中药质量标淮的研究讲义

广州蓝韵医药研究有限公司 中药质量标淮的研究讲义 自1985年药品管理法正式颁布执行,国家药典(以下简称药典)、卫生部标推(以下简称部颁 标准 excel标准偏差excel标准偏差函数exl标准差函数国标检验抽样标准表免费下载红头文件格式标准下载 )及省、市、自治区药品标准(以下简称地方标准)即成为药品生产必须遵循的法定依据;评比国优、部优及省市优级产品,各药品标准及企业内部标准均为重要的依据之一;企业定级与升级也要求产品中质量标准较为完善的要达到一定比例;中成药及制剂出口更亟待以现代科学方法制定标准,便于在国际市场上的竞争;药品标准研究成果并已明文规定纳入国家成果奖励条例,中药标准研究制定工作,已愈来愈为社会所重视。(到目前为止建国以来的第八版2005药典已经出来使用) 目前我国新药的研制,在《新药审批办法》中明确要求要制定临床研究用质量标准及生产用质量标准。目的是保证临床研究试验药品的质量稳定一致及上市药品的质量,从而保证药品的安全和有效。在新药取得批准文号后,其它研究资料如药效、毒理、临床研究资料均已完成历史使命,可存档备用,但唯有质量标难伴随产品"终身"。只要有药品生产、销售、使用.就要有质量标准的监测和保证。因此,质量标准的制定,不仅在研制新药中,而且对老药再评价均具有相当重要的地位。 一、药品标准的定义与要求在《药品标准工作管理办法》总则中规定: 1.药品标准是国家对药品质量及检验方法所作的技术规定、是药品生产、经营、使用、检验和监督管理部门共同遵循的法定依据。 2.制定药品标准,必须坚持质量第一,充分体现"安全有效,技术先进.经济合理则,择优发展的作用。 3.凡正式批难生产的药品(包括中药材饮片及其制剂)、敷料和基质都要制定标准 1 二、质量标准的分类 (一)、法定标准:经过卫生部与省、市、自治区卫生行政部门批准的标难有国家标准,(包括药典和部颁标准)及地方标准。卫生部正在对成药的地方标准经过有 计划 项目进度计划表范例计划下载计划下载计划下载课程教学计划下载 的整顿提高,逐步纳入国家标准.目前已有1600种中成药已分别收载于部颁标准之中。新药被批准后其生产用质量标准再经过二年试行期即直接转为部颁标难。 国家标准对产品的质量指标仅是-些基本要求.是企业应达到的起码合格水平。鉴于目前中药标准一般水平不高,所以应认识到符合低标难的高合格率,并不表示产品先进,故质量标准必须逐步提高,特别是新药的质量标准必须具有国内先进水平,并真正起到控制真伪、优劣的作用。 (二)、企业标准:一般有两种情况,一种为检验方法尚不够成熟,但能达到某种程度的质量控制;-种为高于法定标准要求,主要指多增加了检测项目或提高了限度标准,作为创优,企业竞争,特别是对保护优质产品本身,严防假冒等均为重要措施。国外较大的企业均有企业标准,对外保密。 三、质量标准的特性 药品应具安全性、有效性、稳定性及可控性。而质量标准在保证药品上述性质的同时,其本身又具有如下特性: (一)、权威性:"药品管理法"规定,药品必须符合国家药品标准或省市自治区药品标准。但各国家均不排除生产厂可以采用非药典方法进行检验。例如:六味地黄九的含量测定,药典收载了薄层光密度法测定处方山茱萸中熊果酸的含量,若企业哲无薄层扫描仪,则可采用薄层比色法与其对比,测定结果一致或有一定相关性且稳定,在日常检验中即可采用比色法控制产品质量,但遇有产品含量处于合格边缘,或需要仲裁时,只有各级法定标准,特别是国家药典具有权威 性(现行)。 (二)、科学性;质量标准是对具体对象研究的结果,它有适用性的限制。在药材中如天然朱砂的标准不适用于人工朱砂的标难,前者硫化汞的含量不得少于96%,而后者要求在99%以上;又如牛黄、天然牛黄、人工牛黄和培植牛黄中含胆酸,胆红素的含量要求不同,但均有充分的科学依据。马钱子中士的宁的含量测定,药典收载了双波长紫外分光光度法,而含马钱子的成药九分散则收载了薄层光密度法;又如西洋参的质量标准,进口西洋参与国内引种西洋参质量标准不仅含量限度不同,且测定方法也不同,在未统一标准前,应严格依据各自的标准评价其质量的合格与否。在不同成药中测定某一相同药味成分,不一定方法均能适用,其方法的确定与规格的制订均应有充分的科学依据。 (三)、进展性:质量标准是对客观事物认识的阶段 小结 学校三防设施建设情况幼儿园教研工作小结高血压知识讲座小结防范电信网络诈骗宣传幼儿园师德小结 ,既使法定标准也难免有不够全面之处。随着生产技术水平提高和测试手段的改进,应对药品标准不断进行修订和完善。如大黄的薄层鉴别,85版药典一部收载方法即须以两个溶剂系统:苯一甲酸乙酯一甲醇一甲酸一水〔3:1:0.2:0.05:0.5);己烷一石油醚(60-90℃)一甲酸乙酯一甲酸一水(3:1:1.5:0.1:0.5),展开二次,才能使水解后的恩醌甙元大黄酸、芦荟大黄素、大黄素、大黄素甲醚、大黄酚等五种成分分开;而90版药典一部则改进为只用一种溶剂系统石油醚(30一60℃)- 甲酸乙酯-甲酸(15:5:1,上层)一次展开即可得到分离度好,斑点清晰的薄层色谱(2000版及目前使用的2005版仍在使用该方法)。 又如血竭的质量评价,由于血竭主要成分血蝎素极不稳定,只是根据血竭素的理化性质在270nm处有最大吸收,采用无水乙醇提取,其吸收度高低基本上与传统经验对血竭的外观鉴别质量优劣相一致,制定了一定浓度的血渴无水乙醇溶液在270nm吸收度不得少于一定值的规格限度。由于血竭系进口药材,货源不稳,特别是加工血竭牌号多,质量差异大,若含掺杂物如色素等,难以用吸收度限度判定质量,随着对血竭素的合成成功,以其为对照品,采用高效液相色谱法(2000版及2005版)测定血蝎药材与含有血蝎的成药,均获得满意的结果。 又如川乌、草乌炮制品的质量控制.85版药典是采用薄层色谱法目测检查乌头碱不得超过一定限度。乌头碱为双酯型生物碱,但乌头所含生物碱有单酯型、双酯型、三酯型等多种酯型生物碱均具毒性,为了更好的控制质量,保证服用安全和有效,90版中国药典则改为异羟肟酸铁比色法测定总酯型生物碱以控制质量。95版中国药典在测定总酯型生物碱的基础之上又增加了滴定法测定生物碱, (2000年版及2005版药典同95版药典) 在申报新药中要求的临床研究用质量标准、生产用质量标准以及在标准试行二年转为部颁标准的过程中均可不断补充完善。这是指标准中检定指标专属性可以加强,检验方法考查更加完善,内在质量评价要求更加严谨,限度制定更为合理。但须强调指出的是处方、原料和工艺绝不允许更动。 四、质量标淮制定的前提 标准的制定必须具备以下三个先决条件,即处方组成固定;原料(饮片)稳定;制备工艺 稳定。 (一)、处方组成固定;处方药味及份量是制定质量标难的依据,直接影响评价指标的选定和限度的制定。因此在制定质量标准之前必须要求毫无保留、确实无误的处方才可开始进行质量标准的研究和实验 设计 领导形象设计圆作业设计ao工艺污水处理厂设计附属工程施工组织设计清扫机器人结构设计 。 如传统成药香连九,存在数种处方: 1.黄连(吴茱萸制) 木香 2.黄连木香白芍延胡索(醋制) 吴茱萸(甘草制) 3.木香黄连〔酒制) 吴荣英(盐制) 槟榔苍术(炒) 枳壳(炒) 厚朴(姜制) 白芍(酒制) 陈皮茯苓泽泻甘草 如以处方3为依据,至少需选木香、黄连、厚仆、陈皮等药味建立鉴别项目,以此建立的标准不适于检验处方1的成药,如以处方2为依据建立的标准检验处方3的成药,即检个出延胡索,又不能反映处方3含有药味的特点。如测君药黄连中生物碱的含量,其在处方中的比例悬殊,含量限度也有明显的不同。 (二)、原料稳定:药材陈药用部位,产地、采收和加工涉及质量优劣外,特别要注意的是药材的真伪与地区习惯用药的鉴别与应用。 药材的真伪与地区习惯用药的鉴别与应用。 1.对贵重药材及常用紧缺药材,要加强真伪的检验,最好备有标准药材对照品。 如西红花(番红花)为贵重药材,多系进口,目前国内也引种成功,分生晒品与加工品两 种规格。由于价格昂贵,往往有伪品出现。如鸡牛牌红花,系印度西萌草茵染上胶汁制成;有的用莲须、黄花菜切丝染色;也有用化学纸浆做成丝状,包层淀粉并染成红色;还有用西红花的雄蕊染色,或用国产菊科红花冒充,加工西红花也有掺硼砂或甜味物质以增加重丝的,均应注意鉴别。 熊胆也为贵重药材之一,进口商品的质量一般与国产品基本一致;目前多处研制引流熊胆(又称熊胆粉)成功,以检出是否含有熊去氧胆酸是为主要鉴别特征。商品中常有猪、牛、羊胆和其它胆汁混入熊胆,应注意鉴别。 又如黄芪,因其为常用中药,应用面广,用量大,又多为成方制剂中的君药, 应注意鉴别。常出现的伪品有紫苜蓿、兰花棘豆、锦鸡儿及锦葵科植物圆叶锦葵、欧蜀葵等,这些伪品性状与正品黄芪类似,常混入或伪充黄芪药材商品,严重影响中药材质量。 又如动物药金钱白花蛇,为祛风湿通经活络的常用中药。近年来由于用药量不断增加,供不应求,伪制品时有出现,一般可分为两类:一类为银环蛇,蛇身经剖割加工后,拼接游蛇科动物中国水蛇、铅色水蛇、渔游蛇的蛇头伪制而成;一类是以其它具有横纹的蛇伪充。如金环蛇、赤链蛇、白环蛇等经加工的干燥体,均应注意鉴别。 2.地区习惯用药,系指药材在局部地区有多年生产和使用习惯的药材品种。但由于集市贸易购销,管理工作末跟上,有的未按卫生部(87)卫药字第(35)号文"地区性民间习惯用药材管理办法"执行,致使没有使用习惯的药材购人。这类品种在常用500种中药中,大约占1/3~l/4的数量,应引起重视。 如山豆根,多数地区所用山豆根为豆科植物越南槐的根及根茎,习称广豆根,但在东北、华北地区则习用防已科蝙蛾葛的根茎,又称北豆根。八十年代中,华北曾大量应用感冒汤防治流感。由于广豆根中苦参碱含量远高于北豆根,按刁用北豆根量投入广豆根,从而引起一、二百人出现中毒症状。 又如贯众,为常用中药。在地区习惯用药中,居于品种来源极其复杂的代表性品种。据统计约有9科17属49种和变种,给中医临床用药的准确性带来很大困难。近年来卫生部组织药检系统对其进行攻关研究,就其中使用地区面广、量大的主要品种进行本草考证,植物、生药、化学、药理等方面系统研究,结果表明,东北、华北等用的鳞毛蕨科植物粗茎鳞毛蕨带叶柄基的干燥根茎,确实含有驱绦虫的活性成分一东北贯众素,含量高达 2.15%,有较强的驱绦虫、免疫抑制作用,以绵马贯众之名做为商品使用。华东、中南、西南等地习用的紫萁科植物紫萁.药用部位同上,有较明显的抗流感病毒作用和止血作用,称紫萁贯众。另外乌毛蕨科植物苏铁蕨分布于福建、两广,常调往上海、天津、河南、武汉、 甘肃、青海等地,它有较强的抗菌驱虫作用。其它如乌毛蕨、狗脊蕨、荚果蕨等分布与使用地区均较窄,药理活性也不及以上各种。 又如成药木瓜九,其处方含木瓜、当归、川芎、白芷、狗脊、牛膝、威灵仙、鸡血藤、海风藤、人参、川乌、草乌等药味,其中红颜色的药味均有地区习惯用药,如木瓜:木瓜、木桃、西藏木瓜等;狗脊:狗脊、黑狗脊;威灵仙:威灵仙、棉团铁线莲、革叶铁线莲、短梗菝葜;牛膝:牛膝(怀)、川牛膝、狗筋曼、脉毛马兰;海风藤:松萝、木通、异型南五味子等均有不同品种和不同地区的使用习惯,在日常药用中应注意鉴别,在研制新药时,由于处方来源于多种渠道,更应密切注意处方中各药味系指何品种,确定后,必须取材稳定,才能保证临床试验取得应有的疗效.在批难生产后,更应注意药材品种来源,以保证上市产品用药安全和有效。 3.工艺稳定:新药的研制在处方确定以后,结合临床服用要求,确定剂型,进行工艺条件的研究,优选出最佳工艺条件,至少是适合中试生产规模,条件具备后,才可进行质量标准的实验设计。因为尽管处方相同,而工艺不同,致使所含成分不同,直接影响鉴别、含量侧定等项目的建立和限度的规定。 如复方柴胡注射液(柴胡、独话、细辛)常见的工艺有二种:一种即以药粉加水,以水蒸 气蒸馏,馏液直接药用,其性状为无色澄明,只含有挥发性成分。 一种系药粉经蒸馏后,馏液备用;药渣再加水煎煮,煎液再经醇沉处理,去醇后,加水溶解,水溶液与馏液合并制成注射液.其性状为淡棕色,不仅含有挥发性成分而且含有柴胡皂甙等水溶性成分。 以上二种工艺,成品所合成分不同.质量标准中鉴别项目的确定,与含量测定指标成分及限度的规定可完全个同,是可以一目了然的。 但有些产品工艺对质量的影响不易察见,稍一疏忽,即可造成质量差异。加丹参注射液的制备,一般采用水煎醇沉反复二次,通过研究对比.工艺I第一次醇沉使乙醇浓度达到75%,二次达85%;工艺II第一次醇沉达60%。二次达80%,二种工艺醇沉浓度仅相差5~10%。而水溶性有效成分丹参素含量前者为4.8mg/ml,而后者为5.8/ml,相差近20%之多。 在制剂工艺中各环节均可对内在质量产生影响,甚至不同的干燥方法。例如对复方何首乌制剂中所含大黄素、二苯乙烯甙和槲皮素的影响.其被破坏的程度根据不同的干燥方法依次为:冷冻<喷雾<减压干燥<远红外<常规方法。 见表4。不同干燥方法对复方何首乌制剂成分的影响 冷冻喷雾减压干燥远红外常规方法 大黄素(×10-6) 9.1690 9.0871 5.3792 3.8825 1.1163 二苯乙烯甙(×10-5) 8.7843 7.6785 3.5455 1.1721 0.6170 槲皮素(×10-5) 6.6470 6.3631 5.4190 5.5904 0.4712 药材原料的炮制方法不同,也会对质量有明显的影响.如雄黄粉碎条件不同,其颗粒大小及可溶性砷盐含量不同,前者为打粉>干研>加水球磨>水飞;后者含砷量则加水球磨>打粉>干研>水飞 受热温度对其产生严重影响,如: 加水球磨---水洗----低温干燥---细粉,其粒度近水飞,可溶性砷盐含量低 加水球磨----80℃干燥----细粉,可溶性砷盐增加4倍。见表5(略)。此外还有很多处方、工艺方面的环节都影响药品的质量。 综上所述,在制定质量标准之前,必须强调处方、原料及工艺三固定,只有在这样的前提下制定质量标准才能真正反映该药品的质量,药品也才能保证应有的疗效。 五、质量标准的内容 目前国内外中药或天然药物质量标准的内容,药材一般包括名称.基源(科、属、种、拉丁学名).药用部位,采收加工.性状(外形、质地、嗅味),鉴别(传统经验、显微、理化),检查(杂质、水分、灰分、酸不溶性灰分等),浸出物,含量测定(挥发油、各种活性成分等),炮制,功能主治(效用),用法用量,注意,贮藏等。 在成药和制剂中,除上述项目外.还须规定处方,制法,检查项中还包括重金属、砷盐并结合不同剂型在药典附录通则中的各项检查如重量差异、均匀度、崩解度、溶散时限等项。 本次重点讨论中成药质量标准研究,依次对有关项目,结合本身特点及当前存在问题 进行讨论。 (一)名称 药品的命名,实为一种艺术.即要能反映出该药的特点,对病人有强烈的吸引力,还要不落于俗套或对病人服用产生副作用,名称不恰当有时还会影响销路。命名总的要求应是明确、简短、科学,不容易混淆、误解、夸大的名称,属于国家标准(药典或部颁标准)收载而改变剂型的品种,除剂型名应更新外,原则上应采用原标准名称。 1.单味制剂(含提取物)一般采用原料(药材)名与剂型名结合,如穿心莲片、绞股蓝皂甙片等 2.复方制剂 (1)方内主要药味缩写加剂型,如参巧片、葛根斗连胶囊、银黄口服液。 (2)方中主要药味缩写加功效加剂型,如银翘解毒冲剂、参附强心丸、桂龙咳喘宁胶囊。 (3)药味数与主要药名或功效加剂型,如十全大补口服液、六味地黄丸。 (4)功效加剂型,如妇炎康复片、通脉冲剂、胃乃安胶囊、镇脑宁胶囊。 (5)君药前加复方,后加剂型,如复方天仙胶褒、复方丹参注射液。 在传统中成药中有采用方内药物剂量比例加剂型命名的,如六一散;以服用剂量加剂型命名的,如七厘散、九分散;采用象形比喻结合剂型的,如玉屏风散;以药味采收季节加剂型命名的,如二至九,即女贞于冬至采收而早莲草夏至采收等。还有我们的四季感冒片是按什么命名的? 不宜采用的命名法有: 不以主药一味命名,易与单味制剂混淆;不以人名、地名或代号命名,不用××灵;××宝,陷于俗套;还应注意剂型名称与实物相符,更不宜以中西不同理论功效混杂命名等 (二)处方,质量标准中处方形式多种,有以净药材或饮片处方,如天麻九: 天麻60g 羌活100g 独活50g 杜仲(制)50g 牛膝60g 荜薢60g 附子(制)10g 当归100g 地黄160g 玄参60g 以粗提物处方,如复方川贝精片: 麻黄膏适量 桔梗75g 半夏(制)60g 川贝母20g 远志42.8g 五味子42.8g 陈皮75g 甘草膏12g 以有效部位(组分)如总黄酮、总皂甙、挥发油等处方,如北豆根片: 北豆根总碱150g 淀粉1000g 硬脂酸镁100g 以化学成分单休处方,如穿心莲内酯片: 穿心莲内酯500g 微晶纤维京125g 淀粉30g 二氧化硅20g 滑石粉15g硬脂酸镁10g 无论何种处方,均应符合以下要求: 1.处方药味若属国家药品标准收载品种,名称均应与其一致,如淫羊藿不应称仙灵脾、金银花不应称双花,黄芪不应称北芪等。 国家药品标难未收载的药材品种,可采用地方标准收载的名称。 地方药品标准收载的品种与国家药品标准名称相同,来源不同的应另起名称 2.处方药味排列顺序,应根据处方原则,按君、臣、佐、使排列,或主药、辅药排列。 3.处方中有需要炮制的药味,应加括号注明,如蜜黄芪,应为黄芪(密制)。 4.处方中药味均用法定计量单位。重量以"g",容量以"m1"表示;处方量多根据剂型不同,如片剂折算成出1000片的药量,液体制剂如糖浆以出1000m1的药量写出。以求按药典标准 规范 编程规范下载gsp规范下载钢格栅规范下载警徽规范下载建设厅规范下载 化要求。 5.处方原料均应附标准,药材标准:包括其基源名称及科、属、种拉丁学名;确实的主要产地;药用部位等均应反映原料的实际情况,并说明届何级法定标准(药典、部颁、地方标准)收载者。 如成药中收载的检验项目归属于某药味,而该药味品种虽收载于法定标准中,但未列入该检验项目的.应补充有关项目。如处方中有灵芝,成药标准中收载了灵芝的含量测定,而药典虽收载了灵芝药材标准,但未规定含量测定项日,则应在原料灵芝药材标准中建立灵芝粗多糖含量测定项目,并制定规格限度,目的为保证成药质量,以防盲目投料。 有些成药确因处方药味多。干扰大,或拟测定药味含量极少,而不属于实验设计不合理 操作技术问题所致,含量测定确实困难或成药未收裁含量测定项,有的仅收载了浸出物含量,可以暂时原料药材(主药之一)规定含量测定项目,间接控制成品质量。 原料为粗提取物、有效部位或化学单体,均应制定相应的原料标准。应说明其主要质量指标。 如原料为地方标准,则应提供标准全文复印件。 如原料在各级法定标准中均未收载,除应按《新药审批办法》行关规定提供申报资料外,应参照药材申报资料要求制定质量标准。 6.如处方原料为药材,而制剂由粗提物(浸膏)等制成,则浸膏制法及要求做为半成品规定,记述于制备工艺中,不作为原料要求另附标准。 (三)制法 传统中成药的制备工艺除一些品种如龟龄集、片仔癀等有其独道之处,一般蜜九、水丸、散剂、膏剂等,只要处方公布,机密即泄漏无遗,凡中药厂均可生产。随着我国市场的开放,人民生活水平口益提高,对服用药品的要求更趋于疗效高、剂量小、服用方便的途径发展,在当前国际贸易往来频繁,医药工业生产设备更新换代,在研制新药中那种-次设计,一次试验,一次成功"的生产工艺,确实难于制出优质良药。因此在"中药新药审批办法《有关中药部分的修订和补充规定》(以下简称《补充规定》)中已明确增加了4号申报资料即制备工艺及其研究资料的要求。 首先须写明工艺的全过程,工艺的技术控制条件(方法、时间、温度、压力)及理由;工艺分工序中间体的质量检测要求如相对密度、指标成分含量等;优选工艺的详细对比数据,定最作工艺的依据。并附工艺流程图。 工艺中应注意的几个问题: 新药申报时应提供至少为中试以上规模的工艺条件,中试是介于生产规模与实验室规模之间的一种工艺研究的实践,中试不是实验室规模的简单放大,而是生产模式在数量上的缩小。中试使用的设备在性能上和生产设备相一致,如果中试的数量与生产数量差距太大,中试时就不容易发现在大生产时所产生的问题,有些研制者,在申报生产时仍为医院制剂室的实验室工艺;则很难过渡到大牛产,如此时再将工艺做较大的更动,则申报临床前的实验研究工作,如药效学、毒性及质量标准则必须在新的工艺基础上重新进行。 有的工艺不尽合理,未能针对中药的主要成分性质设计工艺条件,如含大量挥发性成分未经蒸馏加入,而在高温长时间浓缩中损失;又如水煎醇沉工艺,乙醇浓度过高,致使有效成分沉淀损失以及过多的采用毒性大、成本高的有机溶剂提取等。 在质量标准中制法项可简要概括记述工艺全过程,对质量有影响的关键工艺的技术条件,可参考药典收载同剂型制剂制法记述。 (四)性状 从制刑外观反映产品的质量,包括形、色、气、味。 (五)鉴别 1.鉴别药味的选择:复方用药为中医药特点之一,处方药味从两三味、十余 味至几十味,一般未要求逐个进行鉴别。根据中医药理论,依处方原则首选君药与臣药进行;贵重药虽量少,但有时起重要作用,加强质量监督也是很必要的;含毒剧药物也须鉴别,更须规定含量或限度。选择鉴别药味也应结合药物本身的基础研究工作情况,如其成分不清楚,或通过试验摸索干扰成分难以排除,则也可鉴别其它药味,但应在起草说明中写明理由。如为单方制剂,成分无文献报道的,应进行植化研究,搞清大类成分及至少一个单体成分,借以建立鉴别及至含量测定项目是完全必要的。 个别研制报告反映出着手研究质量标准时,不是首先认真查阅文献,收集资料,并根据上述原则重点选择鉴别对象,而是将处方中十数药味,均从化学预试开始,实验结果有数种药味均有同类成分反应,如具盐酸镁粉的黄酮反应,而即选此试验列为鉴别项目之一,其选定原则以多取胜,而非强调鉴别试验的专属性。如具相同反应的数味药.只投其中一味,仍为阳性,达不到控制质量的目的。 2.鉴别方法:鉴别一般包括显微鉴别,一般理化鉴别及色谱鉴别和其它。 (1)显微鉴别主要通过动植物组织细胞或内含物的形态鉴别真伪,对含有原生药粉的成药或制剂仍然占有重要地位,具有快速、简便覆盖面大的特点。有些成分不清楚或化学测定干扰较大的药味也需要进行显微鉴别,研究时需根据处方中药味逐一分析比较,排除类似细胞组织和内含物的干扰,选取各药味在该成药中具有专属性的显微特征作为鉴别依据,所收载的特征必须明显、易察见。 对掺伪品的鉴别,显微鉴别与化学鉴别必须密切配合,起到相捕相成作用,如麝香、牛黄等鉴别即是。(半夏与法半夏) (2) 一般理化鉴别对于某些显微特征不明显、药粉过细或成药中越来越多的原粉药材以浸膏代替,改变剂型以减小剂量的情况,均应以化学方法进行鉴别。采用一般理化鉴别试验应针对有文献报道的已知化学成分,而不能建立在化学预试的基础上,方法应以专属、灵敏、简便、快速,并强调重现性好为原则。一般 有荧光法、显色法、沉淀法、升华法、结品法等。由于复方制剂常出现干扰,应反复验证,更应做阴性对照试验。 对于泡沫反应、生物碱试剂沉淀反应、三氯化铁试液显色反应等,因植物中类似成分多 白质、大分子杂质和含酚经基的成分均较多,尤其在复方中,必须注意防止假阳性误判,(3)色谱鉴别指薄层色谱、气相色谱和液相色谱对中药进行真伪鉴别。 薄层鉴别有广阔的前途,应大力开展,各国药典收载天然药物及制剂采用TLC 法,就其与收载品种之比超过50%的即有德国、法国、英国、瑞士及欧洲药典得.日本药局方1992年版在收载不到200个品种中,近50种收有TLC鉴别方法, 85版中国药典共收载TLC鉴别法70种.但因收载中药品种多,基数大.只占10.6%.而90版药典则增加为161种。占总品种个数20.5%;2000版药典增加为458种,高达75%;2005版药典增加为1532种,薄层鉴别可以在-块层析板上容纳多个样品及出现多个信息(斑点数量、位置、色泽等).这适合于天然药物,特别是中成药组成成分复杂的情况,它具有分离和鉴定的双重作用,只要一些持证斑点(甚至是未知成分)具有再现性,就可以作为确认依据。薄层分析可以鉴别真伪、区别类同品、控制微量成分的限度(如剧毒药),并对某些不同检测要求(如鉴别、检查)项一次完成。试举以下诸例: 可以特征成分鉴别药材,如党参(潞党)的鉴别,以党参苷I为对照品,将供试液点于硅胶GF254层析板上,以正丁醇一36%醋酸一水(7:1:1)为展开剂展开,取出,晾干.置254nm紫外灯下检视.供试品中在与对照品相应位置上显相同颜色斑点。 ②可区别异构体.如冰片所含龙脑与异龙脑,以龙脑与异龙脑为对照品。将供拭品与对照品点于硅胶G板上,以石油醚一醋酸乙酯(85:15)为展开剂,展开, 取出,晾干,以5%香草醛-硫酸显色,加热5~10分钟,于日光下观察.供试品色谱中,在与对照品色谱相应位置上,显相同的红色斑点 ③可鉴别真伪,如以西洋参的薄层鉴别试验检出"洋参九"中掺有人参,因人参含有人参皂苷Rf,Rg 1,Rb 2,Rb3,而西洋参不含此成分,借以检出掺伪人参。 ④可以区别不同药用部位,如人参须含人参总皂苷高于主根已为众所周知,但其所含皂苷成分的比例有所不同:人参主根与须根所含单体皂苷的分布及比例有显著差别,最明显的是人参主根中人参皂苷Rbl含量比须很高,人参皂苷Rd在须根中含量较高,即一Rbl与一Rd的比例在主根与须根中恰好倒置。一Rb x是C一20位有两分子糖,生物合成过程较长,则一Rd由(c一20连-分子葡萄糖)变成一Rbl需要较长的时间积累,而须根生命周期(挖掘前)比主根短,所以其一Rbl含量比主根低得多,而这种差别也有助于说明中医临床经验认为须根不如主根的作用。指纹图谱中人参皂苷Rbl及Rd的比例可以清楚地区别人参主根、须根,从而反映药品中人参投料的情况。 ⑤可鉴别未知成分,如五子衍宗丸胶囊的鉴别,说明只要薄层色谱可以重现,即使有些成分未知,也可作为鉴别的方法 6可同时鉴别多个药材的多种成分,充分发挥了薄层色谱专属、快速、简便的特点。 如复方酸枣仁口服液中同时鉴别人参、淫羊藿、酸枣仁所含多种苷类。取样品适量,以正丁醇提取,蒸干后用甲醇定容,作为供试液。以人参皂苷Rg1、Re;淫羊藿苷及酸枣仁皂苷A为对照品,将供试品与对照品溶液分别点于同一硅胶G 薄层板上,以氯仿-甲醇-水(65:35:10)下层为展开剂,展开,取出,晾干,以10%硫酸乙醇液显色,供试品色谱中,在与对照品色谱相应位置上显相同的斑点,人参皂苷Rg1、Re斑点为紫红色,淫羊藿苷斑点为棕黄色,酸枣仁皂苷为黑紫 色,阴性对照无干扰。 结肠透析液中同时鉴别大黄蒽醌类成分与川芎内酯类成分。取样品适量,以醋酸乙酯提取。蒸干后用甲醇定容作为供试液,以大黄药材或大黄素、大黄酚与川芎药材为对照品,制备对照品溶液,将供试品与对照品分别点于同一硅胶G 薄层板上,以石油醚一醋酸乙酯(1:1)展开,取出,晾干,于365nm紫外灯下检视,供试品色谱在与对照品色谱相应位置上川芎呈蓝色焚光斑点,大黄素、大黄酚显棕红色,氨气黄后变粉红色。决明子、何首乌与独话、羌活等同时存在,也可以上法鉴别,可得优质的薄层色谱。 复方五味子冲剂中同时鉴别甘草中甘草酸与五倍于中没食子酸。样品以乙醚脱脂后,以氨性甲醇提取,制备供试液,以甘草酸铵及没食子酸为对照品,将供试品与对照品溶液分别点于同一硅胶G薄层板上,以醋酸乙酯一甲酸一冰醋酸一水(30:2:2:4)展开,以10%硫酸乙醇溶液显色,于365nm紫外灯下检视,供试品色谱在与对照品色谱相应位置上显相同颜色的斑点。 气相色谱适用于含挥发性成分的鉴别,如90版药典收载伤湿止痛膏中鉴别冰片、樟脑;2000及2005版药典中又增加为鉴别冰片、樟脑、薄荷脑、水杨酸甲酯四种成分,也可结合含量测定进行,如牛黄清心九中检麝香酮等。 液相色谱也可应用,如葛根汤中鉴别麻黄生物碱类,多结合含量测定进行,很少单独用于鉴别试验。 (4)其它如光谱鉴别,紫外或红外光谱等。对同一品种药材采用适宜溶剂提取,测定紫外或红外光谱有时可得重现性光谱图,特别是红外图谱吸收峰提供信息多,更有鉴别意义。如树脂类药材血竭、乳香,甚至动物药牛黄、矿物药石膏、胆矾的鉴别等。又如可以紫外光谱鉴别西红花。 但复方制剂多味药多组分吸收峰叠加或抵消,难以作归属分析,专属性及重 现性等存在问题,目前也有作为内控指标,对于工艺、投料的监测,假冒、伪劣产品区别,均可起到一定作用。 以上各类鉴别方法均可应用,对成药中一种药味的鉴别,一般建立一种鉴别方法,不必过多重复,但有时也需要采用显微与理化方法结合鉴定以判断真伪。如检燕窝掺伪品,采用裂解气相色谱法,可以燕窝特征峰鉴别,但掺伪物含正品,也可捡出此峰,结合显微鉴别则可检出掺伪物如猪皮屑、琼脂、银耳等。又如麝香,只以麝香酮鉴别甚至定量,均难以判定真伪,田天然麝香含麝香酮幅度很宽,可由0.5~5%或更高,在部颁标准中规定其含量限度应不低于1.55%,麝香掺伪50%,如麝香酮的含量仍在合格范围内,结合显微鉴别,不但可检出是否掺伪,且能鉴别掺伪物如鱼松、蛋黄等。 有些药材虽具备组织细胞应有的显微特征,但有的已作了手脚,如提过人参皂苷的人参,熬过山楂汁的山楂片,煮过的鹿茸片渣等,同时须进行理化鉴别甚至含量测定。 3.实验设计中的有关问题 (1)提取纯化问题:色谱技术虽均具分离与鉴定的双重功能,且薄层色谱对样品的纯化程度要求较低,但由于中成药成分复杂.干扰较大,难以得到理想的分离效果,且有时被测成分含量极少,甚至难以检出和辨认。因此在层析之前,采用化学方法提取纯化至关重要,不仅除去干扰杂质,而且使被检成分浓度相对提高,从而可得清晰的色谱图。 提取纯化的方法较多。根据不同制剂的特点及被检成分的性质,将目前常用的前处理方法归纳如下,①选择适宜的溶剂直接提取(固体剂型)或萃取(液体剂型)。采用单一溶剂提取,如黄连、黄柏以甲醇直接回流提取,鉴别小檗碱;马钱子以氨性氯仿直接超声提取.鉴别士的宁、马钱子碱;羌活、血竭以甲醇提取,鉴别羌活醇、血蝎素;丹参以氯仿直接提取,鉴别丹参酮IIA,以酸性乙醚提取、鉴别原几茶醛、原儿茶酸及丹参素;山植以醋酸乙酯提取,鉴别有机酸;白术、 苍术、砂仁、豆蔻等以石油醚、正己烷或乙醚提取,鉴别所含挥发油等。也有用水为溶剂直接提取芍药贰或碱水提取甘草酸的。 在一个成药中结合有些药味所含成分的性质,采用石同极性的溶剂,依次分离提取,可得较好的分离效果。如龙胆泻肝九,先以正己烷提取,鉴别当归(内酯类成分);继以丙酮提取,鉴别关木通(马兜铃酸);再以甲醇提取经氧化铝小柱,用甲酵冲洗,鉴别龙胆(龙胆苦苷),即能依次鉴别多种成分,又可使各供试液达到净化的目的。 又如国公酒,除醇加水溶解,以乙醚提取鉴别佛手;继以醋酸乙酯提取鉴别橙皮苷,再以正丁醇提取鉴别牛膝中齐墩果酸;最后水溶液再经处理鉴别辛弗林,如不经以上诸步化学分离,单靠层折则难以获得清晰的色谱。 ②对蜜九的前处理由于样品不易粉碎,有机溶剂难于直接提取,可先将蜜丸剪成小块,分步置乳钵中采用套研法,随加入分散剂如硅藻土、硅胶、石英砂等研磨,使分散成颗粒,过筛使均匀,也可进行定量试验,将样品与分散剂配比称量,研匀后精密称重取样计算,如上继续采用适宜的溶剂提取。如疏风定痛丸,以氨性氯仿提取,鉴别马钱子中士的宁;乌鸡白风九以氯仿或二氯甲烷提取,鉴别丹参酮IIA;十全大补丸以乙醇提取,鉴别芍药苷;归脾九以正己烷提取,鉴别当归内酯等。 但须注意,因硅藻土等均具有一定吸附性能,在定量试验中若回收率低,则不能采用。如六味地黄九,中国药典90版一部收载方法即采用水溶除蜜,过滤,使药渣干燥后再用有机溶剂提取山茱萸中熊果酸的方法,曾采用加硅藻土制成细粒后提取对比。回收率低于90%。但以水除蜜,只测定脂溶性成分才可采用。95版药典中采用以水除蜜的方法测定山茱萸中熊果酸,2000版药典采用以水除蜜及加硅燥土的方法测定,2005版为减少硅藻土的吸附用50%甲醇提取,过柱的方法测定山茱萸中熊果酸的含量,使擦诶多能工结果更加准确、可靠。 3大复方中挥发性成分的分离 微量升华法:取适量样品,进行微量升华,将内径约1.5cm,高约0.7cm金属圈置金属片上,将供试样品置圈内,上盖一载破片,以酒精灯缓缓加热,取载玻片滴加适量丙酮溶解,作为供试品溶液。如检麻黄碱,样品以10%氢氧化钠溶液湿润后再加热升华。 亲脂性溶剂提取法;取样量小,简便易行,但净化程度不及升华法和蒸馏法,适用于处方药味少的制剂。 挥发油测定器蒸馏法:不仅可用于多种成分的定性,并适用于定量方法的前处理。即将蜜丸(约两丸)剪碎,加水20m1研细,移入圆底烧瓶中,再加水适量与玻璃珠数粒,混匀,连接挥发油测定器,自测定器上端加水至刻度,并溢流入烧瓶时为止,再加入正己烷(苯或石油醚(60~90℃)1.5~2m1,连接回流冷凝器,加热至沸,并保持微沸2h,放冷,分取正己烷层,以无水硫酸钠脱水作为供试品镕液。90版药典通宣理肺丸中鉴别紫苏即用此法。如用于定量,则须精密加入正己烷,以加入毫升数计算结果。也可取正己烷部分定容于容量瓶中,用溶剂洗涤测定器,减少微量正己烷与水混合后体积损失造成的误差。曾用此法测定牛黄清心丸中麝香酮与冰片获得成功。 ④检定甙元类成分在鉴别试验中,将样品先置于乳钵中加酸研磨,后取上溶液再加热回流,用适宜溶剂萃取制备供试液。如90版药典收载龟龄集、定坤丹检人参二醇、人参三醇即是(2000年版中该方法已改为测定人参皂苷Rg1、Re、Rb1),或将样品经适宜溶剂提取后加酸回流水解。再以溶剂萃取,如大黄检蒽醌类成分;知母检菝葜皂甙元,如用于定量,只能用后者。 5含生物诚类(季铵碱除外)、酚类及有机酸类成分主要是利用生物碱、酚、有机酸类等特有的性质,对样品进行纯化,方法有两种: 先用极性溶剂提取,回收溶剂,残渣以水溶解,调节不同pH后,再经有机溶剂萃取纯化,即采用液液萃取法。如含生物碱样品用甲醇或乙醇提取,蒸干,用2%盐酸溶解残渣,碱化至pH9,再用氯仿萃取后制备供试液。 另一种为碱化或酸化使成分游离,用有机溶剂提取,再用酸碱进一步处理净化。如测马钱子中士的宁,先用氨性氯仿浸提,以酸水萃取士的宁,再经碱化,以有机溶剂萃取士的宁,制备供试液;对酚、酸类则与生物碱性质相反,利用其在碱水中成盐,而酸化后溶于有机溶剂的性质,纯化除去杂质,如分离丁香酚,丹皮酚、柠檬酸、琥珀酸、大黄酸、胆酸等,只是对酚类须用强碱而酸类用碳酸氢钠即可。 ⑥对某些成药中杂质如油脂、蛋白、氨基酸或色素等,或有些杂质性质不清楚,但往往造成薄层背景深(特别是以硫酸显色),有时虽可辨认斑点作鉴别试验,但定量无法进行。可以碳酸镁、硅藻土等将固体制剂或提取物共研拌匀,或将液体制剂吸附,拌匀,采用固液萃取。也有将提取液通过小柱,如氧化铝、活性碳(或二者按一定比例混合应用)、硅胶、聚酰胺、大孔吸附树脂柱等,目前常用的还有化学键合相小柱加硅烷化硅胶小住(C-8,C-18小柱),氨基键合相预处理柱、腈基缝合相小校等。 如药典收载黄连测总生物碱均通过中性氧化铝柱;复方桅子冲剂测桅子苷通过中性氧化铝与活性碳(2:0.5)混合小柱;复方金钱草冲剂鉴别金钱草中黄酮成分、黄芩中黄芩苷及陈皮中橙皮苷过聚酰胺小柱;国公酒中鉴别辛弗林通过732型氢型阳离子交换树脂柱等。但用氧化铝须注意粒度以100一150目为宜,过细极难滤过;活性碳可用柱层折用规格,也不可过细或量多.否则在去除杂质的同时,被检成分也因吸附而损失。 用石油醚、乙醚、己烷等除去制剂赋型剂中的油脂,如牛蒡子等种子类药材所含脂肪油的处理;用甲醇或乙醇沉除液体制剂中的蛋白,如以高效液相法测王浆制品中葵烯酸的前处理即加甲醇离心;人参、西洋参、黄芪等自身含较多的氨 基酸成分,在正丁醇提取后,以氨水或碱水萃取,可达净化的目的。 其它影响背景深的因素 有些因索并非来自杂质,而是层析条件引起。为增加薄层板的硬度便于定量点样,或色谱分离时需要采用含羧甲基纤维素钠为粘合剂的硅胶板.如以硫酸为显色剂,经加温后, 变灰至灰黑色,可将羧甲基纤维家钠溶液浓度降低至0.1%以下,控制加热温度和时间,从而可以得与硅胶G板相同的效果。 对某些显色剂如稀碘化铋钾鉴别生物碱、印三酮鉴别氨基酸或肽,或用指示剂鉴别有机酸等成分,展开溶剂必须完全挥干后才可喷用,否则背景深,反差小,无法测定含量。 7对于含乙醇的酊剂、酒剂甚至口服液均应将乙醇挥去,或彻底蒸干,以适宜的溶剂萃取或提取。如复方人参酊去醇后,以氯仿提取检丹参中丹参酮IIA;阳威药酒去醇后,以甲醇定容,即可进行补骨脂素的薄层鉴别试验。 以上方法有时尚须综合应用,单靠一种手段往往不能达到净化的目的。但也有由于制刑工艺纯化步骤较多,也可直接做为供试液做色谱分析的。如云香精、正骨水中测冰片,藿香正气水中测厚朴酚,某些注射剂测挥发性成分等,均可以气相色谱法直接进样测定。 (2)层析条件的选择:层析技术在一些专著与文献中均有详细论述,仅结合新药质量标准中主要对薄层鉴别中要求与注意问题讨论如下: ①新药经批准生产,质量标难试行两年后即转为部颁标准,因此在检验方法的选择上,首先即应考虑规范化问题,与发表学术论文的要求不同。如新药欲检 成分的鉴别药典已有收载,则应先采用与其相同层析条件,如不能适用,再研究选用另外方法,一般要求展开剂至少选两种极性相差较大的溶剂系统,择优收入员量标准正文中。 ②对显色剂的选择应灵敏并具专屑性。如紫外光灯下观察荧光;硅胶GF254板观察暗斑;或以硫酸、磷钼酸显色,虽具一定灵敏度,但专同性不强,如有化学对照品尚可行,以药材对照品对照,层析色斑众多,但不能说明鉴别成分性质。加以稀碘化铋钾试液、印三酮溶液或三氯化铝溶液等专属性显色剂,可依次说明其为生物碱、氨基酸、肽类或黄酮类成分特征。 ⑤鉴别试验必要时尚须取同类品或同类其它种药材作平行试验,如党参(潞党)中化学成分党参苷I的鉴别,应认为专属性很强,但同属其它党参有的也含有,对常见的伪品如羊乳等也应比较鉴别,防止出现假阳性。 ④色谱鉴别必须采用阴性对照虽己为众所周知,但往往仍有忽视者,甚至在建立定量方法时,一系列方法学考察试验均已完成,却未做阴性对照,恰有干扰,则前功尽弃。 (3)色谱试验对照品的选定:由于受目前层析条件标准化程度的限制,进行此项试验时须选用对照品鉴别。 ①对照品种类及其使用方式A.以化学成分单体对照如中国药典90年版一部附录67页即收载化学对照品100种,应用于药材及成药的鉴别与含量测定。但尚须研制更多的对照品,以利新药的开发和老药的质量再评价。2005版药典中收载对照品282个,比2000年版新增对照品数90个,收载对照提取物11个)例如: 麝香中甾体激素的鉴别。取麝香粉末少许,用少量乙醚于室温浸泡过夜,取上清液点于硅胶G薄层板上,以苯一乙醚(1:1)为展开剂,展开约12cm,取出 晾干,喷5%香草醛-硫酸显色剂,100℃加热10分钟,观察,色谱斑点清晰可见。麝香雄甾烷类化合物的定量也可采用高效薄层方法进行。 B.用提取物对照如不同药材品种提取物,总皂苷成分各不相同,可用于鉴别和区别各药味。 部颁标难收载西洋参和新药绞股兰总皂成分别闻西洋参总皂苷和绞胶兰总皂苷作对照品。又如美国药典第22版对番泻苷鉴别即以番泻叶总皂苷作薄层层析对照品。 C.用药材对照中国药典1985年版一部收载的药材及成药采用了16种药材对照品,至1990年版增加至39种,部颁标难及新药标准中也收入相当数量。(2005年版收载对照药材218个,比2000年版新增对照药材69个);如华伦再造丸以川芎、吴茱萸药材作对照;参芩白术散中以人参、甘草药材作对照,建立一系列鉴别试验。 D.用文字描述在进行质量标准研究时,仍需采用上述某种对照品.而在确定后的质量标指出层析斑点的Rf值范围和色泽等。如日本药局方第十二版牡丹皮、葛根、桂皮等的鉴别即是。 E.用相对比移值表示以外加成分(为被检药材所不含)作参比标准,使被检药味的特征斑点得一相对比移值作为鉴别依据。如德国《Homoopathi5ches Arzneibuch 1978》中Dioscore;villosa的鉴别,以苏丹III为对照品,设其Rf 值为1.0.则被检药物的色谱应有相对比移值为0、0.5、0.58(浅蓝)、0.8、1.0、1.0(深蓝)各斑点。 2有关问题的讨论 A.用单体对照品可确切地鉴别某种成分,科学性强,但当所检成分为数种药 材所共有时,则专属性差。其鉴别结果只能证明是否含有此成分,而不一定能确定是否含有某药材。如黄连应检出小檗碱斑点,但检出小菜碱斑点的则不一定就是黄连。很多药材的薄层色谱图斑点很多,其中数个均为已知成分,但并非每一斑点均要用对照品对并指出其上下各为何种成分斑点即可,如德国药典芦荟鉴别即是。 B.采用药材对照品对照.往往能提供更多的鉴别倍息。在单体成分不易得或特征斑点为未知成分时,可以采用。但对于多来源药材,各品种之间的色谱图可能有差异,如中国药典收载的甘草有甘草、光果甘草和胀果甘草三种来源,若选用其中某一种作对照.而成药中所投原料为别种时,薄层层析结果就可能不完全相同。因此在制定质量标准前,应对各品种进行考察,找出共同的特征斑点作为鉴别依据。 反之,由于同属植物往往含有相近似的化学成分,其色谱必然也存共同之处。然而中药的伪品许多为近缘植物、如所定鉴别方法不能区别出伪品,则无意义。在制定质量标准时,最好进行正品与伪品对比,选出两者有明显区别的展开系统,必要时增加伪品的检查项目,加大黄与土大黄均含蒽醌类成分,可增加土大黄苷的检查藉以区别。 药材对照品的选用,应注意品种确切、质优、均均性和稳定性。药材产地、采收期、加工方法不同等引起成分差异,也应进行必要的考察。 药材对照品与化学单体同时应用则效果更佳.药典中收载多种药材的鉴别如人参即是;国外药典如USP鉴别洋地黄,即同时采用了洋地黄粉参比标准品及digitoxin、gitoxin二种单体对照品。 C提取物对照品只能用于鉴别试验而不可用于定量,文字描述而不用实物对照品只适用于色谱斑点少而清晰,特征性强的条件下,否则极难描述清楚;而相对比移值的方法作为研究探索性试验尚可,因层析条件标准化程度差,影响色谱 斑点位置因素较多,不可用于法定标准中。(注2005版药典中规定对照品、对照药材、对照提取物、标准品除另有规定外应置五氧化二磷减压干燥12小时以上使用) (4)薄层色谱应以彩色照片记录其真实性,日光下显色明显的可复印,定量试验也可用扫描图(从原点至前沿)记录。 (六)检查 主要指控制药材或制剂中可能引入的杂质或与药品质量有关的项目。归纳为三类: 1.质量参数类型:与质量直接有关的专定检查项目,如大黄中检土大黄苷;川乌、草乌炮制后乌头碱的限量;黄连素中检棕榈碱及药根碱等;监测伪品的掺人、药物纯度及安全性等。 2.剂型的要求类型,制型不同剂型有不同的质量要求,如固体制剂要求测水分;酊剂、酒剂要求测含醇量,总固体、相对密度、PH值等;片剂、胶囊要求侧重量差异、崩解度,近代已发展要求测均匀度、溶出度,这是重量差异与崩解度的延伸。药典附录根据有关剂型分别要求检查不同项目。 注射剂要求比较严格,在研制过程中对澄明度、pH值、蛋白质、鞣质、重金属、砷盐、草酸盐、钾离子、树脂、炽灼残碴、热原、无菌等项均应做检查,有些如呈阴性或限度极低,在标准正文中可不做规定,但研究资料均应记述于起草说明中。总固体的测定在注射剂中列于含量测定项下,以此量为基础,计算所含有关成分的量。(2005版药典中增加安全性控制指标对测定重金属和有害元素要求更加严格,有一条说明:中药用硫磺熏,以漂白、增艳、防虫虽是传统加工方法,但现代研究证明由此会使中药材残留大量的二氧化硫(SO2)及砷(As)、汞(Hg)等重金属,新版药典删除了山药、葛根等加工方法中的硫磺熏。这表明中药材以 后将不再允许用硫磺熏,并且还拟将在2005年版增补本中增加二氧化硫残留量测定法。而我们的新药益通丸中的主要就是葛根,所以我们要引起重视) 3.污染的控制类型 (1)异物污染可分为钝性异物和有害异物两类,前者如夹杂泥沙杂草、非药用部位等;钝性异物的存在主要是影响剂量的准确及疗效的显现;有害异物的污染则可能造成严重质量事故,如曾发现赤芍中杂有三分三,从而出现中毒事故。在检查项下规定灰分,酸不溶性灰分及异性有机物等。 (2)昆虫及微生物污染自六十年代以来,国内外对非灭菌药物制剂(包括药材与中成药)的生物性污染都有一些考察,有些属严重污染,据国外报道,在一份甘草中分离出黄曲霉菌的代谢产物黄曲霜毒素B1及B2;有些外用成药中曾检出破伤风杆菌等。染螨与虫霉情况,冲剂、蜜九尤以糖浆染螨与发霉应加强检查,国内中成药卫生学检查已为常规要求。 (3)化学污染可能来自土壤、化肥、化学除草剂、农药、药材熏蒸、杀虫剂、水源等。材污染有害金属汞、铝、镉、铬等国内也有报道。有时因水质欠佳,洗涤药材后污染铬、砷,用含砷且高的硫磺作熏蒸剂,使贝母、金银花等含砷量高,另据新加坡商反映,新、马二国限度规定为(ppm): 砷铜铅汞 新加坡5 150 20 0.5 马来西亚6 20 10 0.5 香港砷限量为10pPm;铜为50ppm。新药的研制均应作砷与重金属检查,检出量极低的在正文中可不作规定 2005版药典对西洋参、白芍、甘草、丹参、金银花、黄芪等首次规定其含重 金属限量为:铅(Pb) ≤5.0mg/kg,镉(Cd) ≤0.3mg/kg,汞(Hg) ≤0.2mg/kg,砷(As) ≤2.0mg/kg,铜(Cu) ≤20.0mg/Kg。 (七)含量测定 中药材多为天然产物,含有多种成分,中成药及制剂又多为复方,所合成分更为复杂、但常共具临床疗效,有时甚至具双向调节作用、很难确定某化学成分是中医用药的唯一有效成分,有些尚不一定能与中医用药疗效完全吻合,或与临床疗效直观地比较。然而药物的疗效必定有其物质基础,根据中医药理论,结合现代科学研究,择其具生理活性的主要化学成分,作为有效或指标性成分之一,建立含量测定项目,评价药物的内在质量,并衡量其商品质量是否达到要求及产品是否稳定,是完全必要的。 1.含量测定选定原则 (1)项目与药味的选定 1根据目前我国中成药标淮化程度及生产单位设备条件研究建立一项较为完善的含量测定,包括方法准确、灵敏、考核实验数据齐全,累积相当数据,限度制定合理,即认为基本符合要求,但如君药、贵重药、剧毒药同时存在,则要求二项测定也不算过分。对出口中成药,多要求建立二项以上的含量测定;尤其对于注射剂,要求大部分成分或组分均要说清楚,更要研究建立多项测定,以达可控要求,保证药物安全有效。外用药也同样要求研究建立含量测定项,控制质量。 2单方制剂所含成分必须基本清楚、即如明确为生物碱类等,并搞清其中主 要成分的分子式与结构式,既能测定其总成分,又便于以主要成分计算。 ③复方制剂处方原则有君、臣、佐、使之分,应首先选其君药及所含贵重药建立含量测定项。如具泻火舒肝功能的左金丸,具清热解毒功能的万氏牛黄清心丸中,测定黄连、黄柏中小檗碱是合适的,但这绝不意味着中医用药主要用小檗碱代黄连、黄柏,甚至黄连、黄柏通用,而是以此成分衡量各自的成药质量。含毒剧药的如马钱子、生川乌、草乌、蟾酥、斑瞀等,应重点研究,建立含量测定项;量微者也要规定限度试验。 ④对前述药味基础研究薄弱或在测定中干扰成分多.也可依次选定臣药等其他药味进行含量测定,但须在起草说明中阐述理由。 (2)测定成分的选定 ①有效成分或指标性成分清楚的可行针对性定量。 2成分类别清楚的,可对总成分如总黄酮、总皂苷、总生物碱等进行测定。但必须无干扰才进行。 3所测成分应归属于某一单一药味;如成药中含有二种以上药味具相同成分或同系物(母核相同),最好不选此指标,因无法确证某一药材原料的存在及保证所投入的数量和质量。但如处于君药地位,或其它指标难于选择测定,也可测定其总含量,但同时须分别测定药材原料所含该成分的含量,并规定限度。在保证各药味质量的基础上,达到控制成药质量的目的。如黄连与黄柏.枳实与枳壳,川芎与当归等常同时处于同一处方中,并居君药地位,则可测定成药中的小檗碱、橙皮苷、阿魏酸等,并同时分别控制各药材原料有关成分的含量。 4对于因药材原料产地和等级不同而含量差异较大的成分,需注意检测指标的选定和产地的限定。如麻黄主含左旋麻黄碱和右旋伪麻黄碱,由于我国麻黄产 地分布极广,从东北至西北的各产地麻黄中,左旋麻黄碱含量递减,而右旋伪麻黄碱含量递增、目前检测技术虽然可以同时分别检测数种生物碱,但在质量评价上仍以测定总碱为宜,只有在制剂中测总碱有干扰时才测定某种生物碱如左旋麻黄碱,但需要限定取材于适宜的产地,否则难于保证质量。 5含量过低的成分较难真正反映成药的内在质量。药材原料(如大黄、何首乌等)所含大类成分如总蒽醌含量较高,但在复方制剂中由于工艺制备过程中的损失.含量已经降低,所以当测定大类成分有干扰,改测定某一单一成分如大黄素时,含量仅为十万分之几。由于样品不均或工艺及检测操作稍有误差则对含量影响极大。 ⑥检测成分应尽可能与中医用药的功能主治相近,如山楂在成药中若以消食健胃功能为主,则应测定其有机酸含量;若以活血止痛治疗心血管病为主,则测其所含黄酮类成分,因其具有降压、增强冠脉流量、强心、抗心率不齐等作用。 7中西药结合的制剂一般不提倡,除非经拆方试验,药效学证实复方制剂优于单独中药或西药,此药才能成立。含量测定则要求不仅测中药君药,所含西药也必须建立含量测定项目。 8复方制剂中由于某些药味基础研究工作薄弱,测定干扰难以克服或含量极低,无法进行某些成分含量测定的,也可选择适宜的溶剂进行浸出物测定,如含挥发性成分或脂溶性成分可作醚浸出物测定,前者还可测定挥发性醚浸出物;如含各种苷类成分药味较多,也可测正丁醇浸出物。溶剂的选择应有针对性,能达到控制质量的目的,一般不采用水或乙醇,因其溶出物量太大,某些原料或工艺的影响难于反映质量的差异。 9对成药进行各种探讨均无法确定含量测定项目时.也可择其君药之一的药材原料进行含量测定,间接控制成药质量。 2.含量测定方法 含量测定方法很多,常用的如经典分析方法(容量法、重量法)、比色法、分光光度法、计算分光光度法如二波长、三波长紫外分光光度法、导数光谱法等(因其"杂质"并非恒定,所以计算公式只适用于同批样品,有时不具重观性,故只适合于内控应用)、气相色谱法、高效液相色谱法、薄层扫描法、薄层一分光光度法或比色法以及生物测定法等等。 含量测定是质量标准的核心部分,它是质量控制中最能有效考察产品内在质量的项目,也是药品稳定性考察最重要的依据。因此,含量测定方法的建立也是质量标准中的难点与重点。在此.以益安宁标准的研究作介绍。 (1)实验设计: 仪器分析方法为因素A 前处理方法为因素B (2)供试品溶液的制备 (3)色谱条件及测定法 3.方法学考察 新药可以引用药典或文献收载的与其相同成分的测定方法,但因品种不同,与自行建立新方法一样.均要进行方法学考察研究。一般考察项目如下: (1)提取条件的选定优选提取条件对测定结果有直接影响、持别对于制剂中含有药材原粉的,即由组织细胞中提出有关成分,提取方法的选择尤为关键,常 见的提取方法有冷浸、热浸回流、索氏提取器提取、超声波提取等,滤除残渣即得提取液。对提取液的取舍一般有两种方法,一种为取全量,即充分洗净残渣,并将洗涤液合并于提取液中;另一种为取一定量,即在提取前精密加入定量溶剂,称重,提取后.再补充提取过程损失的溶剂,摇匀,过滤,精密吸取-定量的提取液.进行含量测定,最后结果按相当的样品量计算,即得。 提取条件的确定,一般要有不同溶剂、不同提取方式、不同时间以及不同温度、PH值等条件比较而定,可参考文献,重点对比某种条件.也可用正交试验全面优选条件,再配合回收率试验或与经典方法比较,从而估计方法的可靠性c (2)分离纯化根据被测成分的性质,采用一定方法,排除干扰物质,使供试样品达到-定纯净度。特别是气相、液相色谱分析更应注意此点,以提高分析准确性并可保护色谱柱。 (3)测定条件的选择如比色法、高效液相、薄层扫描法中最大吸收波长的选择,液相色谱法中固定相、流动相、内标物的选择,薄层扫描法层析与扫描条件的选择等。 (4)空白试验在色谱法中常用阴阳对照法,即以被测成分或药材与除去该成分或该药材的成药作对照,可考察被测成分的斑点(或峰)位置是否与干扰组分重迭,以确证测定指标(如吸收度、蜂面积)是否仅为被测成分的响应,防止假阳性的误判。紫外分光光度法或比色法中的空白对照液常见的有溶剂空白、试剂空白(溶剂加显色剂),对复方制剂也须同色谱法做阴性对照.确证吸收度仅为被测成分的响应。对单一成分或大类成分测定,均须做此试验。 (5)样品浓度与响应值样品浓度与吸收度或色谱峰面积(或峰高)之间的线性关系考察、即标准曲线的制备。 紫外分光光度法或比色法须制备标准曲线,用以确定取样量并计算含量。色 谱法一般均采用对照品比较法如外标法或内标法测定,但也必须进行线性考察,目的有三:a.确定样品浓度与峰面积或峰高是否呈线性关系;b.确定线性范围,即适用的样品点样或进样量的确定;c.直线是否通过原点,以确定是以一种或二种对照品量(即一点法或二点法)测定并计算。标准曲线相关系数应在0.999以上,薄层扫描法可在0.995以上。 (6)测定方法的稳定性实验此项考察目的是选定最佳的测定时间范围。用紫外分光光度法、比色法或薄层扫描法等测定时,应对被测液或薄层色谱斑点的吸收度值稳定性进行考察,即每隔一定时间测定一次,延续3-4小时,视其是否稳定,以确定适当的测定时间。 (7)精密度试验如气相、液相色谱法对同一供试液多次进样测定,簿层扫描法对同一薄层板及异板多个同量斑点扫描测定,可考察其精密度,对同一薄层斑点连续进行多次测定,则可考察仪器精密度。 (8)重复性试验按拟定的含量测定方法,对同一批样品进行多次测定(平行试验至少5次以上,即n>5),计算相对标准偏差(RSD),一般要求低于5%。同一人测定多次称重复性,不同人或实验室测定称再现性。 (9)检测灵敏度及检测下限的测定,分析方法的灵敏度-般以工作曲线的斜率表示。其值越大.方法的灵敏度就越高。色谱法的灵敏度可以用峰高(mm)/对照品量(mg)表示。最小检出量即检测下限,一般按经验法设计数个不同进样量,以目测估计最小俭出量。有时常把最小检出量理解为灵敏度,实际上两者概念不同。 (10)回收率试验含测方法的建立,多以回收率估计分析的误差和操作过程的损失,以评价方法的可靠性。回收率实验设计也有多种,在中成药分析中常见的有以下几种; ①加样回收,即于已知被测成分含量的成药中再精密加入一定量的被测成分纯品,依法测定。用实测值与原样品中含测成分之差,除以加入纯品量计算回收率。此法不用制备空白对照,模拟真实性好。对单味药材的回收率测定,因不易制备除去被测成分的药材空白对照品,只能用加样回收法,如用提净被测成分的药渣作空白,则意义不大,因为在除去被测成分的同时,干扰成分也被除去了。 在加样回收实验中首先须注意纯品的加人量与取样量中被测成分之和必须在标淮曲线线性关系范围之内;外加纯品的量要适当,过小则引起较大的相对误差,过大则干扰成分相对减少,真实性差。一般加入量与所取样品含量之比控制在1:1左右。 对于加样回收的计算方法,也有用实测值除以理论总量(样品中所含被测成分量与加入纯品旦之和)计算的,但仍以前述计算方法为公认。 2以成药空白(即除去欲测药材后制成的成药),精密加入被测化学成分纯品,依法测定。以加入纯品量为理论值,由实测值计算回收率。此法理论值较准确,但其不足是缺少成药中被测药材本身的杂质干扰条件,模拟真实性差,特别是被测药材组分复杂,如人参被测成分为人参皂苷Re、因与该成分共存的同系物或类同成分人参皂苷较多,其自身分离度重现性差,而只以加入纯品测定回收率,与人参皂苷Re的干扰情况则无从反映。故此种回收率测定只能用于被测药材成分较为单一者。 3取成药空白,精密加人已知被测成分含量的药材,依法测定。以加入药材所相当的被测成分量为理论值,再由实测值除以理论值计算回收率。此法模拟真实性好,能反映被测药材中其它成分的干扰情况,但由于已知含量药材也是同法测得的平均值,故其理论值实际包括正负误差在内,有时也能掩盖系统误差。特别是单味原料(药材)制剂,仍以采用加样回收法为宜。回收率试验至少需进行5次试验(n=5),或三组平行试验(n=6),在同一批样品中加入相同或不同纯品量,后者可进一步验证测定方法中取样量多少更为合适。 回收率一般要求在95~105%,一些方法操作步骤繁复,可要求略低至少不小于90%。 4.含量测定方法实验设计中应注意的几个问题 (1)提取问题对含药材原粉的制剂,如采用取部分提取液的测定方法,不宜将样品粉末直接置容量瓶中定容,因为中药含量测定的取样量往往较大,且药粉不溶于水,其固体体积不可忽视。例如将0.5g九分散于10m1容量瓶中,以刻度吸管加入溶剂约7mL即已至量瓶刻度。可将样品称人具塞锥形瓶中,精密加入溶剂10m1计算全量。 (2)测定大类成分如总黄酮、总皂苷等问题 ①如所测总成分以某一单体成分为对照品制定标推曲线并计算,应首先考虑对照品溶液与供试品溶液最大吸收波长是否一致,有的相差很大或供试品溶液根本无最大吸收,方法则不能成立。 2阴性(空白)对照液即除去欲测成分的药材原料制备的样品液,依法测定其吸收图谱,与基线吻合,或略有吸收,在无其它方法可循的情况下,其吸收值若低至样品吸收值5%以下可忽略不计。因考察中药多为天然药物,含量幅度较大,又为大复方,不可认为无吸收峰即视为无干扰。 3按上述方法制备背景空白以消除干扰是不可行的。例如样品吸收值为0.6,而阴性对照液吸收值为0.2,即以0.6一0.2=0.4计算样品含量。由于处方原料不相同,工艺未知,配制出的背景空白不可能条件相同,吸收值差异较大,故此方法无推广价值。只有在原料来源不变,工艺稳定的情况下作为企业内部的质控方法暂时使用。 ④为了消除其它组分干扰,采用导数光谱或二波长,三波长等方法测定单一 或大类成分,仅可用于药味较少的制剂,其空白试验取多批次样品测定,结果一致才可采用。因中药复方与西药不同,后者所谓干扰组分均为结构已知具有一定规格的成分,而中药则大部为未知成分且不衡定,有些测定只有一次性的意义,不具重现性。 (3)回收率测定问题在一些实验设计中,常见到所谓的加样回收测定,不是在称样开始时即加入纯品,而是将其加至制备好的供试品溶液中,这样不能考察提取、纯化过程中被测成分是否损失;也有在薄层扫描试验中,于薄层板上依次点对照品溶液、供试品溶液及对照品与供试品重叠点于同一原点上,测定后计算,这只能反映板上的回收率,而不能代表全部含量测定方法的回收率。 (4)对照品问题含量测定用对照品只能用化学纯品,不可用药材对照品,因为不可能得到所含成分含量同一的样品。 测定大类成分如皂苷也不宜采用总皂苷为对照品,因总皂苷组分复杂,各成分比例不稳定,不同批次的皂苷难于保持一致,从而使含量测定结果不稳定。测定总皂苷时,采用同系物之一的化学单体并以其计算,定出限度是可行的。如测定人参总皂苷,以人参皂苷Rbl、Re等作对照品并计算。但如处方中含有的不同药味皂苷成分结构差异较大,有的甚至不是皂苷而是其它各种苷类,例如处方中有黄芪、人参、地黄、知母、赤芍等,而以黄芪甲苷或人参皂苷Re为对照品测定并计算含量,科学根据不足,不能成立。 5.含量限度的制定含量限度是在检验方法确定的基础上,积累足够的数据后总结提出的。成药的合格是建立在药材原料的质量保证上的。日本对栽培药材常收集上百件样品进行测定,对结果做分布分析,有的下限取在去除约5%样品的数值上,即将占总量5%的质量最差、分布极小的样品判为不合格。我国则根据宝贵的传统鉴别经验,将药材样品依质量优劣顺序排列,如所测成分含量高低与之相应,则将质次但仍可药用者取为下限。必须强调的是,含量限度的制定应有足够的、具代表性的样品数据为基础。否则就不能反映实际情况,实践中势必会 遇到种种问题。新药申报生产时应积累10批以上的含量数据,提出限度。 中药制剂含量限度规定的方式,根据现行各级标准有以下几种。一种是规定下限,如药典中收裁戊己九,对所测成分如黄连中总生物碱以盐酸小劈碱计不得少于 3.0%,六味地黄丸,山茱萸中熊果酸、丹皮中丹皮酚分别为不得少于0.020%、0.070%(大蜜九);-种是规定幅度,如部颂标推进口西洋参药材含人参总皂为5~10%,含西洋参制剂则应根据处方量及工艺制相关数值规定制剂含量幅度;另一种为规定标示量,如2005版药典中收载华山参片,规格为0.12mg/片,规定含生物碱以其莨菪碱计应为标示量的80.0~120.0%。 应该强调指出中成药与某些制剂不同,如甘草流浸膏类可根据甘草酸的含量调节甘草浸膏的投料量,而中药则必须保证处方不变,成品率稳定。因此只有投入合格的原料才能保证成药的质量。 关于中成药的含量表示方法,有%、mg/片、"g/丸、mg/m1(液体制剂)等。凡药品中规定有含量测定项的,其原料药材必须对成品中所测成分规定含量限度,防止盲目投料,可限定为本制剂专用的原料药材规格,暂不要求代表全国各地药材的质量,达不到要求者可以不进货,不投料,以保证产品质量。 六、质量标准起草说明 起草说明是质量标淮制定的详尽的技术资料。对质量标准中各项均应作逐项说明。名称、处方、制法、功能主治、用法用量等,在申报资料中各有要求,故在起草说明中可以简要概述,但不可从略。而有关检定该药真伪优劣各项均应重点详细说明。 对鉴别、含量测定药味各测定成分的选择依据,方法原理,实验条件的选择和方法学考察资料和数据,空白试验说明杂质干扰及排除情况,附有关图谱如最大吸收波长选择图、标准曲线图,色谱图包括空白试验图,薄层色谱附彩色照片,显示色谱的真实性。 阐明确定检查及含量限(幅)度的意义和依据。新药申报生产或标准试行期满转为部颁标准前至少应有10批以上产品的测定数据。 值得强调的是,应阐明其它曾经做过的试验,包括不成熟的尚待完善或失败、暂末收载或不能收载于正文的检定方法的理由,并提供详尽的实验资料,以便有关部门审查其实验设计是否合理,以确定为主观原因或客观原因,从而判定是否需要作进一步实验的依据。 起草说明的书写格式应按质量标准项目依次予以说明,其与研究报告不同,不能以综述性讨论代替。