绵羊胚胎移植关键技巧[精解]

绵羊胚胎移植关键技巧[精解] 绵羊胚胎移植关键技术 胚胎移植也称受精卵移植(简称卵移植)。就是将一头良种母畜配种后的早期胚胎取出，移植到另一头同种生理状态相同的母畜体内，使之继续发育成新的个体。1890年，英国剑桥大学WalferHeape第一次获得兔受精卵移植成功，开创了胚胎移植技术史上的先河。以后许多动物的胚胎移植都相继获得成功，其中绵羊(1934)，山羊自身移植(1934)，使得这一技术跨入了具有生产意义的畜牧业领域，被认为是畜牧业发展史上就有重大应用前景和实用价值的新技术革命。20世纪70年代，胚胎移植技术在我国应运而生，1974年，在中国科学院遗传所首例绵羊胚胎移植获得成功。以后，绵羊、奶牛等胚胎低温、超低温及胚胎分割技术相继获得成功，不仅奠定了国际绵羊良种交流的基础，也加快了胚胎移植技术由试验阶段向生产实用阶段转化的步伐。目前，我国许多省、自治区都已大规模启动羊胚胎移植工程。据不完全统计，绵羊鲜胚胎移植妊娠率达54.4,,60,，高达70.8,(赵有璋，2003)，双胎率33.3,，冷冻半胚移植妊娠率52.4,，双胎率30.6,;山羊鲜胚移植妊娠率达75,，冻胚移植妊娠率平均达60,左右(刘学峰，彭光，2002;王志军，李华，1999;张海燕，李俊，2001)。绵羊胚胎移植关键技术包括同期发情、超数排卵、胚胎采集、胚胎保存、胚胎分割、胚胎性别鉴定等。?1绵羊同期发情与超数排卵?绵羊同期发情是利用某些外源激素人为地控制并调整一群母羊发情周期的过程。其药物机理一是对群体母羊同时使用某种激素，抑制卵巢上卵泡的生长发育，经过一定的时间后停药，使卵巢机能恢复正常，引起同期发情。其实质是延长了发情周期，推迟了发情期。二是使用性质完全不同的另一种激素，抑制黄体，加速其消退，缩短黄体期，为卵泡期提前到来创造条件。黄体退化将导致母畜发情。其实质是缩短了发情周期，使发情期提前到来。?通常使用氟孕酮海绵栓埋植或埋植CIDR，被认为是控制母羊同期发情最可靠、最准确的方法。到目前为止，同期发情技术在国内外都已经是一项非常成熟的技术，在大规模的生产实践中普遍能达到90,,100,的同期发情率。?超数排卵是在母羊发情周期的适当时间，注射外源促性腺激素，使卵巢比在自然状态下有更多的卵泡发育并排卵的技术。应用超派技 术可使羊每次排卵由1,4个增加到10,20个或者更多。1978年，全国绵羊受精卵移植座谈会中提出超排的理想指标是:超排卵12个(10,14)，回收卵10个(8,12)，受精卵8个(6,10)，产羔6只(4,8)(徐刚毅，1988)。目前所获得的超排卵数和回收卵数基本能达到甚至超过上述指标。常用的激素有FSH、LH、LRH、PMSG、抗PMSG、PGF2α等，不同的生产或科研单位会根据自己的试验研究选择不同的药物(国产或进口)，并使用不同的超排程序。常规操作是在供体羊发情后12,13天开始肌肉注射FSH，早晚各一次，间隔12小时分3,4天减量或恒量注射促超排药物，供体羊一般在开始注射后的第3,4天表现发情，可在发情后立即肌肉或静脉注射LH75,100IU，或促性腺激素类似物50,75ug，也可在超排期间注射PMSG1,2次，都能达到很好的超排效果。?2胚胎采集?采集胚胎时所使用的液体即为冲胚液(冲卵液)。常用杜氏液(PBS液)或改进的PBS液;布林斯特液、SOF液、惠屯氏液、Hum’sF,10液及TCM199等，在使用时一般需含1,,5,的犊牛血清或0.3,,1,的牛血清白蛋白。若条件允许，可直接用加拿大、澳大利亚、新西兰等国家生产的成品。?以发情日为0天，于第6,7.5天或2,3天分别从子宫和输卵管采集胚胎。一般选择前腹中线部(在两条乳静脉之间)或后肢股内侧鼠蹊部。由于胚胎移植要进行腹腔手术，子宫、输卵管及卵巢必然外露，经常发生出血感染而粘连，使供体、受体母羊的重复利用率降低，据报导，发生感染的母羊最多利用2,3次就出现了繁殖机能障碍。因而，许多研究者试图通过非外科手术法进行采卵、移植以减少损失。成充等(1985)通过非手术法从绵羊子宫冲卵，采卵率30.4,，非手术移植的妊娠率22.7,。1989年，罗成浩做类似试验，移植妊娠率为16.7,。随着绵羊胚胎的试验还在不断进行，试图做到在尽可能不影响绵羊繁殖性能条件下，又能够获得较高的采卵率及胚胎移植成功率。目前规模化的羊胚胎移植生产中还以手术操作为主，但腹腔镜技术在胚胎移植上的应用，使供、受体手术的操作程序更为方便、快捷，大大缩短了手术时间。常用的手术冲胚法有:?1)输卵管冲胚法供体羊发情后2,3天，就可采用输卵管冲胚法。将冲胚管一端由输卵管伞部喇叭口插入约2,3?深处(打活结或用钝圆的夹子固 定)，另一侧接集卵皿。用注射器吸取37?的冲卵液5,19ml，在子宫角靠近输卵管的部位，将针头朝输卵管方向扎入，一只手的手指在针头后方捏紧子宫角，另一只手推注射器，冲卵液由宫管结合部流入输卵管，经输卵管流入集卵皿。此法胚胎回收率高，冲卵液用量少，检卵省时间。但容易造成输卵管及伞部粘连。?2)子宫冲法供体发情后6,7.5天，采用子宫法采卵。将子宫暴露于创口表面后，用套有胶管的肠钳夹在子宫角分叉处，注射器吸入冲卵液20,30ml(一侧用50,60ml)，冲卵针头(钝形)从子宫角尖端插入，当确认针头在官腔内，进退通畅时，将硅胶管连接于注射器上，推注冲卵液。当子宫角膨胀时，将回收卵针头从肠钳基部的上方迅速扎入，冲卵液经硅胶管收集于集卵皿内，最后用两手指拇指和食指将子宫捋一遍。另一侧子宫角用同样的方法冲胚。进针时避免损伤血管，推注冲卵液时力度和速度不宜太快。子宫法对输卵管损伤很小，但回收率较输卵管法低，用液较多，检卵时用的时间较多。?3)冲卵管法将子宫取出后，在子宫体上扎孔，将冲卵管插入，使气球在子宫角分叉处，使冲卵管尖端靠近子宫角前端，用注射器注入8,10ml气体，然后进行灌流，分次冲洗子宫角，每次灌注10,20ml，一侧用液50,60ml，冲完后，气球放气，用同样方法冲洗另一侧。?3胚胎保存?3.1胚胎常规保存?采集到的胚胎，如果不能立即移植给受体羊，可经短期或长期保存。生产上进行鲜胚移植时，一般上午采集的胚胎，下午移植，或将胚胎净化后，在胚胎保存液(国产或进口)中室温条件下短期培养4,5天对胚胎的存活影响不大。据报导，将绵羊胚胎在0,13?、保存10天仍然能移植成功(谭丽玲，1978)，在冰箱中4,6?的条件下保存4天，胚胎存活率也很理想(丁红，1995)。?3.2胚胎的冷冻保存?“冷”处理对“细胞”生命活动影响的报导最早始于1776年的Spallanzani对精子的冷冻保存试验。1972年，Whittinghan用快速冷冻法成功地保存了小鼠胚胎，随后用慢速冷冻法冷冻牛胚胎也获得成功。Rall和Fehy于1985年发明了玻璃化冷冻胚胎法。目前应用胚胎冷冻技术已经能够长期保存绵羊胚胎，并向着实用易行的方向发展。?冷冻剂的种类是影响胚胎冷冻解冻后存活率的重要因素之一。冷冻剂的种类很多，低分子量可渗透性保护剂，如甘油、乙二 醇、丙二醇、二甲基亚砜、乙烯醇、乙烯胺及甲醇等;低分子不可渗物质如，海藻糖、半乳糖、葡萄糖、蔗糖等;大分子保护剂如，聚乙烯吡咯烷酮、左旋糖苷、白蛋白等。在最初的研究中一般使用一种保护剂，随着研究的深入，发现混合保护剂能有效提高胚胎冷冻存活率及移植受胎率。低温保护剂的基础液大多用PBS缓冲液配制，根据不同试验需求加丙酮酸、钠、血清、白蛋白等 (L.J.Maclellan,etal2001)，有的直接采用H,SOF培养液(N.Oberstein,etal.2001)。常用的绵羊胚胎冷冻方法有:?1)慢速冷冻法这是一种较传统的哺乳动物胚胎冷冻法，使用渗透较慢的低温保护剂。可分为慢速冷冻、慢速解冻和慢速冷冻、快速解冻法。前种方法脱水完全，细胞内形成冰晶较少，但耗时间长，且解冻时细胞内易出现重结晶现象，损伤细胞。后者可防止解冻时细胞内发生重结晶，但由于温度恢复过快，细胞内外渗透压急剧变化，易引起胚胎细胞破裂死亡 (WhittinghamDG,1972;FridlerSetal,1988;rayosAAetal,1992)。?2)快速冷冻法这是将胚胎部分脱水后，以高于1250?/min的速度快速冷冻胚胎的方法。胚胎在高浓度的低温保护剂中平衡，但细胞内外水分都要结晶，另外短暂的平衡过程，细胞脱水并不完全，易在细胞内形成冰晶，导致胚胎发生物理损伤(严云谨，1995)。?3)一步细管法将冷冻液(1.5M甘油)和稀释液(0.5,1.0M蔗糖)装在同一细管中，中间用气泡隔开，解冻后，摇动细管使冷冻液和稀释液混合，胚胎处于蔗糖溶液中，因为蔗糖是不可渗的，所以甘油和水渗出细胞。胚胎收缩，胚胎移入受体子宫后子宫液中的水分渗入细胞，又使胚胎恢复原来的体积。?4)玻璃化冷冻在急速降温的过程中，抗冻液变得粘稠，形成无晶的玻璃化状态Rall和Fahy(1985)最初用20.5,DMSO,15.5,乙酸胺,10,丙二醇,6,聚乙二醇作为玻璃化冷冻液冷冻小鼠胚胎，获得了87.7,的冷冻存活率。但用DMSO\乙酰胺\丙二醇\聚乙二醇等作为抗冻剂，溶液的毒性较大，胚胎需在低温下多步平衡后，才能投入液氮中保存，且结果不稳定。近年来对玻璃化胚胎冷冻研究趋向于向冷冻保护剂添加各种物质，如糖类、抗冻蛋白、透明质酸、松驰素、盐等以提高冷冻效果(L.J.Maclellan,etal2001)。 ?5)三步平衡冷冻法冷冻液保存液为10,的甘油及改进的PBS混合液。将胚胎分别在3,、6,、10,的甘油冷冻液中浸5min，并按一定顺序装入吸管，封好，直接进入冷冻仪的酒精槽内，以1?/min速度从室温至-6?,-7?，停5min后植冰，在停10min，以0.3?/min降至-36?(李成，王健，2002;张海燕，李俊，2001)，再以0.1?/min的速度降至-38?，直接投入液氮长期保存(郭志勤，1998)。?6)胚胎解冻取出胚胎，迅速将试管投入38?水浴中浸10s。胚胎冻存液一旦溶解后，要尽快弃除冷冻保护液，防止冷冻保护剂对胚胎产生毒性，如可分别在含6,、3,和0,甘油的蔗糖PBS解冻液中放置5min，最后移至PBS液中待检(郭志勤，1998)。也有的分别在1M、0.5M的蔗糖液中分别停留5min，再用20,血清的PBS液冲洗2,3次(石国庆，刘守仁，2001)。?4胚胎分割?胚胎分割是指用人工方法将一枚植入前的胚胎分割成两个或多个部分，每一部分移植后可发育成一个正常个体。最早Tarkowsi(1959)就发现一半卵裂球已被破坏的2,细胞小鼠胚胎可以发育成囊胚，并出生了小鼠，表明早期胚胎的每个卵裂球均具有发育的全能性，即发育成正常的个体。Willadsen(1980)用琼脂包埋分割的绵羊2、4、8,细胞期的胚胎，使半胚在中间受体内发育时受到保护，并防止其内的卵裂球分散，取得了近似正常的妊娠率(66,)。采用此法，MatsumotoK等(1989)就在绵羊上得到了较高的半胚发育率，出生了同卵双生的绵羊。常用的胚胎分割方法有:?1)直接分割法该法多用于晚期桑椹胚或胚泡期的胚胎分割。用显微手术刀或玻璃针将整个胚胎分割为二。也可先在培养皿上轻轻划一痕迹，将胚胎移至划线中部，用刀片在胚胎中部从上至下将胚胎一分为二，再将半胚移入干净液滴中冲洗，装管移植。此法简便易行，无需专门仪器，但需防止胚胎污染。?2)徒手分割法一般在胚胎分割前，先用0.25,链霉素蛋白酶软化1min，用2,FCS的PBS洗2次，用成0.2ml的小液滴，使用专用小刀片徒手将胚胎一分为二，或直接切割胚胎为二分胚。?3)微吸管吹吸法在显微下，把胚胎用微吸管吸引固定，用微细玻璃针穿透明带，再用一根尖端仅允许单卵裂球通过的吸管轻轻吹吸，将卵裂球分离成半。此法多用于分割绵羊大鼠的2、4、8,细胞期胚胎。?4)除此之外，还有酶软化 透明带后玻璃针分割法、酶消化去透明带后分割法等，需要用0.25,,0.50,的链霉素蛋白酶软化或去掉胚胎透明带，或再经过无钙、镁的平衡盐溶液中处理，然后进行切割或吹吸，对绵羊胚胎进行分割。?5胚胎性别鉴定?胚胎的早期性别鉴定和控制对绵羊育种、生产和遗传疾病的防治具有非常重要意义。从二十世纪以来，人们对性别决定机理的研究已经由形态水平发展到分子水平，大量的研究都表明，哺乳动物性别决定依赖于Y染色体上的SRY基因。其他研究，在X染色体和一些常染色体上也存在一些与性别决定相关的基因(BardonBetal,1994)，如威尔氏瘤抑制基因,WTL (HastieND,1992;KentJ,etal,1995)，抗牟勒管激素基因,MIS/mis(LuoxIKeday,etal,1994)，SF,1基因(GiuliG,etal,1997)，DAX,1/dax,1基因(ZarnariaE,Muscatellif,BardoniB,etal,1994)，以及SRY相关基因SOX3 (SteranovicM,etal,1994;GriffithSR,1991;McEcreavasK,etal,19 93)，SOX9(FosterJW,etal,1994)等。雄性动物以SRY为核心，但在决定性别发育过程中都或多或少地与上述基因相关联。?最初用于胚胎性别鉴定的方法由细胞遗传学鉴定方法、免疫学方法(H,Y抗原法)、X染色体相关酶法、Y,染色体特异性DNA探针杂交法等，但这些方法在生产上的应用还有一定的局限性，雄性特异性基因(SRY)的发现和PCR技术的广泛应用，使性别控制在生产中应用成为可能(SinclairAHetal,1990)。?使用多聚酶链反应(PCR)法原理是:因为SRY是性别决定基因，只要有SRY存在，无论在Y染色体还是在X染色体，胚胎都将发育成雄性，否则发育为雌性。通过合成SRY基因或其它Y,染色体上的特异性片段的部分序列作为引物，在一定条件下进行PCR扩增，能扩增出特异性雄性目标片段的为雄性胚胎。此法准确率达95,,100,，速度快，灵敏度高，但在操作过程中要防止污染以避免出现假阳性带(PearuT,HyttinenJ,etal,1991)。常用引物有牛的BRY4a1139,1178T和1439,1459、牛的DRY11,21和281,301(PecuraTetal,1992)、SRY基因引物等。?6胚胎移植?受体羊的手术部位、方法与采卵时相同。移植分为输卵管移植和子宫移植两种。移植部位:一般把受精卵和桑椹胚移植到输卵管，把致密桑椹 胚阶段以后的胚胎移植到子宫角前1/3处。每只受体移植胚胎数鲜胚1,2枚，解冻胚3,4枚，观察受体卵，把胚胎移入有黄体一侧的子宫角。?7妊娠诊断?通过妊娠诊断，对未能继续妊娠的受体羊及时用优良种羊进行配种，生产杂种，与让其空怀相比，同样能增加生产效益。最简单、经济的确定胚胎移植受体是否妊娠的方法是胚胎移植后经过两个情期的观察不返情，则判断为妊娠(赵霞，达来，2002)。也可于胚胎移植后14,16天取晨尿，检查HCG，如果为阳性则于2,3周后进行超声检查。?B型超声波在绵羊胚胎发育和妊娠诊断方面的应用非常广泛。据陈兆英(1996)报道，B超诊断绵羊妊娠的最早时间为18,20天，19天即可看到胎体，20天以后即可看到其胎心搏动，33天能隐约区分胎头(李小慧，杨利国，2002)。妊娠阳性可以妊体，胎体或子叶为依据，准确率高达90.5,,100,(郭志勤，1998)。?8影响胚胎移植的主要因素?8.1超排技术?超数排卵是胚胎移植的关键技术之一，可以为胚胎移植受体提供优质、丰富的胚源，保证优良母羊发挥最大的繁殖潜能。但影响超排的因素很多，如超排使用的药物种类，来源，生产厂家，使用剂量，操作程序等。?8.2移植胚胎的质量?胚胎质量的好坏是胚胎移植能否成功的关键因素。通过胚胎鉴定，要选择具有形态结构完整紧凑、轮廓清楚、呈球形、分裂球大小均匀、色调和透明度适中及无附着的细胞和液泡等特征的一级(A级)、或二级(B级)胚胎进行移植。?8.3供体、胚胎与受体的同期化程度?供、受体之间的子宫内膜要与胚胎的发育相同步，这是胚胎从体外培养环境到体内并发生妊娠必须具备的重要条件之一。这就要求供体与受体在发情时间上要同期，或移植的胚胎日龄与受体发情时间是同步，一般供、受体发情同步差为?1天以内最理想。同步差月小，越有利于胚胎的发情，移植成功率越大。?8.4移植胚胎的数目?一般认为，妊娠率与移植高质量的胚胎数成正相关，移植1枚、2枚和3枚胚胎受体的妊娠率差异不显著，但产羔率却一次增加。也有研究报道，当移植胚胎数超过6枚时，妊娠率反而下降。据研究单侧移植2,3枚效果最佳，进行大规模的胚胎移植时，还要考虑受体羊的体况、产羔时繁重的接羔任务及产后受体羊的哺乳能力等。?8.5操作技术?胚胎移植的每个操作环节在实际操作中都十分复杂，都直 接影响胚胎移植的成败。尤其手术操作要求熟练、稳重、轻巧、速度适宜。向宫腔内注入移植液和胚胎时速度不能过快，否则胚胎会随移植液进入输卵管而发生异位妊娠;如果速度太慢，子宫、输卵管等暴露于空气时间过长，增加污染率，同时也增加了胚胎的损伤率。术者手、臂、手术器械等对子宫的强烈刺激，对输卵管进行强拉硬拽都会产生不良影响。?8.6其它?受体本身的黄体发育与孕酮含量、解冻剂与脱防冻剂的类型、胚胎移植的季节、供体年龄及营养状况等因素都不同程度影响胚胎移植的成功率。?9小结?随着胚胎移植技术的日臻完善，绵羊胚胎移植技术的研究已经逐步由试验研究向商业化生产阶段转变。这一技术在生产中的广泛应用，充分发挥了优良绵羊品种的遗传优势，较快地实现在短时间内提高绵羊的良种化程度，不仅促进养羊业的发展，也为当地经济繁荣带来广阔前景。对绵羊胚胎移植产业化进行研究，必将对肉羊新品种的引进和肉羊生产开发产生积极的推动作用。