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Caspase 1 活性检测试剂盒(比色法)

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Caspase 1 活性检测试剂盒(比色法)Caspase 1活性检测试剂盒(比色法) 简介: Caspase(Cysteine-requiring Aspartate Protease)家族在介导细胞凋亡过程的起着极其重要的作用,其成员包括Caspase1~11等,均属于蛋白酶家族。Caspase 1又称Interkeukin 1 conberting enzyme (ICE)或caspase-1,是唯一可以剪切IL-1前体蛋白或IL-18前体产生相应成熟细胞因子的Caspase家族成员。Caspase 1可以把45kD的Caspase 1前体蛋白剪切成...

Caspase 1 活性检测试剂盒(比色法)
Caspase 1活性检测试剂盒(比色法) 简介: Caspase(Cysteine-requiring Aspartate Protease)家族在介导细胞凋亡过程的起着极其重要的作用,其成员包括Caspase1~11等,均属于蛋白酶家族。Caspase 1又称Interkeukin 1 conberting enzyme (ICE)或caspase-1,是唯一可以剪切IL-1前体蛋白或IL-18前体产生相应成熟细胞因子的Caspase家族成员。Caspase 1可以把45kD的Caspase 1前体蛋白剪切成20kD和10kD的片断,该片断可以形成异源二聚体,进一步由两个异源二聚体形成具有蛋白酶活性的四聚体。Caspase 1通过剪切Bcl-XL来调节细胞凋亡,并通过对一些细胞因子前体的剪切来调控相关免疫反应。 Leagene Caspase 1活性检测试剂盒(比色法) (Caspase 1 Colorimetric Assay Kit) 的检测原理是利用Caspase 1催化底物acetyl-Tyr-Val-Ala-Asp p-nitroanilide (Ac-YVAD -pNA)产生黄色的游离硝基苯胺pNA(p-nitroaniline),通过测定分光光度比色法测定pNA在吸光值,从而间接获得caspase 1的活性。 组成: 编号 名称 CT0101 50T CT0101 100T Storage 试剂(A): Caspase Lysis buffer 10ml 20ml 4℃ 试剂(B): Assay buffer 10ml 20ml 4℃ 试剂(C): Ac-YVAD-pNA(2mM) 0.25ml×2 0.25ml×4 -20℃ 避光 试剂(D): pNA(10mM) 0.25ml×2 0.25ml×4 -20℃ 避光 使用说明 关于书的成语关于读书的排比句社区图书漂流公约怎么写关于读书的小报汉书pdf 1份         自备材料: 1、 水浴锅或恒温箱 2、 96孔板 3、 酶标仪或分光光度计 操作步骤(仅供参考): 1、 制备 标准 excel标准偏差excel标准偏差函数exl标准差函数国标检验抽样标准表免费下载红头文件格式标准下载 曲线: 1 按照Caspase Lysis buffer:Assay buffery一定的比例配制适量的标准品稀释液。 2 用标准品稀释液稀释pNA(10mM),使pNA分别达到200μM、100μM、50μM、25μM、12.5μM、6.25μM,另外设置一管不加pNA仅含标准品稀释液作为零管,把以上系列浓度物质作为标准品。 3 取pNA浓度分别为200μM、100μM、50μM、25μM、12.5μM、6.25μM 、0的标准品各100 μl加入至96孔板或取适量体积加入至容量不超过100μl的比色杯,测定吸光值即A405。 4 用每一个标准品的A405减去不含pNA的空白对照的A405,计算出实际的吸光值。以每个浓度的标准品A405为x轴,以对应的pNA浓度为y轴,用Excel制作pNA浓度对A405值的标准曲线。 2、 样品裂解: 1 悬浮细胞:取实验样品和对照样品,离心收集细胞,小心吸除上清,同时确保尽量没有细胞被吸除,PBS洗涤一次,再次小心吸除上清。按每2~10×106细胞加入Caspase Lysis buffer的比例加入Caspase Lysis buffer,重悬细胞沉淀,冰浴裂解。 2 贴壁细胞:弃细胞培养液,用胰蛋白酶消化贴壁细胞,收集至细胞培养液,离心,小心吸除上清,同时确保尽量没有细胞被吸除,PBS洗涤一次,再次小心吸除上清。按照每2~10×106细胞加入Caspase Lysis buffer的比例加入Caspase Lysis buffer,重悬细胞沉淀,冰浴裂解。 3 组织样品:组织加入Caspase Lysis buffer的比例加入Caspase Lysis buffer,冰浴上用玻璃匀浆器匀浆并转移离心管中,冰浴裂解。 4 离心,取上清至新的1.5ml离心管。立即测定Caspase 1的酶活性或-70℃保存样品。 5 蛋白定量:由于Caspase Lysis buffer含还原剂不宜采用BCA法,可采用Bradford法测定蛋白浓度。以蛋白浓度达到1~3mg/ml为佳,否则应增加细胞或组织的量。 3、 样品检测: 1 按照下 关于同志近三年现实表现材料材料类招标技术评分表图表与交易pdf视力表打印pdf用图表说话 pdf 设置96孔板反应体系,溶液应按照顺序依次加入,即Assay buffer→待测样品→Ac-YVAD-pNA(2mM)。同时应设置不加待测样品的反应孔作为空白对照。酶活性过低或过高,可增加或减少待测样品的用量,大多数情况下,每个反应体系加入10~15μl待测样品即可,并注意避免产生气泡。   空白对照 高酶活性样品 低酶活性样品 Assay buffer 90μl 85μl 65μl 待测样品 0μl 5μl 25μl Ac-YVAD-pNA(2mM) 10μl 10μl 10μl 总体积 100μl 100μl 100μl         2 孵育:盖紧96孔板,37℃孵育60~120min。肉眼可见颜色发生变化时,即可进行A405检测;如果颜色变化不明显,可适当延长孵育时间甚至过夜。 3 待测样品A405分别减去空白对照A405即为样品Caspase 1水解底物产生的pNA吸光值,根据标准曲线即可获得酶的含量。 4 用Bradford法检测待测样品中的蛋白浓度(由于裂解液中含有较高浓度的DTT,不适合采用BCA法进行蛋白浓度测定),进而计算出一个样品单位重量蛋白中所含的caspase 1的酶活力单位即Caspase 1酶活力单位/mg protein。 计算结果: 1 Caspase 1酶活力单位的定义:One unit is the amount of enzyme that will cleave 1.0 nmol of the colorimetric substrate Ac-YVAD-pNA per hour at 37℃ under saturated substrate concentrations,即当底物饱和时,在37℃一个小时内可以剪切1nmol Ac-YVAD-pNA产生1nmol pNA的caspase 1的酶量。根据pNA标准曲线和样品A405值,可计算出Caspase 1酶活力单位。说明:底物的起始浓度为0.2mM,此时底物是饱和的,对于许多样品而言在37℃孵育2个小时以内底物都是饱和的;对于样品中Caspase 1酶活力特别高的情况,须用Caspase Lysis buffer适当稀释样品后再进行测定。 2 Caspase 1酶活性的另外一种表示方法是Caspase活性增加的百分比即实验处理组A405/实验对照组A405×100%,简单而可靠,可粗略的反应酶活性情况。 注意事项: 1、 建议每次测定时都做标准曲线,以使标准更准确,另外标准品需避免反复冻融。 2、 如果没有酶标仪,也可以使用普通的分光光度计测定,但应考虑根据比色杯的最小检测体积,尽量采用100μl体积以内的比色杯。 3、 所测样本的值高于标准曲线的上限,应用裂解液稀释样品后重新测定。 4、 样品蛋白有效含量过低或Caspase激活水平过低都会导致实际测得的A405过低,应注意使蛋白浓度尽量达到1~3μg/ml,调整诱导凋亡的时间和条件。 有效期:12个月有效。 编号 名称 CC0007 磷酸缓冲盐溶液(10×PBS,无钙镁) DC0032 Masson三色染色液 TC0713 葡萄糖检测试剂盒(GOD-POD比色法)     相关:
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