红假单胞菌R18二氧化碳固定基因的序列测定及其表达

红假单胞菌R18二氧化碳固定基因的序列测定及其 表 关于同志近三年现实表现材料材料类招标技术评分表图表与交易pdf视力表打印pdf用图表说话 pdf 达 第3 9 卷第6 期Vo .l 39, No. 6 大 连 理 工 大 学 学 报1 9 9 9 年 1 1 月 . 1 9 9 9Nov Journa l of D a l ian Un iver s ity of Techn o logy () 文章编号: 100028608 19990620741205 红假单胞 菌18二氧化碳固定基因的序列测定及其表 达 R 1 1 1 1 1 2 周集体,王 竞,杨凤林,王 栋,项学敏,卢重协 ( 1. 大连理工大学 环境科学与工程系, 辽宁 大连 116012; )2. 日本地球环境产业技术研究机构 在红假单胞菌 质粒的限制性酶切基础上, 建立了该质粒的物理 18 摘要: R 图 谱; 采 用 法 测 定 了 基 因 的 部 分 核 酸 序 列; 以18 dye p r im e r R R ub isCO 为 载 体, 将基 因 转 入 紫 色 非 硫 杆 菌PBR 322 R 18 R ub isCO R h od op seu d om ona. p a lu s t r is 的野生菌及其 缺陷型中, . 7 N oR ub isCO Fo rm I 获得的转化子 和的 酶活性分别是其受体菌的 1. 7711 14 M GM GR ub isCO 倍和 7. 18 倍, 但它们的粗蛋白含量和世代时间相差不大. 关键词: 基因表达红假单胞菌; ƒ; 序列分析 R u b isCO DN A 中图分类号: 786 文献 标识 采样口标识规范化 下载危险废物标识 下载医疗器械外包装标识图下载科目一标识图大全免费下载产品包装标识下载 码: Q A ( “温室效应”已成为全球关注的热点, 二氧化碳是对“温室效应”影响最大的气体 占总效应) 的 50% 左右, 同时又是地球上最丰富的碳资源. 利用有关微生物将二氧化碳转化为有机碳, 1 在环境、资源和能源方面具有极其重要的意义. 卡尔文循环是 固定的最重要生化机制, CO 2 ()其关键酶是 1, 52二磷酸核酮糖羧化酶加氧酶 . 关于自养细菌 的特性、 ƒR u b isCO R u b isCO 2 , 9 基因结构以及基因表达已有不少报道, 但 基因的表达活性普遍不高. 本研究通 R u b isCO 过对已克隆的红假单胞菌 基因进行了序列分析, 并完成了该基因在紫色非硫杆 18 R R u b isCO 菌及其变异株中的表达, 为构建 活性更高的工程菌提供依据.R u b isCO 1 材料与方法 1. 1 材料 1. 1. 1 菌株与质粒 ( )1 受体菌: 大肠杆菌 E. C o l i 紫色非硫杆菌野生型 R sp. P a lu s t r is 紫色非109, . 7, JM N o硫杆菌 缺陷型 R sp. P a lu s t r is 2. 7. R u b isCO Fo rm I N oD F I () 2质粒: PBR 322, PU C 19, PM G101. ()3 供体菌: 红假单胞菌 18. R 以上菌株及质粒均由日本地球环境产业技术研究机构分子生物学实验室提供. 1. 1. 2 主要生化试剂 各种限制性内切酶以及 连接酶来自 和, T 4DN A T ak a raTO YOBO . N EB 收稿日期: 1998209226; 修订日期: 1999209215 ( )基金项目: 辽宁省青年人才基金资助项目 973008 ( ) ( ) 作者简介: 周集体 1956, , 男, 教授, 博士生导师; 杨凤林 1944, , 男, 教授, 博士生导师. 1. 1. 3 培养基 大肠杆菌的培养和转化采用 培养基; R sp. P a lu s t r is 及其变异株的 . 7 L B N o10 培养采用 112p ro T , Y E , E tO H 2N aH CO 3 培养基. 1. 1. 4 主要实验设备2100 自动分离系统; 基因扩增 KU RA BO P IP ER K IN ELM ER PCR 系统 9600; 应用生物系统 800 分 子 生 物; 应 用 生 物 系 统 373测 序 仪; A DN A B EC KM A N DU 640 光谱仪. 1. 2 方法 1. 2. 1 质粒提取 参照文献11 的方法. 1. 2. 2 质粒的酶解、酶解片断的回收 按文献11 方法进行. 分子的连接与转化1. 2. 3 参照文献11 的方法.DN A 参照文献7 的方法.酶活性的测定 1. 2. 4 R u b isCO 12 1. 2. 5 基因序列测定 按 方法进行.R u b isCO dye p r im e r 1. 2. 6 粗蛋白含量测定菌体在 2培养基中培养至 OD 为 1. 0 左右, 收集细 E tO H N aH CO 3 660 胞; 超声波破碎 10 , 离心分离粗蛋白; 采用 光谱仪在 595 下测定蛋白含 m in BA C KM A N nm 量. 2 结果与讨论 2. 1 基因的酶切分析 18 R R u b isCO 从红假单胞菌 R 18 中提取质粒, 采用限制性内切酶 表 1 18 质粒的酶切分析 R H in d III、A se I、P st I、X ho I 和 N co I 进行单酶切和双酶切 片段大小ƒ 内切酶bp 分析, 结果如表 1 所示.根据表 1 可以绘出 质粒的 18 R 502, 1 777, 6 450 H ind III 限制性内切酶图谱, 如图 1 所示. 59, 2 015, 6 655 A se I 2. 2 18 基因的核酸序列测定R R u b isCO 638, 3 000, 5 097 P st I 基因的测序策略如图 2 所根据图 1, 18 R R u b isCO975, 1 239, 6 515 N co I 示. 首先用 酶切 质粒, 回收长度 3 000片段; 18 P st I R bp 1 875, 6 850 X ho I 再用 酶切, 产生两个基因片段; 然后将它们分别 H in d III 12, 502, 638 H ind III 插入到 的 和 位点, 构建成两个亚克19 PU C P st I H in d III 1 235, 1 765, 4 577 + P st I () () 隆, 进行序列测定, 结果如图 3 a和 b 所示. 图 1 18 质粒酶切图谱 图 218 基因的测序策略 R R R u b isCO 743 第 6 期 周集体等:红假单胞菌 二氧化碳固定基因的序列测定及其表达 18 R 图 3 18 基因的核酸序列测定结果 R R u b isCO 2. 3 含 基因片段表达载体的构建 18 R R u b isCO 参照上述酶切图谱与序列分析的结果, 首先采用 A se I 片段, 该片段长约 6.酶切, 分离出其中最长的 5 k b; DN A ( 然 后 将 其 与 连 接, 构 建 成 表 达 质 粒 命 名 为 322 PBR ) 22. 其构建过程如图 4 所示.PM PB 2. 4 18 基因在紫色非硫杆菌及其变异株中的 R R u b isCO 表达 紫色非硫杆菌既能在好氧条件, 也能在厌氧条件下进 行光能自养及异养生长, 它在众多 固定转化的微生物 CO 2 中具有特殊的地位. 因此作者选择了紫色非硫杆菌及其变 异株作为受体菌.将构建的 22 质粒导入紫色非硫杆 PM PB () 菌 野 生 型 R sp. P a lu s t r is 和 紫 色 非 硫 杆 菌 . 7 N oW T () 缺陷型 R sp. P a lu s t r is 2挑 . 7, R u b isCO Fo rm I N oD F I R T 选转化子 和 并测定其 酶活性、菌 11 14, M GM GR u b isCO 体粗蛋白含量和世代时间, 结果如表 2 所示. 可见, 11 M G 与的 酶活性分别是其受体菌的 1. 77 倍和14 M GR u b isCO 4含 基 因 图 18 R R u b isCO 7. 18 倍, 但它们的粗蛋白含量和世代时间相差不大. 片段表达载体的构建 表 2 转化子的特性 - 1 - 1()()ƒ 世代时间 蛋白含量ƒ? 酶活性ƒ? 菌株受体菌h m gmL mU m g 17. 70 0. 105 90. 8 W T 20. 85 0. 074 23. 0 R T 14. 78 0. 097 159. 0 W T M G11 16. 20 0. 107 165. 0 R T 14 M G 3 结 论 () 1建立了红假单胞菌 基因的限制性内切酶图谱.18 R R u b isCO ()2 测定了红假单胞菌 基因的部分核酸序列. 18 R R u b isCO ( ) 3获得的转化子和的 酶活性分别是其受体菌的 1. 77 倍和 7. 18 11 14 M GM GR u b isCO 倍, 但它们的粗蛋白含量和世代时间相差不大. 参考文献: 1 松永是, 高野博幸. () 化学工业, 1992, 8: 6482653. . CO の 生物固定J2 2 T A B IRA F R. M o lecu la r and ce llu la r regu la t io n o f au to t rop h ic ca rbo n d io x ide f ixa t io n in () m ic roo rgan ism s J . M icrob io l Rev, 1988, 52 2: 1552189. 3 P A OL I G C , M O R GA N N S, TAB ITA F R. E xp re ssio n o f the cbbL cbbS and cbbM gene s and d ist inc t o rgan iza t io n o f th e cbb C a lv in cyc le st ruc tu ra l gene s o f R h od obac te r cap su la tu s J . A rch M icrob io l, 745 第 6 期周集体等: 红假单胞菌 二氧化碳固定基因的序列测定及其表达 18 R () 1995, 164 6: 3962405. 4 H ERN AN D E Z J M , BA L ER S H , L A RBA CH S C. D educed am ino ac id sequence, funct io na l exp re ssio n and un iqu e enzym ic p rop e r t ie s o f th e fo rm I and fo rm II R ub isCO f rom the chem o au to t rop h ic bacte r ium () T h iobac i l lu s d en i t r if icans J . J Bac ter io l, 1996, 178 2: 3472356. 5 X U H H , TA B ITA F R. Po sit ive and nega t ive regu la t io n o f sequence s up st ream o f th e Fo rm II cbb () ca rbo n d io x ide f ixa t io n op e ro n o f R h od obac te r sp h ae roid es J . J Bac ter io l, 1994, 176 23: 729927308. 6 G IB SON J L , TAB ITA F R. N ucleo t ide sequence and func t io na l ana ly sis o f cbbR , a po sit ive regu la to r o f () th e C a lv in cycle op e ro n s o f R h od obac te r sp h ae roid es J . J Bac ter io l, 1993, 175 18: 577825784. 7 F L CON E D L , TA B ITA F R. Com p lem en ta t io n ana ly sis and regu la t io n o f ca rbo n d io x ide f ixa t io n gene exp re ssio n in a r ibu lo se 1, 52b isp ho sp h a te ca rbo xy la se2o xygena se de le t io n st ra in o f R h od osp i r i l lum () ru brum J . J Bac ter io l, 1993, 175 16: 506625077. 8 T O SH IA K I Y , CHU N G S Y , YA SU O I. C lo n ing and sequence o f th e L 2 fo rm o f R ub isCO f rom a m a r ine o b liga te ly au to t rop h ic H 2o x id izingbac te r ium , H y d rog enov ibr io m a r inu s s t ra in M H 2110 J . 2 () B io sc i B io techn o l B iochem , 1994, 58 9: 173321737. 9 刘 振 盈, 颜 望 明. 多 能 硫 杆 菌 R ub isCO 基 因 鉴 定 以 及 在 大 肠 杆 菌 中 的 表 达 J . 微 生 物 学 报, 1997, () 37 4: 3042306. YV E S J. In v ivo regu la t io n o f Fo rm I r ibu lo se 1, 52b isp ho sp h a te ca rbo xy la se2o xygena se gene f rom 10 R h od op seu d om onas sp h ae ro id es J . A rch B iochem B iophy s, 1987, 254: 2902303. AM BROO K J , FR IT SCH E F , M AM IA T IS T. M o lecular C lon in g, A L abora tory M an ua l: 2nd ed. 11 S M . N ew Yo rk: Co ld Sp r ing H a rbo r L abo ra to ry P re ss, 1989. 12 P ER K IN E. A B I PR ISM D NA Sequen c in g K itsM : T o kyo: n s , 1995. Sequen c in g an d expre ss ion of ca rbon d iox ide f ixa t ion 18gen e f rom R h od op seu d om on a s R 1 1 1 1 1 2, ,2, ,2,YANG F e ng lin W ANG D o ng ZHO U J it iW ANG J ing X IANG Xue m in 22RO H J ung hy e o b ( Eng. , D a lia n U n iv. o f Te c hno .l , D a lia n 116024, C h ina ; & 1. . . . D e p to f Env iro nS c i )2. . . . , R e sIns to f Inno va t ive Te c hno lfo r the Ea rthJ a p a n P h y sica l m ap o f R h od op seu d om on a s R 18 p la ssm id co n ta in ing r ib u lo se 1, :A bstrac t () 52b isp ho sp h a te ca rbo xy la se2 o x ygena se R ub isCO gene an d p a r t ia l sequen c ing o f th e R ub isCO gen e w e re m ade. R h od op seu d om on a s R 18 R u b isCO gene w a s t ran sfo rm ed in to th e rec ip ien t R h od op seu d om on a s. p a lu s t r is N o. 7 and N o. 7 R ub isCO Fo rm I def ic ien t re sp ec t ive ly )(by u sin g vec to r PBR 322, and o b ta ined tw o t ran sfo rm an t s M G 11 and M G 14. T h e re su lt s ind ica te th a t R u b isCO enzym e ac t iv ity o f M G11 an d M G 14 in c rea se 76. 7% and 618% th an ho st st ra in s re sp ec t ive ly, bu t it s p ro te in co n ten t an d gene ra t io n t im e a re gene ra lly sam e. Key word s: gene exp re ssio n ƒrh od op seu d om on a s; R ub isCO ; DN A sequenc ing