洛宁G(pyronine G)1g 蒸馏水加至20ml (3)0.2M醋酸盐缓冲液(pH 4.8) 0.2M醋酸液41ml 0.2M醋酸钠液59ml (4)甲基绿派洛宁染液: 2%甲基绿水溶液(经抽提)5ml 5%派洛宁水溶液1ml 蒸馏水12ml 0.2M醋酸盐缓冲液(pH 4.8)18ml 甲基绿水溶液的抽提:甲基绿为绿色粉末,属三苯甲烷染料,这种染料是由氯代甲烷作用于结果晶紫而形成的一种化合物。由于甲基化作用,甲基绿就比甲基绿后,所引进的甲基连接得并不牢固,容易从甲基绿中脱失。另一方面,在甲基化过程中,还有一部分结晶紫并没有生成甲基绿,因此,也有人认为甲中,常有少量的甲基紫或结晶紫成份。但是,也有人认为甲基紫乃是甲基绿的衰败产物,甲基绿在储存过程中,会不断产生甲基紫。因此,在配制试剂时,必须先将甲基绿所含的甲基紫或结晶紫抽提出来,才能使细胞核内的脱氧核糖核酸染成绿色。抽提方法是取2% 甲基绿水溶液20ml倾入洁净分液漏斗,加入三氯甲烷20ml充分摇荡混合,使其内的甲基紫溶于三氯甲烷中而呈紫红色。旋动分液漏斗下部的砂塞,慢慢把如此反复更换三氯甲烷,直到三氯甲烷无紫红色为止,即可得到得纯的甲基绿溶液。 2、操作步骤: (1)新鲜组织固定于Carnoy氏液(4℃)3~6小时,经95%酒精和无水酒精脱水,二甲苯透明,石蜡包埋。 (2)切片经二甲苯脱蜡至蒸馏水。 (3)置入甲基绿派洛宁染液于室温染30~60分钟。 (4)取出切片,不经水洗,用滤纸吸干多余染液。 (5)用丙酮迅速分化。 (6)转入丙酮二甲苯(1:1)稍洗。 (7)二甲苯透明2~3次。 (8)中性树胶封固。结果:存在于胞质和核仁内的核糖核酸呈红紫色,胞核染色质内的脱氧核糖核酸绿色或绿蓝色。 3、对照方法: (1)取另一连续切片用核糖核酸酶(rihonuclease)1mg/1ml于37℃温箱内消化3小时,蒸馏水洗后置入甲基绿派洛宁染液内染色。 (2)切片在10%高氯酸(prechloric acid)于4℃处理12~18小时,水洗后用1%碳酸钠液中和2分钟,流水冲洗5分钟,再用蒸馏水洗后置入甲基绿派洛宁染液内染色。经上述方法之一处理后的切片就为阴性。 4、注意事项: (1)组织不宜用甲醛固定,应选用Garnoy氏固定液,因为酒精和醋酸能较好地保存核蛋白。 (2)Garnoy氏液固定标本的时间不宜太长,超过一天则染色效果不理想。 (3)要注意试剂的质量,特别是派洛宁,常常不同批号的染料,染色的效果不同。甲基绿和派洛宁二者的比例要恰当。 (4)染色液的pH应为4.8左右,如pH过低,甲基绿染色效果差;pH偏高,则派洛宁染色效果不良。 (5)丙酮分化时间要很好掌握,时间不宜太长。 (6)配妥的甲基绿派洛宁染液用后放冰箱保存,约可使用数周。 染色原理:对此法的染色原理,目前了解得还不够清楚,一般可从下面两方面理解。1、电离作用:脱氧核糖核酸和核糖核酸都有磷酸基,又有碱基,故为两性电解质。在一定的条件下,可以电离而带电荷,因此都有一定的等电点。甲基绿和派洛宁在水中电离后,都产生带阳电荷的离子。甲基绿电离后,在五价氮处产生二个正电荷,碱性较强。派洛宁电离后仅产生一个正电荷,碱性较甲基绿弱,在染色时二者进行竞争,碱性较强的甲基绿就与胞核(等电点pH3.8~4.2)进行极性吸着而结合,碱性较弱的派洛宁与胞质(等电点pH4.6~5.2)吸附结合。2、聚合作用:甲基绿对聚合高的DNA有亲和力,派洛宁对聚合低的RNA有亲和力。因此,思虑在绿选染DNA,而派洛宁选染RNA。应用:PNA主要存在于胞质及核仁内,它主导细胞的蛋白质合成。在细胞增生,胞质蛋白质合成亢进时,核仁和胞质的PNA增加。因此,恶性瘤细胞核仁巨大,胞质嗜碱。浆细胞和免疫母细胞胞质合成免疫球蛋白,胰腺上皮合成胰蛋白酶。因此,这些细胞胞质有很强的嗜碱性。胞质嗜碱,是蛋白质合成增强的标志。 S 脂肪(苏旦Ⅲ)法 1、试剂配制: 苏旦Ⅲ0.1~0.2 70% 酒精100 ml 将苏旦Ⅲ置于70%酒精中,加热饱和,在未冷前过滤,静置一夜。 2、染色步骤: (1)冰冻切片(8~10微米)。 (2)70%酒精固定1分钟。 (3)放入苏旦Ⅲ酒精溶液中20~30分钟。 (4)70%酒精洗去多余的染料。 (5)水洗。 (6)苏木素复染2~5分钟。 (7)1%盐酸酒精分化。 (8)水洗,蓝化,甘油封固。 3、结果:脂肪桔黄或红色。一般用于确定胞浆内空泡究竟是糖原,水变性还是脂滴。 P 高碘酸-六胺银-马休黄染色法(PASM-M) 1、试剂配制: 六胺银原液: 3 %六甲基四胺水溶液(乌洛托品) 20 毫升,5 %硝酸银水溶液10 毫升。六胺银工作液:六胺银原液30毫升,双蒸水20毫升,5 %硼砂(四硼酸钠)2毫升。 核固红液:核固红0.1 克,5 %硫酸铝100毫升加热溶解,贮存饱和液待用。 马休黄液:马体黄0.5 克,无水酒精98 毫升,磷酸0.2 克。 2、操作方法: (1)常规脱蜡至水 (2)0.5%氧化20分钟 (3)蒸馏水洗3次 (4)浸入六胺银工作液中2小时左右(恒温58℃) (5)蒸馏水洗3次 (6)0.2%氯化金1-2分钟 (7)蒸馏水洗2次 (8)核固红染色10-15分钟 (9)马休黄染色1分钟 (10)放入温箱烤干,二甲苯透明,中性树胶封固 3、结果:肾小球毛细血管基膜呈黑色,背景和红细胞呈黄色,细胞 核呈红色。 4、注意:1、六胺银工作液现配现用,只能用一次。 2、第3步做完后可入5 %三氧化铬(铬酸)水溶液氧化40 分 钟,再用1 %亚硫酸钠除铬,背景可能效果更佳。 3、马休黄主要是染红细胞。用无水酒精中脱水,黄色的背景就脱掉,可直接放入 温箱或电吹风吹干,封片。 R 瑞氏-姬姆萨染色方法 1、试剂配制: 原料:A:瑞氏染粉0.8--1克;吉姆萨染粉0.5克 B:甘油33ml C:甲醇500ml 配法:将A放入研钵中,加入少量B研磨,再加入少量B磨,再加入少量B磨……倒出,将未溶部分,继续加入B磨……>全溶,加入C,或中间加入C 亦可。 2、染色步骤: 滴数滴入玻片盖满标本,30秒,再加入双蒸水或PBS2-3倍染1-3分中,倾去染液,水洗……封片。 T Trypan blue (台盘兰)排斥实验: 细胞悬液0.1ml加入0.4% Trypan blue生理盐水溶液0.1ml,混匀后滴在血球记数板上。存活率=不着色细胞数/细胞总数X100% TTC方法: TTC和活细胞线粒体内的琥珀酸脱氢酶反应,生成红色的甲月赞,用来表示细胞的活力。配制多为2%,染色要避光,37度条件下,它是评价脑缺血损伤常用的指标。 V Van Gieson法1、试剂配制: 饱和苦味酸水溶液(约1.22%)150 ml 1%酸性品红10 ml 两种溶液用前混合在一起。 2、染色步骤: (1)切片脱蜡至蒸馏水。 (2)苏木素深染。(10~15分钟) (3)Van Gieson中染半分钟。 (4)蒸馏水洗。 (5)置60℃温箱中烘干。 (6)二甲苯透明,封固。 3、结果:胶原纤维红色,肌纤维、胞浆、红细胞黄色。 4、建议:用稀释的Van Gieson液进行染色,不用95%的酒精分化,结果色泽鲜艳,而且着色均匀