[说明]电泳工作原理

[说明]电泳工作原理 电泳工作原理 工作原理 蛋白质的电泳分离是重要的生物化学分离纯化技术之一,电泳是指带电粒子在电场作用下,向着与其电荷相反的电极移动的现象.根据所采用的支持物不同,有琼脂糖凝胶电泳,淀粉凝胶电泳,聚丙烯酰胺凝胶电泳等.其中,聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)由于无电渗作用,样品用量少(1-100μg),分辨率高,可检出10-9-10-12mol的样品,凝胶机械强度大,重复性好以及可以通过调节单体浓度或单体与交联剂的比例而得到孔径不同的凝胶等优点而受到广泛的应用. SDS-PAGE是最常用的定性分析蛋白质的电泳方式,特别是用于蛋白质纯度检测和测定蛋白质分子量. PAGE能有效的分离蛋白质,主要依据其分子量和电荷的差异,而SDS-PAGE(SDS变性不连续聚丙烯酰胺凝胶电泳)的分离原理则仅根据蛋白质的分子量的差异,因为SDS-PAGE的样品处理液是在要跑电泳的样品中假如含有SDS和巯基乙醇(2-ME)或二巯基赤藓醇(DTT),其可以断开半胱氨酸残基之间的二硫键,破坏蛋白质的四级结构,SDS是一种阴离子表面活性剂即去污剂,它可以断开分子内和分子间的氢键,破坏蛋白质分子的二级及三级结构,并与蛋白质的疏水部分相结合,破坏其折叠结构,电泳样品假如样品缓冲液后,要在沸水中煮3-5分钟使SDS与蛋白质充分结合形成SDS-蛋白质复合物,SDS-蛋白质复合物在强还原剂巯基乙醇存在时,蛋白质分子内的二硫键被打开而不被氧化,蛋白质也完全变性和解聚,并形成榛状结构,稳定的存在于均一的溶液中,SDS与蛋白质结合后使SDS-蛋白质复合物上带有大量的负电荷,平均每两个氨基酸残基结合一个SDS分子,这时各种蛋白质分子本身的电荷完全被SDS掩盖,远远超过其原来所带的电荷,从而使蛋白质原来所带的电荷可以忽略不计,消除了不同分子之间原有的电荷差别,其电泳迁移率主要取决于亚基分子质量的大小,这样分离出的谱带也为蛋白质的亚基. 样品处理液中通常加入溴酚蓝染料, 溴酚蓝指示剂是一个较小的分子,可以自由通过凝胶孔径,所以它显示着电泳的前沿位置,当指示剂到达凝胶底部时,即可停止电泳. 另外样品处理液中也可加入适量的甘油或蔗糖以增大溶液密度,使加样时样品溶液可以沉入样品加样槽底部. 重要参数 ?聚丙烯酰胺凝胶(PAG)制备原则:由于孔径的大小取决于单体和双体丙烯酰胺在凝胶中的总浓度(T)以及双体占总浓度的百分含量即交联度(C)决定的,因而制胶之前必须首先知道这两个参数.一般可以由下述公式计算: T%=(a+b)/m*100%; 和 C%=a/(a+b)*100% 其中: a=双体(bis)的重量 ;b=单体(arc)的重量 ;m=溶液的体积(ml) ?当分析一个未知样品时,常常先用7.5%的 标准 excel标准偏差excel标准偏差函数exl标准差函数国标检验抽样标准表免费下载红头文件格式标准下载 凝胶制成4-10的梯度凝胶进行试验,以便选择理想的胶浓度.如果蛋白质的分子量已知,可参考下表选择所需凝胶浓度: 蛋白质分子量范围(Da) 适宜的凝胶浓度(%) <104 20-30 1×104-4×104 15-20 4×104-1×105 10-15 1×105-5×105 5-10 >5×105 2-5 ?分离胶: 电泳凝胶浓度 试剂 10% 12% 15% 10% 12% 15% H2O(ml) 4.0 3.3 2.3 5.9 4.9 3.4 30%丙烯酰胺(T: 30%,C: 3%(ml) 3.3 4.0 5.0 5.0 6.0 7.5 1.5mol/lTris.cl(PH8.8) (ml) 2.5 2.5 2.5 3.8 3.8 3.8 10%SDS(ml) 0.1 0.1 0.1 0.15 0.15 0.15 10%AP(ml) 0.1 0.1 0.1 0.15 0.15 0.15 TEMED(μl) 4 4 4 6 6 6 总体积(ml) 10 15 ?浓缩胶 试剂 浓度(5%) H2O(ml) 4 2 30%丙烯酰胺(T: 30%,C: 3%(ml) 1 0.5 1.0mol/lTris.cl(PH8.8) (ml) 1 0.5 10%SDS(μl) 80 40 10%AP(μl) 60 30 TEMED(μl) 8 4 总体积(ml) 6 3 蛋白质的样品制备: 蛋白质的样品制备是Western Blotting的第一步，样品制备是关键步骤，要求尽可能的获得所有蛋白质，应注意以下问题: 1:在合适的盐浓度下，应保持蛋白质的最大溶解性和可重复性。 2:选择合适的表面活性剂和还原剂，破坏所有非共价结合的蛋白质复合物和共价键二硫键，使其形成一个各自多肽的溶液。 3:尽量去除核酸，多糖，脂类等干扰分子。 4:防止蛋白质在样品处理过程中的人为的修饰，制备过程应在低温下进行，以避免细胞破碎释放出的各种酶类的修饰(建议加入合适的蛋白酶抑制剂) 5:样品建议分装成合适的量，然后冷冻干燥或直接以液体状态置-80?中保存，但要注意不要反复冻融。 一:准备工作: 一个水浴箱，一台超声装置，组织匀浆器 二:需要的溶液: 裂解液 Laemmli样品缓冲液 三:操作步骤: 1)培养细胞蛋白质样品的制备: 1:胰酶酶解后裂解: 细胞培养至80%左右密度时，以含0.05%胰蛋白酶消化，细胞经预冷的PBS漂洗3次，离心收集在离心管中，加入450μl裂解液反复吹打。 2:皿上直接裂解: 细胞培养至80%左右密度时，细胞经预冷的PBS漂洗3次，加入450μl裂解液，细胞刮刀收集，用移液器转移至离心管中，反复吹打。 以上所得的样品最终用超声细胞破碎仪超声处理，超声时为5S，间歇时间为10S，功率为100-120W至溶液清澈无粘稠为止，处理过程在水浴中进行，后4?25000g离心1小时取上清或以最大强度超声4次，每次15-30S，在每次超声步骤之间将样品转置水浴中15S，加入Laemmli 样品缓冲液(视蛋白样品浓度，以1:1或1:2的比例混合)，强力混匀，样品置100?水浴箱里水浴加热3-5分钟，10000g离心10分钟，取出清液，将其移入另一洁净试管中，至此，电泳样品已准备就绪。(样品可立即使用也可以分装冻存，-20?存放的样品可稳定保持数月) 2)组织样品的制备: 手术切除的组织块迅速置于预冷的0.95生理盐水中，漂洗数次，以清洁表面的血迹，将组织称量后切成几个较小的组织块放入机戒组织匀浆器中，按组织净重，裂解液=1:10的比例，加入相应体积的裂解液进行匀浆，离心收集上清(如有粘稠物可超声处理，具体方法见细胞培养的样品制备，也可以冷冻干燥降解核酸后，将冻干的蛋白质样品溶解在适当的上样 buffer中，混匀后静置3小时使样品中的蛋白质充分的溶解，有5分钟即可，4度离心收集。)加入Laemmli样品缓冲液(视蛋白样品浓度，以1:1或1:2的比例混合)强力混匀，样品置100度的水浴箱水浴加热3-5分钟，10000g离心10分钟，取 上清液，将其转入另一洁净的试管中，至此，电泳样品已准备就绪(样品即可立即使用也可也可以分装冻存，-20?存放的样品可稳定保持数月。) 蛋白质的样品制备: 蛋白质的样品制备是Western Blotting的第一步，样品制备是关键步骤，要求尽可能的获得所有蛋白质，应注意以下问题: 1:在合适的盐浓度下，应保持蛋白质的最大溶解性和可重复性。 2:选择合适的表面活性剂和还原剂，破坏所有非共价结合的蛋白质复合物和共价键二硫键，使其形成一个各自多肽的溶液。 3:尽量去除核酸，多糖，脂类等干扰分子。 4:防止蛋白质在样品处理过程中的人为的修饰，制备过程应在低温下进行，以避免细胞破碎释放出的各种酶类的修饰(建议加入合适的蛋白酶抑制剂) 5:样品建议分装成合适的量，然后冷冻干燥或直接以液体状态置-80?中保存，但要注意不要反复冻融。 一:准备工作: 一个水浴箱，一台超声装置，组织匀浆器 二:需要的溶液: 裂解液 Laemmli样品缓冲液 三:操作步骤: 1)培养细胞蛋白质样品的制备: 1:胰酶酶解后裂解: 细胞培养至80%左右密度时，以含0.05%胰蛋白酶消化，细胞经预冷的PBS漂洗3次，离心收集在离心管中，加入450μl裂解液反复吹打。 2:皿上直接裂解: 细胞培养至80%左右密度时，细胞经预冷的PBS漂洗3次，加入450μl裂解液，细胞刮刀收集，用移液器转移至离心管中，反复吹打。 以上所得的样品最终用超声细胞破碎仪超声处理，超声时为5S，间歇时间为10S，功率为100-120W至溶液清澈无粘稠为止，处理过程在水浴中进行，后4?25000g离心1小时取上清或以最大强度超声4次，每次15-30S，在每次超声步骤之间将样品转置水浴中15S，加入Laemmli 样品缓冲液(视蛋白样品浓度，以1:1或1:2的比例混合)，强力混匀，样品置100?水浴箱里水浴加热3-5分钟，10000g离心10分钟，取出清液，将其移入另一洁净试管中，至此，电泳样品已准备就绪。(样品可立即使用也可以分装冻存，-20?存放的样品可稳定保持数月) 2)组织样品的制备: 手术切除的组织块迅速置于预冷的0.95生理盐水中，漂洗数次，以清洁表面的血迹，将组织称量后切成几个较小的组织块放入机戒组织匀浆器中，按组织净重，裂解液=1:10的比例，加入相应体积的裂解液进行匀浆，离心收集上清(如有粘稠物可超声处理，具体方法见细胞培养的样品制备，也可以冷冻干燥降解核酸后，将冻干的蛋白质样品溶解在适当的上样 buffer中，混匀后静置3小时使样品中的蛋白质充分的溶解，有5分钟即可，4度离心收集。)加入Laemmli样品缓冲液(视蛋白样品浓度，以1:1或1:2的比例混合)强力混匀，样品置100度的水浴箱水浴加热3-5分钟，10000g离心10分钟，取上清液，将其转入另一洁净的试管中，至此，电泳样品已准备就绪(样品即可立即使用也可也可以分装冻存，-20?存放的样品可稳定保持数月。) 附: 一:裂解液的制备: 组织裂解液(全细胞蛋提取):1:Tris-HCL 50mmoL/L PH 7.4 2: Nacl 150 mmoL/L 3: 去氧胆酸钠 0.25% 4:NP-40或Triton-x-100 1% 5: EDTA 1 mmoL/L 6: PMSF 1 mmoL/L 7: Aprotinin 1μg/ml 8: leupeptin 1μg/ml 9: pepstain 1μg/ml 其中:7,8,9作用不持久，要使用前加入。 细胞裂解液:1:NP-40裂解体系: 150 mmoL/L Nacl 1.0%NP-40或Triton-x-100 50 mmoL/L Tris(PH8.0) 2:RIPA裂解体系:150 mmoL/L Nacl 1.0%NP-40或Triton-x-100 0.5%脱氧胆酸钠 0.1%SDS 50 mmoL/L Tris( ph8.0) 二:Laemmli 样品缓冲液配置(1*SDS样品缓冲液) 50 mmoL/L Tris-HCL (PH8.0) 100 mmoL/L DTT 2% SDS 0.1% 溴酚蓝 10% 甘油 此液可以配置成不同的储存液，根据蛋白浓度而定，40C长期保存，用时临时与蛋白液按比例混合，其中DTT应临时加入，以防降解。 蛋白质定量 1)Bradford法: 检测原理: Bradford与蛋白质四级结构,特殊氨基酸结合,由棕色变 成蓝色,595nm检测.该方法用于大多数蛋白质的定量是比较精确的,但不使用于小分子碱性多肽的定量,如核糖核酸酶或溶菌酶,去污剂的浓度超过0.2%影响测定结果,如TritonX-100,SDS,NP-40等. ?Bradford法浓染液的配制:将100mg考马斯亮蓝G-250溶于50ml 95%乙醇,加入100ml浓磷酸;然后,用蒸馏水补充至200ml;此染液放4?至少6个月保持稳定. ?标准曲线蛋白质样本的制备:尽量使用与待测样本性质相近的蛋白质作为标准品,例如测定抗体,可用纯化的抗体作为标准,如果待测样品是未知的,也可用抗体作为标准蛋白,通常在20μg -150μg/100μl之间绘制标准曲线. ?将待测样本溶于100μl缓冲溶液中,该缓冲溶液相同(最好用PBS) ?按照1:5用水稀释浓燃料结合溶液,如果出现沉淀,过滤除去. ?每个样品家5ml稀释的燃料结合溶液,作用5-30分钟,燃料与蛋白结合,将由红色变为兰色,在595nm波长下测定其吸光度,注意显色反应不超过30分钟. ?根据标准曲线计算待测样品的浓度. 2)Lowry法: 检测原理: 是Cu2+与蛋白作用生成的Cu+与双缩脲试剂形成兰色络合物,菲林试剂增强兰色形成,750nm检测. ?首先,将20g碳酸钠溶于500ml水中;再将1g CuSO4.5H2O和2g酒石酸钠溶于500ml蒸馏水中;将铜/酒石酸钠溶液放在磁力搅拌器上搅拌缓缓加碳酸钠溶液,储存于冰箱中,可稳定保存1年以上. ?Folin-ciocalteu酚试剂 ?按体积比1:2:1将铜/酒石酸/碳酸钠,5%SDS和0.8mmol/l NaOH溶液混合,室温下储藏,可稳定保存2周,标明为试剂A ?按体积比1:5将Folin-ciocalteu酚试剂和H2O混合,室温下储存 于琥珀色试剂瓶中,可稳定保存1个月,表明为时机B ?用蒸馏水将样本(5-100μg)稀释为1ml,并准备 100,50,25,12.5μg /ml,4个浓度的BSA作为标准蛋白. ?每个蛋白样品家1.0ml试剂A,混合均匀,在室温下孵育10分钟. ?加入0.5 ml试剂B并立即混合, 在室温下孵育30分钟. ?在750nm光波长下测定吸光度;根据标准曲线计算样本蛋白质的浓度. 3)紫外分光光度法: 检测原理:是因蛋白质样品在280nm波长下有最大吸光率,最大吸光率主要取决于酪氨酸和色氨酸的存在. ?纯化蛋白质浓度的测定:在280nm波长下读取与适当对照相比较的吸光值. ?对于抗体和BSA,可按照下述标准计算其浓度,对其他蛋白质粗略地估计:1单位吸光值相当于1mg/ml 蛋白质 A280(1mg/ml) IgG 1.35 IgM 1.2 BSA 0.7 ?含有核苷酸的蛋白质溶液浓度的测定: 蛋白质浓度(mg/ml)=(1.55*A280)-(0.76*A260) 蛋白质浓度(mg/ml)=A205(27+120A280/A205) 1)SDS-PAGE设备和材料 ?电泳装置(垂直板电泳槽)为北京六一仪器厂生产的DYCZ-24D型电泳装置。 ?电泳仪(电源)为北京六一仪器厂生产的DYY-8B型。 ?振荡器 2)试剂 ?丙烯酰胺(电泳级) ?N,N′-甲叉双丙烯酰胺(bis) ?SDS ?TEMED ?Tris ?过硫酸铵 ?α-巯基乙醇或DTT ?甘油 ?甘氨酸 ?溴酚蓝 (11)盐酸 3)聚胶前准备: ?配制凝胶储液: T%=30% C%=1% arc:bis=29:1 过滤后4?避光保存。 ?配制浓缩胶缓冲液: 1.0mol/L TrisHCl Ph6.8, 过滤后4?避光保存。 ?配制分离胶缓冲液: 1.5mol/L TrisHCl Ph8.8, 过滤后4?避光保存。 ?配制10%SDS ?配制10%过硫酸铵(AP) ?TEMED原溶液 ?电泳缓冲液(5×):Tris 15g+甘氨酸72g+SDS 5g+H2O至1L,临用时稀释5倍至1×SDS电泳缓冲液加入电泳槽中。 4)制胶: 制胶关键是聚合时间,最好是分离胶聚合控制在分离胶从 加入10%AP和TEMED起至开始出现凝胶的时间为15-20分钟(并不是此时已凝聚完全)。对浓缩胶最佳聚合速度为8-10min开始可见聚合，可以通过调节AP和TEMED的加入量来控制，因液体中含有分子氧可抑制凝胶的聚合，故用时可在真空中抽气以排除液体中的分子氧，灌完分离胶后加水以封闭分离胶与外界氧气的结合，总之，要掌握一个原则:即用尽量少的催化剂在最佳时间聚合。 ?按比例配制分离胶，轻缓地摇动溶液(8-10下)，使激活剂混合均匀，将凝胶溶液平缓地注入两层玻璃极中，再在液面上小心注入一层水或正丁醇，以阻止氧气进入凝胶溶液中，然后静置90min。 ?同前按比例配制浓缩胶，但摇动溶液时不要过于剧烈以免引入过多地氧气。吸去不连续系统中下层分离胶上的水分，以连续平稳的液流注入凝胶溶液，然后小心插入梳子并注意不得在齿尖留有气泡，静制90min以上以保证完全聚合。 5)预电泳: 将聚合好的凝胶安置于电泳槽中，小心拔去梳子，加入上下槽电泳缓冲液后低电压短时间的预电泳(恒压 10-20V,20-30min)，清除凝胶内的杂质，疏通凝胶孔径以保证电泳过程中电泳的畅通。 6)加样: 预电泳后依次加入标准品和待分析样品，注意加样时间要尽量短，以免样品扩散，为避免边缘效应，可在未加样的孔中加入等量的样品缓冲液。 7)电泳: 加样完毕，盖好电泳槽的盖子并选择适当的电压进行电泳，通常在连续系统中，上层浓缩胶的电泳电压要低于分离胶的电泳电压，使样品更好的进入凝胶，电泳时，应采用恒压的模式，这样蛋白质才可以保证恒定的电泳迁移率。一般采用恒压浓缩胶80V，分离胶120V，电泳直至溴酚染料前沿下至凝胶末端处，即停止电泳。 8)染色和脱色 电泳完毕需通过染色和脱色评定其结果的优劣.对凝胶中分离成不同条带的蛋白进行检测.此外,根据不同的研究目的,也可将凝胶电印迹 ?考马斯亮蓝染色: 将凝胶取出放入培养皿中到如少量的染色液,以浸没凝胶为宜,在摇 床上震荡,直到凝胶上出现明显的条带为止,一般5-6小时或者4?过夜;然后倾去染色液，用脱色液洗涤震荡,其间要不断换脱色液,直至脱色液颜色稍清亮.,凝胶背景清楚为止. ?染色液配制: 90ml甲醇和H20混合溶液(甲醇:水=1:1,V/V)和10ml冰乙酸的混合溶液中溶解0.25g考马斯亮蓝R250用滤纸过滤染液以除去颗粒不溶性物质. ?脱色液的配制: 90mL(甲醇):H20(1:1 V/V)和10ml冰乙酸溶液. 附: 一、蛋白标准品的选择 凝胶电泳中一个关键的指示系统，即蛋白标准品(Molecular Weight Marker)，电泳的分离效率，转膜效率以及电泳泳动情况等，皆需通过蛋白标准品来显示，目前普遍采用的几种蛋白标准品有: ? Blue RangerTM prestained protein Molecular Weight Marker Mix ? Trichrom RangerTM prestained protein Molecular Weight Marker Mix 以上两种Marker均为PIERCE公司的产品，货号为:?prod# 26681; ?prod# 26691;该标准蛋白不需染色，在电泳凝胶中随着蛋白质的迁移，各种分子质量的标准蛋白逐渐分开，而显示出非常漂亮的多色条带，可通过电泳槽直接肉眼观察各电泳带的凝胶中的泳动情况，当相 对于目的蛋白大小的标准蛋白与相邻两条标准蛋白达到所需分辨距离时，即可停止电泳，取出凝胶做进一步的转膜工作。 ? Chemiluminescent BlueRangerR peroxidase-Labled protein Molecular Weight Marker Mix 以上也为PIERCE产品，货号为:prod# 26651，该标准蛋白同上也具有以上作用外，同时在使用化学发光时，和样品一起显色经胶片曝光后，在胶片上可出现漂亮的条带。 ? Blotinylated SDS Molecular Weight Marker Mix 以上为Sigma公司产品，货号为B2787,作用效果同? 二、对照的设置 一般需要设立: 内参照, 提示系统的稳定性,一般是一些管家蛋白 阳性对照, 即肯定可以表达你的目的蛋白的组织或者细胞,同时可以提示你一抗的质量 阴性对照: 即肯定不会表达你的目的蛋白的组织或者细胞.在实验中 根据你的需要选择 标本制作 可制作涂片、印片、细胞单层培养物、组织切片，经适当固定或不固定，作免疫荧光染色用。