人蛋白二硫键异构酶的纯化及其抗血清制备

人蛋白二硫键异构酶的纯化及其抗血清制备 人蛋白二硫键异构酶的纯化及其抗血清制 备 生物化学与生物物理 A0TAB10G?Ima直日?BIOP?YSIOASINIOA 习(t Vo1.28No4 J口ly.3_996 人蛋白二硫键异构酶的纯化 及其抗血清制备 吴秉毅冯桂湘,/吕静强帆冯永清王福琴 一酞滩院?吣始 关键词蛋白二硫键异构酶:分离与纯化;抗血清制备. _——————————?———-——-----—-一?'.'?------?'—--.一 二硫键在维持蛋白质的空问结构,生物学活性中起重要作用.二硫键的形成是蛋白质 翻译后修饰的重要反应之一,该反应由蛋白二硫键异构酶(Proteladisulfideiso'mer,~se, PDI,Ea5.3.4,1)催化.PDI是微粒体酶,位于内质网内腔面,是分子量为60kD的单 体构成的二聚体.研究表明1)DI是一种多功能蛋白,它与脯氮酰羟化酶亚单位,甲状 腺素结台球蛋白有相同结构,受同一基因编码,PDI对蛋白二硫键的形成及正确维 持起重要作用,它可以使错位的二硫键复位.照近的研究表明PDI能促进原核细胞表 达的重组蛋白的复性,使重组蛋白的生物学活性增强.我们从人肝脏中纯化得到纯的 PDI,现报道如下. 材料与方法 1.1材料 0M—Seph~dex0?,~phadoxG200,DEAE—FlastFlow均为Pham1aelB产品,牛 血清白蛋白BSA).乳酸脱氢酶,碱性磷酸酶均为Sigma产品,RNA及RNAase购自上 海东风生化试剂公司,其他试剂均为国产分析纯.人肝脏取自猝死者,取后于-40.a保 存.Wa~,rs650E蛋白纯化系统为Water公司产品,DU60紫外分光检测仪,_J-2l高速 冷冻离心机为Beckman公司产品. 1.2方法 1.2.1PDI的纯化参照Lambert法[并予以改良.所有步骤均在4~0操作. 500克肝脏解冻后用冷生理盐水洗净,剪碎,用含5mmol/L]~DTA,0.10订tonx— 100的磷酸盐缓冲液匀桨.匀桨后用同种缓冲液稀释至1500ml,搅拌2小时纱布过滤 后~8000×F离心60分钟,弃渣,上清液置53.O水浴中l6分钟后迅速冷却至4.a,静置4 收稿日期:1995'04-85;接受日期1995.'01? .驻在广l海球区石漾中医院. 一幕 一 磊, 一研一 4期人蛋白二硫键异构酶的纯化及其抗血清制备425 5N85%饱和度硫酸铵分级分离,85饱 小时,18000g离心60分钟.上清液进一步用5 和度硫酸铵分离后的沉淀物用25mmol/LpH6.3的柠檬酸缓冲液溶解并透析.透析后 上柱,采用同种缓冲液平衡的CM-SephadexC5O柱(2.6cmX30cm).检测,收集穿 过峰,用25mmol/Lpll4.8的柠檬酸缓冲液透析后再上柱,采用DEAE—Flas~Flow柱 (2.6×so).用含0,0.7mol/LNaOl的同种缓冲液线性洗脱,收集具PDI酶活力部分 (图1),并对0.1mol/LPB透析即得PDI. umheroffrcactionofelute 1PurificationofhumanPDIbyDEAE—fias~flowr2Determinationofthe OOlllDI~.CM(yolL]P&rteluLe(690mgproLel~)wasapplied_0MrofPDIbygelfiI~r atiom .叩hyOilSephadex aDEAE—flas~flowcolumnandwase:uLedh8/::near0hr0ma0窖 1叫j.?}ofX:;CIG200coluJtln ——一,:————DIactlvky;…__】NaC1grad~enl:.1.LDH;2ALP;3.]3SA;4.PD1. 1.2.2PDI酶活力测定参见Kuska.PDI活力分析主要依据PDI使含不规 则二硫键结构的枝糖桉酸酶(sRNAa~e,无RNA降解活性)辽原成正确二硫健的桉糖核 酸酶(gNAa~e,具BNA降解活性)的速率,生成RNAase的速率根据RNAase对RNA 的降解速度,测定/:so的变化,即可计算酶活力.在总体积为3ml的体系中(含25O pgRNA,10/tgsRNAase,2mol/LDTT,1mmol/LEDTA,50mmol/LTri~HCI pH7.5)30.C10分钟于DU60上测AD0,酶单位定义及计算根据Ibbefson[. 1.2.8礁胶过瘪纯化的PDI5mg和 标准 excel标准偏差excel标准偏差函数exl标准差函数国标检验抽样标准表免费下载红头文件格式标准下载 分子量蛋白(乳酸脱氢酶,Mw186 kD;碱性磷酸酶,MWS6kD;BSA,68kD)溶于25mmol/Lp}I7.5的PBS中,总体积为 1ml.在Seph~dexG200柱上柱t2cm×55cm),用同种缓冲液洗脱,A2so检测,收集各 洗脱峰并测乳酸脱氢酶,碱性磷酸酶及PDI活记录它们的洗脱位置并与分子量作图, 计算PD1分子量(图2). 1.2.4SDS—PAGE4浓缩胶,1.0%分离胶,10V/cm电泳2.5小时,0.1 考马斯亮蓝R250染色,7醮酸脱色 1.2.5蛋白含量测定根据Lowry'目法,以B8A为标准. 1.2.6抗人PDI抗血清的制备选择健康新西兰大白兔(2kg)进行免疫,首次 注射』U纯PDI150g与等量完全福氏佐剂混匀,多点皮下注射.一个月加强免疫,后间 隔二周加强注射,第三次加强免疫后两周放血.收集血清,50磷酸铵沉淀,收集球蛋 白 部分于一20.G保存. 426生物化学与生物物理28卷 结果与讨论 5OO克肝脏经抽提,热处理,55茄,85筠(Ht).sO?分级分离,OM—Sepha~exa5O 柱,DEAE-FF柱后获80mg纯PDI,比活力为830U/g?蛋白,整个过程纯化了890倍, PDI的纯化过程如表1.SDS-PAGE呈单一带. Table1P?r泊e船缸0?ofPD工fromhumanliver P0t.I丑PDISI~ectificPurificatlonYid activhactivity (m1it日)(units/g)南ld【%) Homcgenat1660303502.11lO0 Hea?reatme 目per?&tant1008003船331.5右.5 55~85%sa~ur. (N?0舯4frac~.880017820.210.550 CM—SephadexaEO p?63elule690113:163.078.832 DEA~FFpH4.8 e!ute8066.4830.0391.520 收集SephadexG200柱洗脱峰测定乳酸脱氢酶,碱性磷酸酶及PDI活性,发现PDI ,234 Fig.3SDS-~polyaorylam~degel elec~rophorsisofpurifiedhuman PDI 洗脱位置在乳酸脱氢酶与碱性磷酸酶之间(圈2),计 算结果PD1分子量为120kD.SDS-PAG]~示PDT 位60kD位置(圈3),提示PDI由两个相同亚基构成, 与国外文献报道相近. 免抗人PDI与人PDI及人血清的双扩散试验可 见免抗人PDI与PDI之间见一条明显的沉淀线,抗 人PDI与人血清之问无沉淀线出现,抗人PDI的效价 为1:16. 脊椎动物(鼠,牛)等PDI的纯化,国外已有文献 报道,但人PDI的纯化尚未见报道.根据PDI的特 性,在Lamber~法的基础上我们进行改良.本纯化过 程中,肝脏经匀浆抽提,热处理,55,85黟饱和硫酸铵 分级分离后,根据PDI等电点(p?4.2)较低这一特 点,调节pH至6.3使PDI带正电荷,使上述初步纯 1.thepurifi自dPDI:2theporelnfr0m化物通过CM—SephadexO50柱,则带负电荷的杂蛋白 :茹:吸附于OM柱上,穿透峰经电泳证实仅含PDI及分子 4.矗ndmk.一量为68kD的蛋白.考虑到分子量为68kD的蛋白可 能为人白蛋白,进一步调pH至4.8(人白蛋白pI为4.8),PDI仍带弱正电荷,而白蛋自 在此条件下几乎呈电中性,该条件通过DEAE—FF柱,68kDd蛋白在穿透峰中出现,而 PDI很容易用NaOl洗脱.DEAE-FlastFlow柱用含O—O.7tool/LNaOl梯度的缓 4期^蛋白二硫键异构酶的纯化爰其抗血清制备 冲液线性梯度洗脱,出现3个洗脱峰(28o),第一峰为分子量为5okD以下的杂蛋白,第 二峰为PDI(图1).其终比活为830U/'g蛋白,与从牛肝中纯化的PDI比活相近(93a U/g蛋白).不同来源的PDI,其分子量有一定差异.如从绿藻中提取的PDI,分子量为 120kD,鼠肝来源的PD1分子量为107kD,而鸡胚来源的PD1分子量为1~0kD,牛肝来 源的PD1分子量为107kD.我们的研究初步表明人PDI由分子量为60kD的两个 相同 的单体构成.研究表明,PDI在基因 工程 路基工程安全技术交底工程项目施工成本控制工程量增项单年度零星工程技术标正投影法基本原理 蛋白的复性中因能维持正确的二硫键,防止重组 蛋白复性中肽链半胱氨酸间错误交联形成无活性的异构体,可以便表达蛋白的生物学活 性增强.此外PDI还是脯氨酰羟化酶亚单位,PDI本身并无羟化酶活性,但与亚单 位结台后即能使前胶原肽上的脯氨酰基羟化,该反应对胶原形成起关键作用.国外研究 表明血清脯氨酰羟化酶IB亚单位含量的澜I定能早期反映肝纤维化程度,因此对PDI的研 究具有多重意义. 参考文献 .[1]F删ma?船,pzo%elndisulfideisomer~se:mulilerolei?themodificationofn?eBmsecretory~rot- eins.0e巩1989.57:1969 [2】孙志贤,陈惠鹅,童新,见:孙志贤主编:现代生袖化学理论与研究桂术,北京:军事医学科学出版社,1995: 387. 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FENGYong-Qingand%VANGFu—Qin (Zhujia~g日D{缸F打耵Military日j删{Guaagzho,~510280) ABSTRAGT ~ro%eindisulfide—isomoraSehasbeenisolatedfr0mhumanliver.Theprepar- afireprocedureinvolvedhe&ttreatmenl,(NH4)2S04precipitation,OM-Sephadex a50andDEAE-flastflowchromatogrphy.ThoenzymeWaShomogenousandhada molecularmassof60kDand120asdeterminedbysodiumdodecylsulphate electro-phoresisandgelfil%z'ationrespec~vely,indicatingthattheenzymegasB 120kDdimerwi也asubunitwithmolecularmassof60kD.Theenzymeactivity wasashighasssou/g?proteinasmeasured'bythereactivationof"scramb]ed ribonuclease.Tlh0antiserumofhightiterwagpreparedbyimmunenizingNew Zealandrabbitwi七hamix%areoftheproteindisulfide—isomeraseandadvan%. EEYWORDS:l:hro'~iendisulfide—isomerase;PurificationandisoL~tdon;Prepa- ra缸onofantiserum