新城疫病毒LaSota疫苗株基因组全长cDNA克隆的构建及鉴定

新城疫病毒LaSota疫苗株基因组全长cDNA克隆的构建及鉴定 () 中图分类号 : S 852 . 659 . 5 文献标志码 : A 文章编号 : 167324696 20110520503205 新城疫病毒 La Sota 疫苗株基因组全长 cD NA 克隆的 构建及鉴定 1 ,2 2 1 3 2 31 ,2 震,张守峰,张乐萃,扈荣良 齐艳君,康 (1 . 青岛农业大学 动物科技学院 ,山东 青岛 266109 ; )2 . 军事医学科学院 军事兽医研究所 ,吉林 长春 130122 摘要 : 为构建能为新城疫病毒拯救提供直接使用的全长 cDN A 克隆 ,利用分子克隆的 方法 快递客服问题件处理详细方法山木方法pdf计算方法pdf华与华方法下载八字理论方法下载 ,将新城疫病 ( ) 毒 L a So t a 株全基因组分成末端部分重叠的 11 个片段 F1, F11,按其基因组顺序克隆至改造后的真核 表 关于同志近三年现实表现材料材料类招标技术评分表图表与交易pdf视力表打印pdf用图表说话 pdf ( ) 达载体 p V A Xr 上 ,同时在全长 cDN A 两侧引入 T7 启动子和丁型肝炎病毒核酶 Ri b序列 ,以确保病毒基因 组转录产物的两端形成精确的核酸序列 。鉴定结果表明 ,新城疫病毒 L a So t a 株基因组全长 cDN A 已成功 克隆至 p V A Xr 上 ,命名为 p V A Xr2FL 。本研究为新城疫病毒的拯救及外源基因的表达奠定了基础 。 关键词 : 新城疫病毒 L a So t a 株 ;反向遗传操作 ;p V A X1 载体 Construction and ident if ication of complete cD NA clone of Ne wca stle disea se virus La Sota vaccine stra in 1 ,2 1 ,2 2 1 2Q I Ya n2j u n, KA N G Zhe n, Z H A N G Sho u2f e ng, Z H A N G L e2c ui, H U Ro ng2lia ng ( 1 . Col le ge o f V ete ri na r y a n d A ni m al S ci ences , Qi n g d ao A g ric ul t u ral U ni ve rs i t y , Qi n g d ao 266109 , Chi n a; )2 . M i l i t a r y V ete ri n a r y I ns t i t ute , A ca de m y o f M i l i t a r y M e d ic al S cie nces , Cha n gc h un 130122 , Chi n a ( ) Abstract : To co n st r uct t he co mp let e cDN A of Newca st le di sea se vi r u s NDV fo r t he vi r u s re scue , ( ) eleve n o ve r2lappi ng f ra gme nt s F1 to F11co ve ri ng co mp let e cDN A of NDV L a So t a vacci ne st rai n were clo ne d i nto t he reco mbi na nt e uka r yo tic e xp re ssio n vecto r p V A Xr . The p la smi d co nt ai ni ng t he co mp let e vi2 ral cDN A wa s f la nke d by T7 p ro mo t er a nd hep atiti s D vir u s Ri b seque nce s ,w hich co ul d ge ne rat e t he co r2 rect 3′a nd 5′t er mi nal seque nce s of t he p a re nt al vi ral ge no mic RN A t ra n scrip tio n p ro ductio n . Re st rictio n e ndo n uclea se di ge stio n s co nfi r med t hat t he co mp let e ge no me of t he NDV wa s clo ne d i nto t he p la smi d p V A Xr . The reco mbi na nt p la smi d wa s na med p V A Xr2FL . The co n st r uct e d e uka r yo tic e xp re ssio n vecto r co ul d be u se d to re sc ue t he NDV L a So t a st rai n a nd p ro vi de t he ba si s fo r t he e xp re ssio n of fo rei gn ge ne s. Key words : Newca st le di sea se vi r u s L a So t a st rai n ; rever se ge netic s ;p V A X1 vecto r ( ) 新城疫是由新城疫病毒 Newca stle di sea se vi2 nique则能很好地解决这一难题 。该技术又称“病 ) r u s ,NDV引起的一类急性 、高度接触性传染病 ,该 毒拯救”, 是通过对病毒基因组 cDN A 的操作 “, 再 [ 2 ] 病毒为不分节段的单股负链 RN A 病毒 , 基因组大 造”病毒的过程。由于这种拯救病毒是来自全长 ( ) 小为 15 186 bp ,编码病毒的 6 种蛋白 :核蛋白 N P、 cDN A 的 ,因此可 以 在 DN A 水 平上 对病 毒 基因 组 ( ) ( ) ( ) 磷蛋白 P、基质蛋白 M、融合蛋白 F、血凝素及 进行各种修饰或改造 ,为构建新型病毒载体表达外 [ 1 ] ( ) () 源基因 及 研 制 病 毒 活 载 体 疫 苗 提 供 了 技 术 支 持 。 神经氨酸酶 HN和大聚合酶蛋白 L 。 [ 3 ] 新城疫病毒作为一种 RN A 病毒 , 难以直接用 1999 年 , Peet er s 等率先利用反向 遗传 操 作系 统 ( 于克隆操作 , 反向遗传技术 reve r se ge netic s t ech2 成 功 地 对 NDV L a So t a 株 进 行 了 拯 救 。随 后 , 收稿日期 : 2011203203 ; 修回日期 :2011204218 () 作者简介 : 齐艳君 1985 ,女 ,天津静海人 ,硕士生 。 3 通讯作者 ,从事分子病毒学与免疫学研究 , Tel : 0532286080486 , E2mail :lczhang @qau. edu. cn ,ro nglianghu @ho t mail . co m [ 4 ] [ 5 ] [ 6 ] I 均由军事医学科学院军事兽医研究所流行病学实验 Clo ne230、Bea udet t e C、He rt s233、鹅 源 ZJ [ 7 ] 株4 个病毒相继被成功拯救 。 本研究利用多克隆; SP F 鸡胚购自长春农业科学院 。室保存 位点改造后的 p V A X1 真核 1 . 2 载体及试剂 p MD182T 载体 、Ex T aq 酶 、M2ML V 鼠源反转 表达载体为骨架 ,成功构建了含新城疫病毒 L a So t a 株基因组全长 cDN A 的真核表达质粒 ,并使全基因 录酶 、Ri bo nuclea se In hi bito r 、CIA P 购 自大 连 宝 生 组置于 T7 启 动 子 及 丁 型 肝 炎 核 酶 的 编 码 序 列 之 物工程有限公司 ; T4 DN A 连接酶及限制性内切酶 间 ,为拯救新城疫病毒及表达外源基因提供了可直 购自 N EB 公司 ; p V A X1 载体 、Trizol 试剂购自 In2 接使用的全长 cDN A 克隆 。vit ro ge n 公司 ;凝胶回收试剂盒购自 A xyge n 公司 。 1 . 3 引物的 设计 领导形象设计圆作业设计ao工艺污水处理厂设计附属工程施工组织设计清扫机器人结构设计 及合成1 材料与方法 根据 Ge nBa n k 中的 L a So t a 株全基因组序列 , ( ) 1 . 1 毒株 、菌株和鸡胚设计 11 对特 异 性 引 物 见 表 1 , 分 别 对 各 段 进 行 α扩增 。 新城疫病毒 L a So t a 疫苗株 、大 肠杆 菌 D H5 表 1 PCR 所用引物 Ta ble 1 Primers used f or the ampl if ication of 11 over2la pping f ragments in ND V genome 引物名称 引物序列 Pri mer na me s Pri mer sequences ) 1F12F ′2CC GC G GTA A TA C GA C TCA C TA TA GGA CCA A A CA GA GA A TCC GT GA GT23′5 F12R 5′2C T GA T GTA T GA GTC TA C GTCCCC23′ F22F 5′2A GA GGCC GCA A CA C GGCA GGT G23′ F22R 5′2TA TA GA GCC GCA A A TC GA GGGGT23′ F32F 5′2A CA TCCCA A T GCCC TCA CCC GT23′ F32R 5′2T T GC T T GC TCC GGTCC T GA GC T23′ F42F 5′2A CCCA GGCCA CA GA C GA A GCC GT23′ F42R 5′2A C GGT TA C GC GTCCA T TCA GT GG23′ F52F 5′2C T GA A T GGA C GC GTA A CC T TA A T TA A TC TA GC T23′ F52R 5′2T GT T T GGC T T GTA TCA GA GC T GC23′ F62F 5′2GCA A C T GCC GCA CA A A TA A CA G23′ F62R 5′2A GT GGC TC TCA TC T GA TC TA GA GT23′ F72F 5′2GTA CA A GCA A A A GGC GCA A C23′ F72R 5′2CC GTCCA GGC T TA TA C GA A GA CC T23′ F82F 5′2T GCCCA GA T GA GCA A GA C TA CC23′ F82R 5′2GTCCA TCA GTC T TA GGT GA A TCCA23′ F92F 5′2T T GA T GGGCC TA CC TCA C T TC T23′ F92R 5′2GGA C TC T TC GC GTA T GT T TC T TA A G23′ F102F 5′2GA GA C T GT T GCA A GCCCA A A TA A T GT23′ F102R 5′2TCA T GCC T T TA A GC TC TA GA C T GA T23′ F112F 5′2GGC GA TA TA A TCA GTC TA GA GC T TA A A GG23′ F112R 5′2GT GA A T GA C GA GA C TA CA C TCA A GA A T23′ Li nker21 5′2C TA GCC GC GGA A GGTA CCA A GTC GA CA A A C GC GTA A A GC GGCC GCA C T TC GA A TA C T TA A GC TA TC GA T T GC23′ Li nker22 5′2TC GA GCA A TC GA TA GC T TA A GTA T TC GA A GT GC GGCC GC T T TA C GC GT T T GTC GA C T T GGTA CC T TCC GC GG23′ 5′2GA A T TC GA A C TCA A A TA A A T GTC T TA A A A A A A GGT T GC GCA CA A T TA T TC T T GA GT GTA GTC TC GTCA T TCARi b CCA A A TC T T T GT T T GGT GGG T CGGCA T GGCA T C T CCA CC T CC T CGCGG T CCGA CC T GGGCA T CCGA A GGA GGA 2) CGCA CG T CCA C T CGGA T GGC T A A GGGA GGGCGT T TA A A C GGA TCC23′ ) ) 1下划线表示 T7 启动子 ; 2斜体表示丁型肝炎核酶的编码序列 ) ) 1U nderli ne mean s T7 p ro mot er ;2Incli ned fo r m mea n s Ri b gene sequence 1 . 4 病毒增殖1 . 5 病毒 RNA 的提取及反转录 μ40 枚 9 日龄的 SP F 鸡胚 ,尿囊腔接种新城疫病 取鸡胚尿囊液 500 L , 加入 1 mL Trizol 裂解 毒 L a So t a 株病毒悬液 , 每枚 0 . 2 mL , 在相对湿度 液 ,经过氯仿抽提 , 异丙醇 、750 mL / L 乙醇沉淀 及 μ65 % 、温度 98 ) 的条件下进行孵化 ,96 h 后收集尿 700 mL / L 乙 醇 洗 涤 后 , 真 空 干 燥 , 加 入 17 L μ囊液 ,低速离心取上清 ,并用 0 . 22m 的滤器过滤分 D EPC 水 ,50 ?保湿 10 mi n ,待 RN A 完全溶解后 , μ装 , - 80 ?保存 。 加入 1L 随机引物 ,按照 M2ML V 鼠源反转录试剂 盒说明 书 关于书的成语关于读书的排比句社区图书漂流公约怎么写关于读书的小报汉书pdf 进行反转录 ,合成的 cDN A 可作为 模板 个人简介word模板免费下载关于员工迟到处罚通告模板康奈尔office模板下载康奈尔 笔记本 模板 下载软件方案模板免费下载 进 ,挑取单个菌落进行摇菌 , 受态细胞 。转化连接产物 行 PCR 反应 。用 SD S 碱裂解法小量制备质粒 。选择合适的限制 1 . 6 目的片段的扩增性内切酶对质粒进行酶切鉴定 ,将酶切鉴定正确的 各片段分别进行 PCR 扩增 ,在 PCR 管中分别 质粒送至生物公司测序 ,每个片段至少送 2 个阳性 μμ加入 Ex T aq 0 . 5L ,10 ×Ex T aq B uff e r 5L ,模板 克隆 , 以确保克隆的基因片段与病毒基因组 RN A μμμcDN A 4L ,dN T P 4L ,上 、下游引物各 1 . 5L ,无 序列完全一致 ,将得到的质粒命名为 p T F12p T F11 。 μ 菌去离子水补至 50L 体系 。PCR 反应条件为 95 1 . 8 真核表达载体 p VAX1 的改造?预变性 2 mi n , 95 ? 30 s ,根据各片段引物不同 , 要构建能为病毒拯救及表达外源基因提供直接 在 47,60 ?之间退火 ,时间为 30 s ,72 ?延伸 90 s , 使用的全长 cDN A 克隆 ,需要对 p V A X1 真核表达 ( 共 25 个循环 ,最后 72 ?延伸 10 mi n 。PCR 产物经 载体进行改造 。人工合成的 2 个 L i nke r 序列见表 ) 20 ? 1经退火后形成双链 , 此 双 链含 有 N he ?、S ac ?、 10 g/ L 琼脂糖凝胶电泳后 ,回收目的条带 , - K p n ?、S al ?、M l u ?、N ot ?、B s tB ?、A f l ?、 保存 。 1 . 7 PCR 产物的 T 克隆及其鉴定Cl a ?、X ho ?等 10 个限制性酶切位点 ,将其克隆至 PCR 产 物 连 接 至 p MD182T 载 体 。 p V A X1 载体的 N he ?和 X ho ?之间 ,以便于各片段 回 收 后 的 [ 8 ] α应用 Ino ue 超级感受态的制作方法制备 D H5感的克隆 。改造示意图见图 1 。 图 1 真核表达载体 pVAX1 改造示意图 Fig. 1 Schematic diagra m f or reconstruction of the p VAX1 vector p V A Xr2F627 作载体 ,连接 F125 片段 ,得到 p V A Xr2 1 . 9 真核表达质粒 p VAXr2FL 的构建 F127 。因 F8 片段两端为 B s tB ?酶切位点 , 因此需 将新城疫病毒 L a So t a 疫苗株全基因组分为末 ( ) 端部分重叠的 11 个片段 F1, F11,利用相邻片段 将 p V A Xr2F127 先 与 F9 片 段 连 接 , 再 插 入 F8 片 段 , 将 构 建 的 质 粒 命 名 为 p V A Xr2F129 。再 以重叠部分存在的限制性酶切位点进行基因组全长的 连接 。p V A Xr2F129 作为载体 ,连接 F102R 片段 ,最终得到 首先 ,以 p V A Xr 为骨架 ,在 X ba ?和 P m e ?位 p V A Xr2FL ,至此 NDV 全基因组克隆完成 。克隆在 点间插入 F11 片段及丁型肝炎病毒核酶基因序列 , T7 启动子和核酶基因序列之间的 DN A 片段可以 将 构 建 所 得 质 粒 命 名 为 p V A Xr2F112R 。再 以在 T7 RN A 聚 合 酶 的 作 用 下 得 到 转 录 , 并 且 由 于 p V A Xr2F112R 作为载体 ,将 F10 片段克隆至 A f l ? Ri b 的自身催化功能 ,可以保证转录产物的两端与 克隆的 DN A 片段精确一致 。基因组全长构建示意 和 X ba ?位点间 ,得到 p V A Xr2F102R 。F12F5 片段 的克隆策略 : 因 F4 片 段 内 存 在 一 个 S al ?酶 切 位 图见图 2 。 点 ,因此对于 F4 片段不能直接克隆 ,需将其分为 F4 结果2 () ( ) ( ) ( ) 1、F4 2两部分 ,按 F1 , F2 , F4 2F5 , F3 F4 14 2 . 1 全长基因组各片段 PCR 产物的鉴定部分顺 序 先 后 克 隆 到 p V A Xr 上 , 命 名 为 p V A Xr2 F125 。因 F6 片段一端存在 X ba ?酶切位点 ,因此需新城疫病毒全基因组经设计的 11 对特异性引物 扩增后 ,得到长度分别为 900 、840 、610 、1 042 、1 780 、 将 F6 、F7 片段先连接 ,共同克隆至 p VA Xr 的 N ot ? () 及 B s tB ?酶切位点间 ,命名为 p V A Xr2F627 。再以 1 263 、1 380、3 060 、1 005、3 461 和 415 bp 的条带见图 3。 图 2 基因组全长构建示意图 Fig. 2 Schematic diagra m of the construction of pVAXr2FL 2 . 3 真核表达载体 p VAX1 改造后的酶切鉴定 选择替换后多克隆位点处的酶切位点 X ho ?和 载体上非多克隆位点处的酶切位点 N de ?进行双 酶切 ,获得了预期长度为 2 586 和 414 bp 的片段 ,用 替换后 多 克隆 位点 处 的 S al ?酶切 位 点 进 行 单 酶 切 ,可将载 体 线性 化 , 得到 的 片段 长度 约 3 000 bp 图 3 全基因组各片段扩增产物的电泳鉴定 () 见图 5。 Fig. 3 Agarose gel electrophoresis identif ication of a mpl if ied eleven PCR f ragments of ND V La Sota vaccine stra in M : DN A 分子质量标准 ;1,11 : 各片段的 PCR 扩增产物 M : 250 bp DN A Mar ker ;1 - 11 : PCR2a mplified f ragment s F1 to F11 2 . 2 PCR 产物的 T 克隆酶切鉴定 扩增的 11 个片段连入 T 载体后 , 选择合适的 酶切 位 点 进 行 鉴 定 。分 别 用 B a m H ?、K p n ?和 S al ?、S al ?、B a m H ?、M l u ?和 N ot ?、EcoR ?、 X ba ?和 B s tB ?、S p e ?和 S al ?、S m a ?、A f l ?和图 5 真核表达载体 pVAXr 的酶切鉴定 X ba ?、EcoR ?进行酶切 , 获得了预期长 度分 别 为Fig. 5 Restriction endonuclease digestion identif ication of 2 987和 613 bp 、2 700 和 840 bp 、2 700 和 610 bp 、pVAXr plasmid 3 180和 556 bp 、1 780 和 2 700 bp 、3 630 和 333 bp 、M :DN A 分子质量标准 ; 1 : p V A Xr 的 N de ? + X ho ?双酶切产物 ; 2 :p V A Xr 的 S al ?酶切产物 2 700和 1 380 bp 、5 000 和 680 bp 、2 892 和 813 bp 、M :250 bp DNA Mar ker ;1 : Product f ro m p VA Xr digested wit h N de ?+ ( 3 461和 2 700 bp 、2 770 和 345 bp 大小的片段 见图X ho ?;2 : Product f ro m p VAXr digested wit h S al ?, re specit vel y ) 4。 2 . 4 p VAXr2FL 的酶切鉴定 通过分析 p V A Xr2FL 的酶切位点 ,选用 4 组酶 对其进 行 鉴 定 , S ac ?和 X ba ?、B s tB ?、P m e ?、 M l u ?和 X ba ?, 分 别 获 得 了 预 期 长 度 为 8 906 , 6 243 ,3 600 、10 740 , 4 881 , 3 060 、18 749 、8 906 , () 3 870 和3 043 bp 的条带 见图 6。 讨论3 图 4 PCR 产物 T 克隆的酶切鉴定 反向遗传操作技术对 NDV 基因功能的研究及 Fig. 4 Restriction endonuclease digestion analysis of eleven NDV 基因工程疫苗和多价疫苗的研制具有重要意 recombinant T plasmids M : DN A 分子质量标准 ;1,11 : 各片段的 T 克隆 义 。应用带有遗传 标记 的 基因 工程 新城 疫 疫苗 免 M : DL 15000 DN A Ma r ker ; 1 - 11 : Pla smids p T F1 to p T F11 疫 ,易于区分免疫鸡群与自然感染鸡群 ,而传统弱毒 of Newca st le di sea se vi r u s :evidence fo r t he exi st ence of a new genu s wit hi n t he subf a mil y p a ra myxo vi ri nae [ J ] . J Gen V i rol , ( ) 1999 ,80 1: 1312136 . N EU MA N N G , W H I T E M A , KA WAO KA Y. A decade af t er [ 2 ] t he generatio n of a negative2sen se RN A vi r u s f ro m clo ned cDN A2w hat have we lear ned ? [ J ] . J Gen V i rol , 2002 , 83 ( ) 11:263522662 . [ 3 ] P E E T ERS B P H , OL A V S D E L EEU W , KOC H G , et al . Re scue of Newca stle di sea se vi r u s f ro m clo ned cDN A :evidence 图 6 真核表达质粒 pVAXr2FL 的酶切鉴定 t hat cleava bilit y of t he f usio n p rot ei n i s a majo r det er mi na nt fo r Fig. 6 Restriction endonuclease digestion identif ication of ( ) vi r ulence [J ] . J V i rol ,1999 ,73 6:500125009 . pVAXr2FL [ 4 ] RO EM ER2OB ERDO ER F ER A , MU ND T E , M EBA TSION T , M : DN A 分子质量标准 ;1,4 : 分别为 p V A Xr2FL 的 S ac ?+ X ba ?、 et al . Generatio n of reco mbi nant lento genic Newca st le di sea se B stB ?、Pme ?和 M l u ?+ X ba ?酶切产物( ) vi r u s f ro m cDN A [J ] . J Gen V i rol ,1999 ,80 11:289722995 . M : DL15000 DNA Mar ker ; 1 - 4 : Product s f ro m p VAXr 2FL digest ed [ 5 ] KR IS HN A MU R T H Y S , H U A N G Z H , SA MAL S K. Re2 wit h S ac ?+ X ba ?, B stB ?, Pme ?,a nd M l u ?+ X ba ?,respectively co ver y of a vi r ulent st rai n of Newca stle di sea se vi r u s f ro m clo ned cDN A : exp re ssio n of a fo reign gene re sult s i n gro wt h 疫苗和灭活疫苗不具有此特性 。此外 ,新城疫弱毒 ( ) ret a r datio n and at t enuatio n [ J ] . V i rol o g y , 2000 , 278 1 : 1682 可作为一 种 载 体 表 达 目 的 蛋 白 , 进 而 用 于 免 疫 和 182 . 治疗 。 D E L EEU W O S , KOC H G , HA R TO G L , et al . Vi r ulence of [ 6 ] Newca stle di sea se vi r us i s det er mi ned by t he cleavage sit e of 目前 ,已有多种外源基因成功地在 NDV 载体 [ 9 ] t he f u sio n p rot ei n a nd by bo t h t he st e m regio n a nd glo bula r 上得到表达 。Engel2Her be r t 等将绿色荧光蛋白 head of t he hae maggl uti ni n2neura mi nida se p ro t ei n [ J ] . J Gen ( ) GF P基因插入新城疫病毒 Clo ne230 株基因组的 F ( ) V i rol ,2005 ,86 Pt 6: 175921769 . 基因与 HN 基 因 间 , 成 功 获 得 的 重 组 新 城 疫 病 毒[ 7 ] 刘玉良 , 张艳梅 , 胡顺林 , 等. 利用反向遗传操作技术产生 ZJ l r NDV/ GF P1 在 鸡 胚 中 可 稳 定 地 表 达 GF P 。Na2 ( ) 株鹅源新城疫病毒[J ] . 微生物学报 ,2005 ,45 10:7802783 . [ 10 ] ka ya 等将 流 感 病 毒 的 HA 基 因 插 到 NDV L IU Yu2liang , ZHA N G Ya n2mei , H U Shun2li n , et al . Genera2 Hit c h ne r B1 株基因组的 P 基因和 M 基因之间 ,获 tio n of Newca stle di sea se vi r us st rai n ZJ 1 i solat ed f ro m a n o ut2 得了 含 有 流 感 病 毒 HA 基 因 的 重 组 新 城 疫 病 毒 brea k i n t he goo se u si ng rever se genetics t echnique [ J ] . A ct a [ 11 ] r NDV/ B12HA 。同时 , O be r doe rf e r 等利 用 反 向 ( ) () M ic robi ol o gi ca S i nica ,2005 ,45 10:7802783 . i n Chi ne se萨姆遗传操 作 技 术 , 证 实 HN 蛋 白 基 因 的 不 同 长 度 与 布鲁克 J ,拉塞尔 D W. 分子克隆实验指南 [ M ] . 黄培堂 , 王嘉[ 8 ] NDV 的毒力和致病性有着非常重要的关系 。 玺 ,朱厚础 ,等译. 3 版. 北京 :科学出版社 ,2002 . 利用反向遗传操作技术拯救病毒时 ,病毒基因 SA MB ROO K J , RU SS ELL D W. M olec ul a r Cl oni n g : A L abo2 组 cDN A 在转录过程中是否形成精确的 5′端和 3′ rat or y M an u al [ M ] . Tran slat ed by H U A N G Pei2t a ng , WA N G 端在病毒的复制及拯救过程中至关重要 ,病毒基因 [ 12 ] J ia2xi , ZH U Ho u2chu , et al . 3r d ed . Beiji ng : Science Pre ss , 组末端冗余的碱基会影响病毒的拯救效率。因 ()2002 . i n Chi ne se 此 ,需引入核酶对病毒基因组的转录产物进行精确 EN GEL2H ERB ER T I , W ERN ER O , T EIF KE J P , et al . [ 9 ] 剪切 。此外 ,作 为 p cDN A3 . 1 的 衍生 质 粒 , 本 试 验 Cha ract erizatio n of a reco mbi na nt Newca stle di sea se vi r u s ex2 所用的真核表达质粒 p V A X1 具有转染效率高 、稳 p re ssi ng t he green fl uo rescent p ro t ei n [ J ] . J V i rol M et ho ds , 定性好 、安全性高 、便于基因操作等优点 ,是哺乳动 ( ) 2003 ,108 1: 19228 . 物表达专用质粒 , 同时也 是 美国 FDA 批 准的 唯 一 N A KA YA T ,CRO S J , PA R K M S , et al . Reco mbi na nt New2 可用于临床试验的真核表达载体 。随着分子生物学 [ 10 ] ca stle di sea se vi r us a s a vacci ne vecto r [ J ] . J V i rol , 2001 , 75 技术的日臻成熟 ,这一载体系统必将有更为广泛的 ( ) 23: 11868211873 . 应用 。 OB ERDO ER F ER A R , W ERN ER O , V EI TS J , et al . Co nt ri2 [ 11 ] 重 组 全长 L a So t a 质 粒 p V A Xr2FL 的 成 功 构 butio n of t he lengt h of t he H N p rot ei n and t he sequence of 建 ,为新城疫病毒的拯救乃至作为疫苗载体表达外 t he F p ro t ei n cleavage sit e to Newca stle di sea se vi r u s p at ho2 源基因奠定了基础 。 ( ) genicit y [J ] . J Gen V i rol ,2003 ,84 11:312123129 . L E M ERCI ER P ,J A COB Y , TA N N ER K , et al . A no vel ex2 [ 12 ] p ressio n ca sset t e of l yssavi r us sho w s t hat t he di st a ntl y relat ed Mo kola vi r us can re scue a def ective ra bie s vi r u s geno me [J ] . J ( ) V i rol ,2002 ,76 4:202422027 . ( )责任编辑 胡志敏 参考文献( Ref erences) [ 1 ] D E L EEU W O , P EE T ERS B J . Co mplet e nucleo ti de sequence