【精品文献】阴沟肠杆菌高产AmpC酶基因检测及分子流行病学研究

【精品文献】阴沟肠杆菌高产AmpC酶基因检测及分子流行病学研究 论文范文 题目:阴沟肠杆菌高产AmpC酶基因检测及分 子流行病学研究 编辑:司马小 作者:杨绍敏 胡大春 邵剑春 李超 苏平 \ 【摘要】 目的 研究医院阴沟肠杆菌高产AmpC酶及分子流行病学特征。方法 采用KB法药敏试验～双纸片增效试验和酶提取物三维试验检测阴沟肠杆菌高产AmpC酶～聚合酶链反应检测AmpC酶基因、ERIC重复序列～研究昆明市第一人民医院2002年7月，2004年12月临床分离的84株阴沟肠杆菌的耐药性、AmpC酶基因型和克隆传播状况。结果 表 关于同志近三年现实表现材料材料类招标技术评分表图表与交易pdf视力表打印pdf用图表说话 pdf 型初筛试验和ESBLs确认试验～高产AmpC酶检出率为27.38%(23/84)～ESBLs检出率16.67%(14/84)～同时高产AmpC酶和ESBLs检出率44.05%(37/84)。AmpC酶基因检出率43.75%(28/64)。三维试验高产AmpC酶检出率为47.62%(40/84)。克隆传播分析～结果发现菌株编号EC2和EC11、EC13和EC14、EC19和EC20分别具有相同的DNA指纹图～其余菌株间未见DNA指纹图。结论 阴沟肠杆菌的耐药性较为复杂。表现出去阻遏高产AmpC酶、产ESBLs、同时产AmpC酶和 ESBLs和质粒AmpC酶多种耐药表型。分子流行病学结果显示～虽然阴 沟肠杆菌的传播与抗生素的诱导和选择作用、患者机体抵抗力下降及 肠道内寄居菌的内源性感染等因素有关～但仍然要警惕医院感染的发 生。 【关键词】 阴沟肠杆菌 内酰胺酶酶 提取物三维试验 重序 序列引物聚合酶链反应 Gene detection and the molecular epidemiology of Enterobacter cloacae ABSTRACT Objective To investigate the molecular epidemiology of Enterobacter cloacae with hyperproduction of AmpC The differential genot investigated using the Enterobacter repetitive intergenic consensus (ERIC) for repetitive extragenic palindromic the First People′s Hospital of Kunming from July, 2002 to December, 2004 in 84 clinically separate cases of E.cloacae. molecular epidemiology of each strain. Results Using (ESBLs) confirmatory test, t 27.38%) of E.cloacae were found to have hyperproduction of ection (40/84). Through molecular epidemiology analysis, the results showed that the strains EC2 and EC11, EC13 and EC14, EC19 and EC20, had the same genotypic trees respectively. The rest of the strains did not exhibit this trait. Conclusion The drug resistance profile of E.cloacae is quite complex. The strains ESBLs only, or both at the same time, demonstratedvariable drug resistance between them. The results of the molecular epidemiological research demonstrated that even the transmission of E.cloacae resistance was often induced by the improper therapeutic option of drug, but also related to the decrease of the autoimmune condition of the patients and the enteric endogenous infections, whereas vigilant attention to the incidence of community/hospital acquired infections couldn′t be ignored. ase; Modified 近年来头孢菌素在我国的广泛使用和其对阴沟肠杆菌的选择作用～阴 沟肠杆菌产ESBLs,1,和AmpC酶,2,已成为临床关注的焦点。马越 等报道,3,～阴沟肠杆菌对临床常用抗生素的耐药率～除亚胺培南和 美罗培南外～8年间都有不同程度的增加。头孢曲松、头孢噻肟、头孢 他啶、环丙沙星、庆大霉素和阿米卡星等抗生素的耐药率都增加了20% 以上。本研究采用表型初筛试验、双纸片增效试验和酶提取物三维试 验～检测从临床感染标本中分离的84株阴沟肠杆菌高产AmpC酶和 ESBLs～同时用聚合酶链反应检测AmpC酶基因～用肠杆菌间的重复序 列(Enterobacter repetitive intergenic consensus～ERIC)对引物 进行扩增～研究其克隆传播状况～结果 报告 软件系统测试报告下载sgs报告如何下载关于路面塌陷情况报告535n,sgs报告怎么下载竣工报告下载 如下。 1 材料 关于××同志的政审材料调查表环保先进个人材料国家普通话测试材料农民专业合作社注销四查四问剖析材料 与方法 1.1 菌株来源及鉴定 收集2002年7月，2004年12月昆明市第一人民医院住院及门诊感染 患者送检的各类标本中分离的阴沟肠杆菌84株～排除同一患者同一部 位重复分离的菌株。其中来自痰液标本68株(80.95%)～咽拭3株 (3.57%)～尿液标本4株(4.76%)、脓性分泌物5株(5.95%)、脑脊液1株(1.19%)院内感染监测标本3株(3.57%)。标本主要来自医院ICU(40%)、神经外科(22%)和老干科(16%)。按照《全国临床检验 操作规程 操作规程下载怎么下载操作规程眼科护理技术滚筒筛操作规程中医护理技术操作规程 》第二版常规培养分离～菌株采用BD BBL Crystal ENF鉴定系统鉴定到种。 1.2 AmpC酶表型筛选法 采用CLSI/NCCLS(1999年)推荐的纸片扩散法～广东乐通泰公司提供法国公司琼脂、英国Oxoid生产的药敏纸片～亚胺培南(IMP)、头孢吡肟(CPE)、头孢曲松(CRO)、头孢噻肟(CTX)、头孢他啶(CAZ)、头孢西丁(CFX)、头孢噻肟/克拉维酸(CD03～30μg/10μg)、头孢他啶/克拉维酸(CD02～30μg/10μg)。CFX和AMPC耐药作为初筛指标,4,。再用IMP、CPE、CD02、CD03、CRO 5种纸片进一步判别,5,。结果显示～CPE、IMP表现敏感～而CRO、CD02和CD03耐药或其抑菌环内存在少数菌落～为去阻遏持续高产AmpC酶～提示IMP敏感其余均耐药～判断为高产AmpC酶和ESBLs同时存在。 1.3 头孢西丁三维试验 采用改良酶提取物三维试验,6,。 (1)制备内酰胺酶粗提取物 将35?培养过夜的测试菌制成1.5×108CFU/ml菌液～取50μl加入12ml胰蛋白胨肉汤。置35?恒温摇床上(200r/min)孵育4，6h～3000r/min离心25min～弃上清液。取沉淀加入0.01mol/L的PBS(pH7.4)1.0m1～旋涡混匀～置-170?液氮及37?反复冻融5次～4? 12000r/min离心1h～上清即为酶提取物。取制备好的酶提取物接种于普通琼脂平板～35?孵育18，24h～确认无细菌生长～-25?保存。 (2)三维试验(间接法) 将大肠埃希菌ATCC25922按KB法涂布MH琼脂平皿～在其中央贴CFX(30μg)纸片～用无菌刀片在离纸片边缘5mm处放射状切1条狭缝～取25，40μl酶提取物加入狭缝内～待稍干后置35? 18，24h。若在狭缝与抑菌环的交界处出现扩大的长菌区域～判为AmpC酶阳性～说明受试菌为高产AmpC酶菌株～阴沟肠杆菌029为 阴性对照～阴沟肠杆菌029M(解放军301医院微生物科赠送)为阳性对照。 1.4 ESBLs的检测 ESBLs初筛和确认试验按CLSI/NCCLS(1999年)推荐方法～CTX?27mm、CAZ?25mm、CRO?25mm、ATM?27mm四个纸片有两个或以上小于上述标 准为初筛阳性可疑菌株～需进行确认试验。CD02与CAZ、CD03与CTX抑菌环直径之差?5mm～确认为ESBLs阳性。 1.5 阴沟肠杆菌产AmpC酶基因型研究 (1)细菌DNA提取 采用碱裂解法～试剂盒、和 、由无锡遗传技术研究所提供。取菌落置入内含100μl生理盐水的0.5ml离心管内～离心(15000r/min)5min～弃上清液～加裂解液A 50μl～裂解液B 2μl～混匀后置入55?保温1h～再置入95?保温5min～离心(10000r/min)30s～上清液即为扩增的模板液。 (2)PCR扩增反应体系 按照试剂盒说明进行～取5μl模板液加入15μl耐热热管中加盖石蜡油二滴即可。 (3)PCR扩增条件 93?预变性2min～然后按93? 30s?55? 20s?72? 60s共循环35个周期～最后一个72?延长到2min。取扩增产物10μl与2μl溴酚兰指示剂混匀～点样于2%琼脂糖凝胶中～以100V电压电泳20，30min～出现与阳性模板分子相同的条带(302bp)为 、阳性。条带为405bp。 1.6 重复序列引物聚合酶链反应 (1)菌株来源 细菌DNA的提取、主要仪器均同上。 (2)寡核苷酸引物 肠杆菌属基因重复序列(ERIC),7,为:ERIC1 ～ERIC2 ～由上海博亚生物技术有限公司合成。 (3)试剂 Taq酶、dNTP、MgCl2、10×PCR Buffer均为上海博亚生物技术有限公司产品。DNA分子大小Marker为Fermentas LIFE SCIENCE产品:GeneRulerTM 100bp DNA Ladder Plus～分子大小范围在100，3000bp。琼脂糖为REGULAR产品。 (4)PCR扩增反应体系 参照文献,8,进行。10×Buffer 2.5μl、Mg2+ 50mmol/L 1.25μl～dNTP(10mmol/L) 0.5μl～Taq DNA polymerase 2.0U～引物(50pmol)0.5μl～灭菌去离子水14.75μl～样品DNA 5μl～总体积25μl。 (5)PCR扩增条件 参照文献,8, 设计 领导形象设计圆作业设计ao工艺污水处理厂设计附属工程施工组织设计清扫机器人结构设计 ～预变性95? 7min～变性90? 30s～退火52? 1min～延伸65? 8min～热循环数30～最后变性90? 30s～退火52? 1min～延伸65? 16min。 (6)PCR扩增产物检测 用1.5%的琼脂糖凝胶电泳分离PCR扩增产物～溴化乙啶(EB)染色～Gel Doc 2000TM凝胶成像分析系统分析DNA条带～并用Quantity One软件对指纹(条带)进行细菌同源性分析。 2 结果 2.1 表型初筛试验确认试验高产AmpC酶、单产ESBLs、同时产AmpC酶和ESBLs的检出率分别为27.38%(23/84)、16.67%(14/84)、44.05%(37/84),有11.9%(10/84)菌株AmpC酶、ESBLs均阴性。单纯高产AmpC酶和同时产AmpC酶与ESBLs两种酶的菌株占 71.43%(60/84)。 2.2 头孢西丁三维试验 AmpC酶阳性40株～即靠近指示纸片头孢西丁的一侧出现明显抑菌环减小而形成的切迹～阳性率为47.62%(40/84)～其中AmpC酶表型筛选试验检出单纯高产AmpC酶和同时产AmpC酶与ESBLs两种酶的60株细菌中有38株三维试验AmpC酶阳性～占63.33%(38/60)～14株双纸片增效试验检出单产ESBLs细菌中～2株三维试验AmpC酶阳性～占14.29%(2/14)。 2.3 AmpC酶基因 AmpC酶基因检出率43.75%(28/64)。64株阴沟肠杆菌AmpC酶基因检测阳性结果与表型初筛法及三维试验阳性结果比较见表1。 2.4 克隆转播状况 对64株阴沟肠杆菌进行分析～结果发现菌株编号EC2和EC11、EC13和EC14、EC19和EC20分别具有相同的DNA指纹图,其余菌株间未见DNA指纹图。表1 64株阴沟肠杆菌表型初筛法与三维试验、AmpC酶基因检测结果分析 3 讨论 内酰胺酶可存在于染色体或质粒上,9,。染色体AmpC酶分为诱导型和持续高产型,而质粒AmpC酶无论有无诱导剂～均可持续大量生产,10～11,～还经常携带多重耐药基因如对氨基糖苷类、氯霉素、氟喹诺酮类和其他类型的内酰胺酶(如ESBLs)等～使其耐药性日趋复杂。本研究采用纸片初筛法～确认试验和三维试验检测临床分离的84株阴沟肠杆菌的耐药表型～检出去阻遏突变高产AmpC酶菌株23株(27.38%)～单产ESBLs 14株(16.67%)～同时产AmpC酶和ESBLs 37株(44.05%)。北京顾怡明,12,的结果分别为65.32%、13.79%和20.69%～西安刘冬的结果,13,分别为42.48%、26.55%和9.73%～武汉施金玲,14,的结果为16.0%、10.4%和13.2%。本研究结果显示～昆明市第一人民医院临床分离阴沟肠杆菌去阻遏突变高产AmpC酶的检出率低于北京和西安地区～高于武汉,单产ESBLs的结果与顾怡明比较接近,同时产AmpC酶和ESBLs高于国内报道～分析原因有二:?与标本的主要来源有关。本研究的标本主要来自医院ICU(40%)、神经外科(22%)和老干科(16%),?由于临床抗生素的使用习惯及耐药菌株的差异导致耐药基因的地区差异性。本文结果表明～高产AmpC酶和产ESBLs已成为阴沟肠杆菌耐药的二个主要因素。阴沟肠杆菌同时产生AmpC酶和ESBLs时～耐药情况极为严重～除亚胺培南外～几乎对所有抗生素耐药。 三维试验AmpC酶总阳性率为47.62%(40/84)。酶提取物三维试验虽然能够检出内酰胺酶～但是不能区分是染色体还是质粒介导的。其原因一是质粒AmpC酶的种类较多～对头孢西丁的水解活性不尽相同～二是酶提取物的量也会影响检测结果。 分析64株阴沟肠杆菌AmpC酶基因检测结果。在表型检测为去阻遏突变高产AmpC酶阳性的12株菌中有7株AmpC酶基因、 或/和扩增阳性～占58.33%,12株单产ESBLs中只有1株AmpC酶基因阳性(8.33%),34株同时产AmpC酶和ESBLs菌株中AmpC酶基因阳性率为44.12%(15/34)。表明阴沟肠杆菌耐药表型比较复杂～实验室耐药性检测仍然亟待提高和改进。 重复序列片段基因扩增是通过PCR扩增细菌重复DNA片段来获得菌株特异性基因图谱。肠杆菌属基因间重复序列(ERIC)长度为126bp～位于染色体上非编码转录区～包含一段高度保守的中央倒置重复区和位于细菌基因外区域～由于不同的细菌ERIC在基因中的位置不同～所以分型效果较好～其分辨率较随机引物PCR～核糖体分型的效率好,7,。EC2和EC11、EC13和EC14、EC19和EC20分别具有相同的DNA指纹图～表现出垂直传播特征。临床资料显示同为ICU来源的标本～EC2与EC11号为2002年11月、2003年1月的标本,EC13、EC14是2003年2月的标本,EC19、EC20号为2004年3月、4月的标本～有明显的时间一致性。提示应加强医院感染控制～切断各种传播途径。 有90.63%(58/64)的阴沟肠杆菌未见相同的DNA指纹图～表明阴沟肠杆菌的传播与大量使用头孢菌素和其他广谱内酰胺类抗生素的诱导和选择作用～有严重的基础疾病～接受侵入性诊疗手段如导管装置、患者机体抵抗力下降～肠道内寄居菌的内源性感染有关。如何合理应用抗生素～开发并利用高科技手段简便、快速和准确地对耐药情况进行监测是我们急待加强研究并解决的问题。 【参考文献】 ,1, 顾怡明～张杰～俞云松～等. 阴沟肠杆菌超广谱内酰胺酶的基因型调查,J,. 中国抗生素杂志～2004～29(2):82 ,2, 吴伟元～陈民钧. 阴沟肠杆菌ampD基因突变与去阻遏持续高产AmpC酶,J,. 中国抗感染与化疗杂志～2001～1(2):65 ,3, 马越～李景云～张新妹～等. 1995，2002年阴沟肠杆菌临床分离株的耐药性分析,J,. 四川生理科学杂志～2004～26(1):1 ,4, 倪语星. 革兰阴性菌内酰胺酶的耐药性问题,J,. 中华检 验医学杂志～2001～24(4):201 ,5, 周志慧～李兰娟～俞云松～等. 两种检测阴沟肠杆菌AmpC酶方 法的比较,J,. 中华医学检验杂志～2002～25(2):88 ,6, Coudron P E, Moland E S, Thomason K S. 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