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2及其抑制剂和白细胞介素-6在中耳胆脂瘤的表达及意义

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2及其抑制剂和白细胞介素-6在中耳胆脂瘤的表达及意义2及其抑制剂和白细胞介素-6在中耳胆脂瘤的表达及意义 2及其抑制剂和白细胞介素-6在中耳胆脂瘤 的表达及意义 听力学及言语疾病杂志2005年第13卷第6期439 {验研宴 基质金属蛋白酶一2及其抑制剂和白细胞介素一6 在中耳胆脂瘤的表达及意义 汪欣祝威王苹郭晓峰张影 【摘要】目的研究基质金属蛋白酶一2(matrixmetalloproteinase一2,MMP一2)及其抑制剂(tissueinhibitorofmet— alloproteinase,TIMP一2)和白细胞介素一6(interleuk...

2及其抑制剂和白细胞介素-6在中耳胆脂瘤的表达及意义
2及其抑制剂和白细胞介素-6在中耳胆脂瘤的表达及意义 2及其抑制剂和白细胞介素-6在中耳胆脂瘤 的表达及意义 听力学及言语疾病杂志2005年第13卷第6期439 {验研宴 基质金属蛋白酶一2及其抑制剂和白细胞介素一6 在中耳胆脂瘤的表达及意义 汪欣祝威王苹郭晓峰张影 【摘要】目的研究基质金属蛋白酶一2(matrixmetalloproteinase一2,MMP一2)及其抑制剂(tissueinhibitorofmet— alloproteinase,TIMP一2)和白细胞介素一6(interleukin一6,IL一6)在中耳胆脂瘤中的表达,探讨其表达在胆脂瘤溶骨 机制中的作用.方法应用免疫组化技术检测32例患者中耳胆脂瘤组织和10例正常人外耳道皮肤组织中MMP 一 2,TIMP一2和IL一6的表达.结果MMP一2在胆脂瘤上皮各层细胞中均有表达,基底层表达最强,棘层次之,颗 粒层及角质层细胞表达较弱;TIMP一2在基底细胞层和棘细胞层有少量表达;IL一6的表达分布于胆脂瘤上皮全层, 但在基底层细胞表达最弱,棘细胞层,颗粒层和角质层依次递增,染色最强的部位是颗粒层和角质层,而正常外耳 道皮肤未见MMP一2,TIMP一2,IL一6的表达.结论在胆脂瘤组织中存在MMP一2与TIMP一2的表达失衡,导致 胆脂瘤的骨质破坏.同时胆脂瘤上皮高表达IL一6可能是MMPs过表达的原因. 【关键词】中耳胆脂瘤;基质金属蛋白酶;基质金属蛋白酶抑制剂;白细胞介素一6 【中图分类号】R764.21【文献标识码】A【文章编号】1006—7299(2005)06—0439—03 ExpressionofIL——6andMatnxMetalloproteinase——2in HumanMiddleEarCholesteatoma WangXin,ZhuWei,WangPing,eta1. (DepartmentofOtolaryngology—HeadandNeckSurgery.TheFirstHospital ofJilinUniversity,Changchun,130021,China) 【Abstract】ObjectiveTostudytheexpressionofmatrixmetalloproteinase一2(MMP一 2)tissueinhibitorofmetalloprotei— nase一2(TIMP一2)andinterleukin一6(IL一 6)inhumanmiddleearcholesteatoma,andtoevaluatetheirIDlesinthemolecular mechanismsofboneresorption.MethodsTheexpressionofMhIP一2.11hIP一2andIL一 6wereexaminedin32specimenswith middleearcholesteatomaand10specimenswithnormalearcanalskinbyimmunohistochem iealS—Pmethod.ResultsTheex— pressionofMMP一 2inallepitheliallayersofcholesteatomawasstained,especiallyinthebasementmembrane.T hepositivecells 0f11MP一2wei,~observedintheprickleandbasallayers.TheexpressionofIL一 6inallepitheliallayersofcholesteatomawei,~ abundantlystained,especiallyinthegranularlayerandstratumlayer.Neverwei,~MMP一 2,TIMP一2andIL一6detectedinnor— realearcanalskin.ConclusionTheimbalancebetweentheexpressionofMMP一2and11MP一2inmiddleearcholesteatoma maycausedlmcdyproteolytieactivityinvolvedinboneresorptionnlechardsms.Theupregul ationofIL一6mightcontributetothe increasingsecreationofMMPsincholesteatoma. tKeywords】 Middleearcholesteatoma;MetaUoproteinase;Tissueinhibitorofmetalloproteinase;IL一 6 中耳胆脂瘤对颞骨的溶骨性破坏是胆脂瘤型中 耳炎最重要的临床特征和病理生理过程.尽管胆脂 瘤骨质破坏的确切机理尚未清楚,但基质金属蛋白 酶(matrixmetalloproteinase一2,MMP一2)及其抑制剂 (tissueinhibitorofmetalloproteinase,TIMP一2)在胆脂 瘤型中耳炎骨质破坏机制中所起的重要作用日益 1吉林大学第一医院耳鼻咽喉一头颈外科(长春130021)2吉 林省伊通县人民医院 作者简介:汪欣,女,辽宁人,医学博士,主治医师,主要从事耳科学, 耳神经外科学及头颈部肿瘤的研究. 通信作者:祝威(Email:zhuwei3000@yahoo.?.en) 受到人们的关注.研究 证明 住所证明下载场所使用证明下载诊断证明下载住所证明下载爱问住所证明下载爱问 MMPs家族成员在中耳 胆脂瘤中以高度特异的方式表达,其活性受控于许 多激活剂和抑制剂的影响,如胆脂瘤组织中存在大 量炎性介质:白细胞介素一1(IL一1),肿瘤抑制因子 一 a(TNF—a),白细胞介素一6(IL一6),肿瘤生长因 子(TGF)等.有关MMPs及其抑制剂和细胞因子在 中耳胆脂瘤骨破坏行为相关性的研究,国内外报道 较少.本文采用免疫组化技术检测基质金属蛋白酶 一 2(MMP一2)及其抑制剂TIMP一2和IL一6在中耳 胆脂瘤中的表达,探讨MMP一2,TIMP一2在胆脂瘤 形成中的作用以及与细胞因子IL一6之间的相关 JournalofAudiologyandSpeechPathology2005.Vol13.No.6 性,进一步阐明胆脂瘤溶骨性破坏的分子机制. 1材料与方法 1.1标本来源 收集2001年6月至2003年12月间本院手术标 本32例,经临床和病理检查确诊为后天继发性胆脂 瘤.其中男性18例,女性14例,年龄16,56岁,平 均32.5岁.同时取10例正常人外耳道皮肤作对照 组.所有新鲜标本取出后迅速放入4%甲醛溶液中 充分固定,石蜡包埋后备检. 1.2试剂 MMP一2,TIMP一2单克隆抗体,IL一6单克隆抗 体和sP染色超敏试剂盒均购自福州迈新生物试剂 公司. 1.3检测方法 取两组石蜡标本,每例各做4/an厚连续切片, 做MDM2免疫组化SP法染色和苏木精一伊红染色, 染色程序按说明书进行.具体步骤如下:切片常规 脱蜡,充分水化后,用PBS(pH7.4)冲洗3次,每次5 min;加1滴或50l3%过氧化氢甲醇溶液孵育,室 温下孵育10min,以阻断内源性过氧化物酶的活性; ,每次5min;0.1%胰蛋白酶37?消化 PBS冲洗3次 20rain;再用PBS冲洗3次,每次5min;0.01M枸橼 酸盐缓冲液(pH6.0)加热92?,抗原修复;然后用蒸 馏水冲洗3次,每次5min,PBS浸泡5min;加1滴或 5O1O%非免疫性山羊血清,室温下10min;吸去 多余的血清,加I滴或50l适当稀释的第一抗体, 4~C过夜;PBS冲洗3次,每次5min;加I滴或50l 生物素标记的第二抗体,37?孵育30min;PBS冲洗 3次,每次5mira;滴加辣根过氧化物酶标记的链霉 亲和素,37~C~育30rain;PBS冲洗3次,每次5min; 除去PBS液,每张切片加2滴或100l新鲜配制的 DAB溶液,显微镜下观察掌握染色情况;自来水冲 洗,苏木精复染核,中性树胶封片.免疫组化染色过 程中,用PBS代替一抗做阴性对照. 1.4结果判定 MMP一2,TIMP一2和IL一6细胞以胞浆染成棕 黄色为阳性.在高倍显微镜(×4OO)下取染色良好 (阳性细胞染色清晰,背景染色低)的组织切片,随机 选取5个阳性细胞多的视野,用计算机图象分析仪 测定灰度值,同时 记录 混凝土 养护记录下载土方回填监理旁站记录免费下载集备记录下载集备记录下载集备记录下载 平均值. 1.5统计学处理 应用Si~'naStat统计软件对数据进行编辑和统 计分析,进行t检验.灰度值用平均值? 标准 excel标准偏差excel标准偏差函数exl标准差函数国标检验抽样标准表免费下载红头文件格式标准下载 差表 示. 2结果 2.1MMP一2和TIMP一2在中耳胆脂瘤及外耳道 皮肤中的表达MMP一2和TIMP一2的阳性细胞位 于细胞浆,MMP一2在胆脂瘤上皮各层细胞中均有 表达,基底层表达最强,棘层次之,颗粒层及角质层 细胞表达较弱;只有2例正常外耳道皮肤有非常浅 染的MMP一2蛋白,主要分布在基底层细胞的胞浆 中(图1,2).TIMP一2在基底细胞层和棘细胞层有 少量表达;而正常外耳道皮肤未见TIMP一2表达(图 3,4).采用计算机图象分析仪检测其平均灰度值比 较MMP一2,TIMP一2在胆脂瘤上皮及正常外耳道皮 肤的表达差异,结果,MMP一2在胆脂瘤上皮组为 179.17?23.64,外耳道皮肤组为151.41?14.46,两 者间有显着性差异(P<0.01);TIMP一2在胆脂瘤上 皮组为160.13?38.95,外耳道皮肤组为144.40? 34.17,两者间无统计学差异(P>0.05). 2.2IL一6在中耳胆脂瘤及外耳道皮肤中的表达 IL一6的阳性颗粒为棕黄色,位于细胞浆内,分 布于胆脂瘤上皮全层,但在基底层细胞表达最弱,棘 细胞层,颗粒层和角质层依次递增,染色最强的部位 是颗粒层和角质层,正常外耳道皮肤各层细胞未见 IL一6表达(图5,6).采用计算机图象分析仪检测 其平均灰度值比较IL一6在胆脂瘤上皮及正常外耳 道皮肤的表达差异,结果,IL一6在HH_H~瘤上皮组为 134.33?42.02,外耳道皮肤组为61.00?19.65,两 者间有显着性差异(P<0.001). 3讨论 MMPs是一个锌离子依赖型的蛋白酶家族,参 与体内细胞外基质(extracellulormatrix,ECM)降解的 主要蛋白酶之一.TIMPs是MMPs的特异性抑制剂, 参与维持ECM成分更新和自稳,是与MMPs对应的 负调节剂;TIMPs与MMPs调节失衡所致ECM的降 解和重建是肿瘤组织具有侵袭性的关键因素. 本实验中,我们采用免疫组化技术检测了MMP 一 2和TIMP一2在胆脂瘤中的表达,发现MMP一2 在胆脂瘤组织中的表达明显高于正常外耳道皮肤, 显示胆脂瘤组织有较高的蛋白水解酶活性,MMP一2 的高活性能够水解骨基质内胶原,参与骨质的降解, 从而使胆脂瘤上皮具有侵袭性,不断侵袭,降解胆脂 瘤周围的组织,骨质,导致骨质破坏,表现出类似于 恶性肿瘤的生物学特性.而TIMP一2的表达略高于 外耳道皮肤,但与外耳道皮肤比较无统计学差异,表 明在胆脂瘤组织中存在TIMP一2的低表达;TIMP一 2的低表达减弱了对MMP一2的抑制作用,导致 MMP一2的活性增强,进而形成MMP一2在胆脂瘤 组织中有高表达现象n.J.结果提示在胭脂瘤中存 在MMP一2与TIMP一2的比例失衡.Banerjee等_4 采用免疫组化技术证实TIMP一2在胆脂瘤组织中存 听力学及言语疾病杂志2005年第l3卷第6期44l 在着低表达,但与正常外耳道皮肤相比无显着差异, 与我们的研究结果相符. 以往研究已证实,在胆脂瘤基质与邻近骨质之 间显示有疏松结缔组织和由成纤维细胞,淋巴细胞, 浆细胞,嗜酸性粒细胞等构成的致密细胞层存在. 这些炎性细胞可产生许多介质,如TNF—a,TGF— ,TGF一,IL一1,IL一6和甲状旁腺激素相关蛋白 (parathyroidhormonerelateelprotein,P1H—YP)等,它 们可以通过MMPs启动区活化蛋白一1(AP一1)来介 导MMPs基因的活化J,参与骨浸润的进展.Kotake 等l6]研究证明IL一6可刺激正常软骨及滑膜细胞前 列腺素和胶原酶的产生,诱导某些细胞分泌MMPs, 促进ECM的降解.Sehmidt等证实IL一6的抑制 剂可阻止MMP一9在胆脂瘤中的高表达,维持ECM 的完整性.本实验采用免疫组化技术检测了IL一6 在中耳胆脂瘤组织和正常外耳道皮肤的表达,发现 IL一6在中耳胆脂瘤组织中存在着高表达,我们认 为其原因主要为:?IL一6与IL一1和TNF—a密切 相关:研究已证实IL一1和TNF—a是非常有效的骨 溶解诱导因素,在胆脂瘤型中耳炎的组织破坏,组织 重建和破坏骨质中发挥着重要作用J.而这三种 细胞因子都可以由激活的巨噬细胞分泌,而且每一 种细胞因子都可以诱导其它两种细胞因子的产生, 因此IL一6在骨溶解,破坏中也应发挥着一定的作 用.?IL一6可能通过自分泌,旁分泌方式诱导胆 脂瘤上皮细胞及皮下基质细胞分泌多种MMPs来介 导骨质降解过程.结合本实验中IL一6在胆脂瘤组 织中的高表达以及MMPs在胆脂瘤组织中也存在高 表达现象?J,和其他学者关于IL一6和MMPs关系 研究_7_,提示IL一6在胆脂瘤型中耳炎骨质破坏机 制中起着重要作用.MMPs及TIMPs在中耳胆脂瘤 骨破坏机制中发挥重要作用,MMPs—rI1IMPs失衡,导 致了胆脂瘤骨质吸收等其它行为的发生.本实验进 一 步证明酶学也参与了胆脂瘤的形成机制.本研究 为开发利用这些酶类的抑制物,从而为中耳胆脂瘤 的预防和治疗提供了理论与临床依据. 4参考文献 1祝威,谢燕,王苹,等.两种基质金属蛋白酶在胆脂瘤和中耳癌 中的表达[J].中华耳鼻咽喉科杂志,2001,36:119. 2BanerjeeAR,JonesJL,BirchallJP,eta1.LocalizationofII1日xmet- alloproteinase1incholesteatomaanddeepmeatalskin[J].Otology Neurotology,2001,22:579. 3BanerjeeAR,JamesR,NarulaAA.Matrixmetallopmteinase一2and ?xmetallopmteinase一9ineholesteatomaanddeepmetalskin.a comparativeanalysis[J].ainOtolaryngol,1998,23:345. 4Bane~eeAR.JamesR.NanfiaAA.Matrixmetalloproteinase一1in eholesteatoma,middleeargranulationsanddeepmeat~skin.ao0m- pal'a~veanalysis[J].ClinOtolaryngol,1998,23:515. 5AubleDT,BrinekerhoffCE.TheAP一1sequenceisnecessarybutnot sufficientforphorbolinductionofcollagenaseinfibrublasts[J].Bio- chemistry,1991,30:4629. 6KotakeS,SatoK,KimKJ,eta1.Interleukin一6andsolubleinter— leukin——6receptorsinthesynovialfluidsfromrheumatoidarthritispa- tientsayeresponsibleforosteoclast—likecellformation[J].Jnolle MinerRes,1996,11:88. 7SchmidtM,GnmsfelderP.HoppeF.Inductionof?xmetallopro- teinasesinkeratinoeytesbyeholesteatomadebrisandgranulationtissue e)[ITacts[Jj.EurArchOtolhinolaryngol,2O0O,257:425. 8ShiwaM,KojimaH,KamideY,eta1.Involvementofinterleukin一1 inmiddleeareholesteatoma[J].AmJoIol.1995,16:319. 9SastryKV,ShaymaSC,MannSB,eta1.Auraleholesteatoma:roleof tunqornecrosisfactor—alphainbonedestruction[J].AmJ0Iol,1999, 20:158. (本文图1,6见插图第6—2页) (2004—12—20收稿) (本文编辑雷培香) (上接第438页) l5UsamiS.OttersenOP.Thelocalizationoftaufine—likeimmunoreae. tivityintheorganofCorti:asemiquantitative,post—embeddingim- muno—electronmicroscopicanalysisintheratwithsomeobservations intheguineapig[J].BrainRes,1995,676:285. 16UsamiS,OsenKK,ZhangN,eta1.Distributionofglutamate—like andgIutamine—likeimmunoreaetivitiesintheratorganofCorti:a lightmicroscopicandsemiquamitativeelectronmicroscopicanalysis withanoteonthelocalizationofaspartate[J].ExpBrainRes,1992; 91:1. 17SealRP,AmayaSG.Excitatoryaminoacidtransporters:afamilyin nuxlJj.A~IBHRevPharmacolToxieol,1999,39:431. 18SimsKD,RobinsonMB.ExpressionpatternsandregulationofgIu- matatetransportersinthedevelopingandaduhnervoussystem[J]. 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