基因敲除小鼠的PCR鉴定
一、实验目的,
通过PCR扩增程序及琼脂糖凝胶电泳方法鉴定凝血因子IX基因敲除小鼠的基因型。
二、实验原理,
真核生物的一切有核细胞,包括培养细胞,都能用来制备基因DNA。真核生物的DNA是以染色体的形式存在于细胞核内,因此,制备DNA的原则是既要将DNA与蛋白质、脂类和糖类等分离,又要保持DNA分子的完整。提取DNA的一般过程是将分散好的组织细胞在含SDS,十二烷基硫酸钠,和蛋白酶K的溶液中消化分解蛋白质,再用酚和氯仿/异戊醇抽提分离蛋白质,得到的DNA溶液经乙醇沉淀使DNA从溶液中析出。
1.PCR原理,
PCR技术的基本原理类似于DNA的天然复制过程,其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。PCR由变性-退火-延伸三个基本反应步骤构成, 1)
模板
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DNA的变性,模板DNA经加热至93?左右一定时间后,使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离,使之成为单链,以便它与引物结合,为下轮反应作准备,
2) 模板DNA与引物的退火(复性),模板DNA经加热变性成单链后,温度降至55?左右,引物与模板DNA单链的互补序列配对结合,
3) 引物的延伸,DNA模板-引物结合物在TaqDNA聚合酶的作用下,以dNTP
为反应原料,靶序列为模板,按碱基配对与半保留复制原理,合成一条新的与模板DNA 链互补的半保留复制链重复循环变性-退火-延伸三过程,就可获得更多的“半保留复制链”,而且这种新链又可成为下次循环的模板。每完成一个循环需2,4分钟,2,3小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍
2.琼脂糖凝胶电泳原理,
在pH8.0~8.3的缓冲液中,核酸分子带负电荷,向正极移动。由于不同大小和构象的核酸分子电荷密度大致相同,因此在自由泳动时,各种核酸分子的迁移率相似,无法分开。然而,在浓度适当的凝胶中,由于分子筛效应,使大小和构象不同的核酸迁移率出现差异,从而把它们分开。核酸在凝胶中的迁移率取决于其分子大小、高级结构、胶浓度和电场强度,与分子的碱基组成及电泳温度,4~30?之间,无明显关系。一般说,同样构象的分子迁移率与分子量对数及胶浓度成反比,与电场强度,小于5V/cm,成正比。
三、实验操作
1.获取鼠尾组织
剪鼠尾0.5cm置于试管中,加入500ul裂解液和10ul蛋白酶K(20mg/ml),55?水浴过夜,至鼠尾溶解
2.提取基因组DNA
1) 试管中加入300ul饱和NaCl,充分混匀,12500rpm 离心20min 2) 取上清700ul至新的离心管中,加入预冷的异丙醇700ul,上下颠倒混匀,动
作轻柔,直至看到絮状DNA析出为止
3) 500rpm 离心20min,小心吸去上清
4) 加入800ul 75%乙醇于离心管中,洗沉淀,12500rpm离心10min
5)晾干沉淀,加入100ul的PCR级的水
3.PCR扩增
1) PCR反应体系的建立,
按顺序在0.5ml塑料小试管中加入以下试剂,
2x Mix 10ul
无菌水 2ul
2pmol引物1 2ul
2pmol引物2 2ul
2pmol引物3 2ul
模板DNA 2ul
2) PCR参数的设定:
95?? 3min
95?? 30sec
60?? 30sec35个循环
72?? 30sec
72?? 5min
4.琼脂糖凝胶电泳
1) 制作电泳胶
2) 待凝固后即可上样,注意混匀时枪头不要吸进空气,防止产生气泡,上样时枪头应垂直插入上样孔。
3) 电泳,一般160V约30min,注意胶的位置,不要正负极倒置,电源接通后观察铁丝是否有气泡,
5.成像分析
电泳完后在紫外灯下观察电泳结果并摄像。
四、实验结果
1 2 5 3 4
1、小鼠1为敲除型,KO型,小鼠,其染色体双链均为敲除相关基因后的DNA链
2、小鼠2为杂合型小鼠,其染色体DNA中一条链为敲除了相关基因的DNA链 3、小鼠3为野生型,WT型,小鼠,其染色体双链均为未敲除相关基因的DNA
链
4、Maker.分别显示一定长度的bp碱基电泳后应到的长度
五、实验讨论
PCR法因其具有快速、灵敏、费用低等特点,逐渐取代了传统的Southern杂交,被广泛应用于对基因敲除小鼠基因型的鉴定实验中。但在PCR扩增中,如果实验条件不合适,如引物
设计
领导形象设计圆作业设计ao工艺污水处理厂设计附属工程施工组织设计清扫机器人结构设计
不合理、模板DNA质量不高或被污染、反应体系中各成分因子比例失衡、PCR仪温控不准确、人为操作失误等,都容易导致不可靠或无可重复性的PCR扩增结果。
由于酶量过多或酶的质量差等原因,结果会引起涂状带或片状带,如实验结果中的5。
临床116
2011212015
林森
浙公网安备 33021202002483