2及其抑制剂和白细胞介素-6在中耳胆脂瘤的表达及意义
2及其抑制剂和白细胞介素-6在中耳胆脂瘤
的表达及意义
听力学及言语疾病杂志2005年第13卷第6期439
{验研宴
基质金属蛋白酶一2及其抑制剂和白细胞介素一6
在中耳胆脂瘤的表达及意义
汪欣祝威王苹郭晓峰张影
【摘要】目的研究基质金属蛋白酶一2(matrixmetalloproteinase一2,MMP一2)及其抑制剂(tissueinhibitorofmet—
alloproteinase,TIMP一2)和白细胞介素一6(interleukin一6,IL一6)在中耳胆脂瘤中的表达,探讨其表达在胆脂瘤溶骨
机制中的作用.方法应用免疫组化技术检测32例患者中耳胆脂瘤组织和10例正常人外耳道皮肤组织中MMP
一
2,TIMP一2和IL一6的表达.结果MMP一2在胆脂瘤上皮各层细胞中均有表达,基底层表达最强,棘层次之,颗
粒层及角质层细胞表达较弱;TIMP一2在基底细胞层和棘细胞层有少量表达;IL一6的表达分布于胆脂瘤上皮全层,
但在基底层细胞表达最弱,棘细胞层,颗粒层和角质层依次递增,染色最强的部位是颗粒层和角质层,而正常外耳
道皮肤未见MMP一2,TIMP一2,IL一6的表达.结论在胆脂瘤组织中存在MMP一2与TIMP一2的表达失衡,导致
胆脂瘤的骨质破坏.同时胆脂瘤上皮高表达IL一6可能是MMPs过表达的原因. 【关键词】中耳胆脂瘤;基质金属蛋白酶;基质金属蛋白酶抑制剂;白细胞介素一6 【中图分类号】R764.21【文献标识码】A【文章编号】1006—7299(2005)06—0439—03
ExpressionofIL——6andMatnxMetalloproteinase——2in
HumanMiddleEarCholesteatoma
WangXin,ZhuWei,WangPing,eta1.
(DepartmentofOtolaryngology—HeadandNeckSurgery.TheFirstHospital ofJilinUniversity,Changchun,130021,China) 【Abstract】ObjectiveTostudytheexpressionofmatrixmetalloproteinase一2(MMP一
2)tissueinhibitorofmetalloprotei—
nase一2(TIMP一2)andinterleukin一6(IL一
6)inhumanmiddleearcholesteatoma,andtoevaluatetheirIDlesinthemolecular
mechanismsofboneresorption.MethodsTheexpressionofMhIP一2.11hIP一2andIL一
6wereexaminedin32specimenswith
middleearcholesteatomaand10specimenswithnormalearcanalskinbyimmunohistochem
iealS—Pmethod.ResultsTheex—
pressionofMMP一
2inallepitheliallayersofcholesteatomawasstained,especiallyinthebasementmembrane.T
hepositivecells
0f11MP一2wei,~observedintheprickleandbasallayers.TheexpressionofIL一
6inallepitheliallayersofcholesteatomawei,~ abundantlystained,especiallyinthegranularlayerandstratumlayer.Neverwei,~MMP一
2,TIMP一2andIL一6detectedinnor—
realearcanalskin.ConclusionTheimbalancebetweentheexpressionofMMP一2and11MP一2inmiddleearcholesteatoma
maycausedlmcdyproteolytieactivityinvolvedinboneresorptionnlechardsms.Theupregul
ationofIL一6mightcontributetothe
increasingsecreationofMMPsincholesteatoma. tKeywords】
Middleearcholesteatoma;MetaUoproteinase;Tissueinhibitorofmetalloproteinase;IL一
6
中耳胆脂瘤对颞骨的溶骨性破坏是胆脂瘤型中
耳炎最重要的临床特征和病理生理过程.尽管胆脂
瘤骨质破坏的确切机理尚未清楚,但基质金属蛋白 酶(matrixmetalloproteinase一2,MMP一2)及其抑制剂 (tissueinhibitorofmetalloproteinase,TIMP一2)在胆脂 瘤型中耳炎骨质破坏机制中所起的重要作用日益 1吉林大学第一医院耳鼻咽喉一头颈外科(长春130021)2吉 林省伊通县人民医院
作者简介:汪欣,女,辽宁人,医学博士,主治医师,主要从事耳科学, 耳神经外科学及头颈部肿瘤的研究.
通信作者:祝威(Email:zhuwei3000@yahoo.?.en) 受到人们的关注.研究
证明
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MMPs家族成员在中耳 胆脂瘤中以高度特异的方式表达,其活性受控于许 多激活剂和抑制剂的影响,如胆脂瘤组织中存在大 量炎性介质:白细胞介素一1(IL一1),肿瘤抑制因子 一
a(TNF—a),白细胞介素一6(IL一6),肿瘤生长因 子(TGF)等.有关MMPs及其抑制剂和细胞因子在 中耳胆脂瘤骨破坏行为相关性的研究,国内外报道 较少.本文采用免疫组化技术检测基质金属蛋白酶 一
2(MMP一2)及其抑制剂TIMP一2和IL一6在中耳 胆脂瘤中的表达,探讨MMP一2,TIMP一2在胆脂瘤 形成中的作用以及与细胞因子IL一6之间的相关
JournalofAudiologyandSpeechPathology2005.Vol13.No.6
性,进一步阐明胆脂瘤溶骨性破坏的分子机制. 1材料与方法
1.1标本来源
收集2001年6月至2003年12月间本院手术标 本32例,经临床和病理检查确诊为后天继发性胆脂
瘤.其中男性18例,女性14例,年龄16,56岁,平 均32.5岁.同时取10例正常人外耳道皮肤作对照 组.所有新鲜标本取出后迅速放入4%甲醛溶液中 充分固定,石蜡包埋后备检.
1.2试剂
MMP一2,TIMP一2单克隆抗体,IL一6单克隆抗 体和sP染色超敏试剂盒均购自福州迈新生物试剂 公司.
1.3检测方法
取两组石蜡标本,每例各做4/an厚连续切片, 做MDM2免疫组化SP法染色和苏木精一伊红染色, 染色程序按说明书进行.具体步骤如下:切片常规 脱蜡,充分水化后,用PBS(pH7.4)冲洗3次,每次5 min;加1滴或50l3%过氧化氢甲醇溶液孵育,室 温下孵育10min,以阻断内源性过氧化物酶的活性;
,每次5min;0.1%胰蛋白酶37?消化 PBS冲洗3次
20rain;再用PBS冲洗3次,每次5min;0.01M枸橼 酸盐缓冲液(pH6.0)加热92?,抗原修复;然后用蒸 馏水冲洗3次,每次5min,PBS浸泡5min;加1滴或 5O1O%非免疫性山羊血清,室温下10min;吸去 多余的血清,加I滴或50l适当稀释的第一抗体, 4~C过夜;PBS冲洗3次,每次5min;加I滴或50l 生物素标记的第二抗体,37?孵育30min;PBS冲洗 3次,每次5mira;滴加辣根过氧化物酶标记的链霉 亲和素,37~C~育30rain;PBS冲洗3次,每次5min; 除去PBS液,每张切片加2滴或100l新鲜配制的 DAB溶液,显微镜下观察掌握染色情况;自来水冲 洗,苏木精复染核,中性树胶封片.免疫组化染色过 程中,用PBS代替一抗做阴性对照.
1.4结果判定
MMP一2,TIMP一2和IL一6细胞以胞浆染成棕 黄色为阳性.在高倍显微镜(×4OO)下取染色良好 (阳性细胞染色清晰,背景染色低)的组织切片,随机 选取5个阳性细胞多的视野,用计算机图象分析仪 测定灰度值,同时
记录
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平均值.
1.5统计学处理
应用Si~'naStat统计软件对数据进行编辑和统 计分析,进行t检验.灰度值用平均值?
标准
excel标准偏差excel标准偏差函数exl标准差函数国标检验抽样标准表免费下载红头文件格式标准下载
差表 示.
2结果
2.1MMP一2和TIMP一2在中耳胆脂瘤及外耳道 皮肤中的表达MMP一2和TIMP一2的阳性细胞位 于细胞浆,MMP一2在胆脂瘤上皮各层细胞中均有 表达,基底层表达最强,棘层次之,颗粒层及角质层 细胞表达较弱;只有2例正常外耳道皮肤有非常浅 染的MMP一2蛋白,主要分布在基底层细胞的胞浆 中(图1,2).TIMP一2在基底细胞层和棘细胞层有 少量表达;而正常外耳道皮肤未见TIMP一2表达(图 3,4).采用计算机图象分析仪检测其平均灰度值比 较MMP一2,TIMP一2在胆脂瘤上皮及正常外耳道皮 肤的表达差异,结果,MMP一2在胆脂瘤上皮组为 179.17?23.64,外耳道皮肤组为151.41?14.46,两 者间有显着性差异(P<0.01);TIMP一2在胆脂瘤上 皮组为160.13?38.95,外耳道皮肤组为144.40? 34.17,两者间无统计学差异(P>0.05). 2.2IL一6在中耳胆脂瘤及外耳道皮肤中的表达 IL一6的阳性颗粒为棕黄色,位于细胞浆内,分 布于胆脂瘤上皮全层,但在基底层细胞表达最弱,棘
细胞层,颗粒层和角质层依次递增,染色最强的部位 是颗粒层和角质层,正常外耳道皮肤各层细胞未见 IL一6表达(图5,6).采用计算机图象分析仪检测 其平均灰度值比较IL一6在胆脂瘤上皮及正常外耳 道皮肤的表达差异,结果,IL一6在HH_H~瘤上皮组为 134.33?42.02,外耳道皮肤组为61.00?19.65,两 者间有显着性差异(P<0.001). 3讨论
MMPs是一个锌离子依赖型的蛋白酶家族,参 与体内细胞外基质(extracellulormatrix,ECM)降解的 主要蛋白酶之一.TIMPs是MMPs的特异性抑制剂, 参与维持ECM成分更新和自稳,是与MMPs对应的 负调节剂;TIMPs与MMPs调节失衡所致ECM的降 解和重建是肿瘤组织具有侵袭性的关键因素. 本实验中,我们采用免疫组化技术检测了MMP 一
2和TIMP一2在胆脂瘤中的表达,发现MMP一2 在胆脂瘤组织中的表达明显高于正常外耳道皮肤, 显示胆脂瘤组织有较高的蛋白水解酶活性,MMP一2 的高活性能够水解骨基质内胶原,参与骨质的降解, 从而使胆脂瘤上皮具有侵袭性,不断侵袭,降解胆脂 瘤周围的组织,骨质,导致骨质破坏,表现出类似于 恶性肿瘤的生物学特性.而TIMP一2的表达略高于 外耳道皮肤,但与外耳道皮肤比较无统计学差异,表 明在胆脂瘤组织中存在TIMP一2的低表达;TIMP一 2的低表达减弱了对MMP一2的抑制作用,导致 MMP一2的活性增强,进而形成MMP一2在胆脂瘤 组织中有高表达现象n.J.结果提示在胭脂瘤中存 在MMP一2与TIMP一2的比例失衡.Banerjee等_4
采用免疫组化技术证实TIMP一2在胆脂瘤组织中存
听力学及言语疾病杂志2005年第l3卷第6期44l 在着低表达,但与正常外耳道皮肤相比无显着差异, 与我们的研究结果相符.
以往研究已证实,在胆脂瘤基质与邻近骨质之 间显示有疏松结缔组织和由成纤维细胞,淋巴细胞, 浆细胞,嗜酸性粒细胞等构成的致密细胞层存在. 这些炎性细胞可产生许多介质,如TNF—a,TGF— ,TGF一,IL一1,IL一6和甲状旁腺激素相关蛋白 (parathyroidhormonerelateelprotein,P1H—YP)等,它 们可以通过MMPs启动区活化蛋白一1(AP一1)来介 导MMPs基因的活化J,参与骨浸润的进展.Kotake 等l6]研究证明IL一6可刺激正常软骨及滑膜细胞前 列腺素和胶原酶的产生,诱导某些细胞分泌MMPs, 促进ECM的降解.Sehmidt等证实IL一6的抑制 剂可阻止MMP一9在胆脂瘤中的高表达,维持ECM 的完整性.本实验采用免疫组化技术检测了IL一6 在中耳胆脂瘤组织和正常外耳道皮肤的表达,发现 IL一6在中耳胆脂瘤组织中存在着高表达,我们认 为其原因主要为:?IL一6与IL一1和TNF—a密切 相关:研究已证实IL一1和TNF—a是非常有效的骨 溶解诱导因素,在胆脂瘤型中耳炎的组织破坏,组织 重建和破坏骨质中发挥着重要作用J.而这三种 细胞因子都可以由激活的巨噬细胞分泌,而且每一 种细胞因子都可以诱导其它两种细胞因子的产生, 因此IL一6在骨溶解,破坏中也应发挥着一定的作 用.?IL一6可能通过自分泌,旁分泌方式诱导胆 脂瘤上皮细胞及皮下基质细胞分泌多种MMPs来介
导骨质降解过程.结合本实验中IL一6在胆脂瘤组
织中的高表达以及MMPs在胆脂瘤组织中也存在高
表达现象?J,和其他学者关于IL一6和MMPs关系
研究_7_,提示IL一6在胆脂瘤型中耳炎骨质破坏机
制中起着重要作用.MMPs及TIMPs在中耳胆脂瘤
骨破坏机制中发挥重要作用,MMPs—rI1IMPs失衡,导
致了胆脂瘤骨质吸收等其它行为的发生.本实验进
一
步证明酶学也参与了胆脂瘤的形成机制.本研究
为开发利用这些酶类的抑制物,从而为中耳胆脂瘤
的预防和治疗提供了理论与临床依据.
4参考文献
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(本文图1,6见插图第6—2页)
(2004—12—20收稿)
(本文编辑雷培香)
(上接第438页)
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(2005—03—14收稿)
(本文编辑雷培香)
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