硝酸还原酶
植物体内硝酸还原酶活力的测定
P56—59
硝酸还原酶(NR)是植物氮素同化的关键美，它催化植物体内的硝酸盐还
——+ +原为亚硝酸盐:NO，NADH，H? NO，NAD+HO产生的亚硝酸盐与对322
氨基苯磺酰胺)及α—萘胺(或萘基乙烯胺)在酸性条件—氨基苯磺酸(或对—
下定量生成红色偶氮化合物。
生成的红色偶氮化合物在540nm有最大吸收峰，可用分光光度计法测定。硝酸还原酶活性可由产生的亚硝态氮的量表示。一般以每克鲜重含氮量表示，即
——11ug?g?h为单位。NR的测定可分为活体法和离体法。活体法步骤简单，适合快速、多组测定。离体法复杂，但重复性好。
一、离体法
仪器与用具:
冷冻离心机;分光光度计;天平;冰箱;恒温水浴锅;研钵;剪刀;离心管;具塞试管(10ml);移液管(5、2、1ml);洗耳球。
试剂:
亚硝酸钠
标准
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溶液:准确称取分析纯NaNO2 0.9857g溶于去离子水定容至1000ml，然后再吸收5ml定容至1000ml，即为含亚硝态氮 1ug/ml的标准溶液;
0.1mol/L PH 7.5 的磷酸缓冲液:NaHPO?12HO 30.0905g与242
NaHPO?2HO 2.4965g加去离子水溶解后定容至1000ml; 242
1%(W/V)溶液:1.0g对氨基苯磺酸溶于100ml 3mol/L HCl中(25ml浓盐酸加水定容至100ml即为3mol/L HCl);
0.02%(W/V)萘基乙烯胺溶液:0.0200g萘基乙烯胺溶于100ml去离子水中，贮于棕色瓶中;
0.1mol/L KNO溶液:2.5275g KNO溶于250ml 0.1mol/L PH 7.5 的磷酸缓冲33
液中;
0.025mol/L PH 8.7的磷酸缓冲液:8.8640g NaHPO?12HO ，0.0570g 242KHPO?3HO加去离子水溶解后定容至1000ml; 242
提取缓冲液:0.1211g半胱氨酸，0.0372g EDTA溶于100ml 0.025mol/L PH8.7
的磷酸缓冲液中;
2mg/ml NADH溶液:2mg NADH溶于1ml 0.1mol/L PH 7.5 的磷酸缓冲液(临用前配置)。
方法:
1. 标准曲线制作
取7支洁净烘干的15ml刻度试管按表15—1顺序加入试剂，配成0—2.0ug的系列标准亚硝态氮溶液。摇匀在25?下保温30min，然后在540nm下比色测定。以亚硝态氮(ug)为横坐标(X)，吸光值为纵坐标(Y)建立回归方程。
表15—1 0—2.0ug的系列标准亚硝态氮溶液配制表
管号 1 2 3 4 5 6 7
亚硝酸钠标准液 0 0.2 0.4 0.8 1.2 1.6 2.0
蒸馏水 2.0 1.8 1.6 1.2 0.8 0.4 0 试剂1%磺胺 4 4 4 4 4 4 4 (ml) 0.02%萘基乙烯胺 4 4 4 4 4 4 4
每管含亚硝态氮
0 0.2 0.4 0.8 1.2 1.6 2.0
(ug)
2. 样品中硝酸还原酶活力测定
? 酶的提取:称取0.5g鲜样，于研钵中剪碎置低温冰箱冰冻30min，取出置冰浴中加少量石英砂及4ml提取缓冲液，研磨匀浆，转移于离心管中在4? 4000r/min下离心15min，上清掖即为粗美提取液。
? 酶的反应:取粗酶掖0.4ml于10ml试管中，加入1.4ml 0.1mol/L KNO磷酸3溶液和0.2ml NADH溶液，混匀，在25?水浴中保温30min，对照不加NADH溶液，而以0.2ml 0.1mol/L PH 7.5 的磷酸缓冲液代替。
? 终止反应和比色测定:保温结束后立即加入1ml磺胺溶液终止酶反应，再加1ml萘基乙烯胺溶液，显色15min后于4000r/min下离心5min，取上清液在540nm下比色测定。根据标准曲线计算出反应液中所产生的亚硝态氮总量(ug) 3. 原始数据的记载
4. 结果计算:
——11样品酶活性(ug?g?h)=(X×V/V)/[W×t(h)] 12
式中:X——反应液酶催化产生的亚硝态氮总量(ug)
V——提取酶时加入的缓冲液的体积(ml) 1
V——酶反应时加入的粗酶体积(ml) 2
W——样品重量(g)
t——反应时间(h)。
二、活体法
仪器与用具:
真空抽气泵;抽器用真空干燥器;50ml三角瓶;玻璃瓶塞(其他用具同离
体法)
试剂:
亚硝酸钠标准溶液:准确称取分析纯NaNO2 0.9857g溶于去离子水定容至1000ml，然后再吸收5ml定容至1000ml，即为含亚硝态氮 1ug/ml的标准溶液;
0.1mol/L PH 7.5 的磷酸缓冲液:NaHPO?12HO 30.0905g与242
NaHPO?2HO 2.4965g加去离子水溶解后定容至1000ml; 242
W/V)溶液:1.0g对氨基苯磺酸溶于100ml 3mol/L HCl中(25ml浓盐1%(
酸加水定容至100ml即为3mol/L HCl);
0.02%(W/V)萘基乙烯胺溶液:0.0200g萘基乙烯胺溶于100ml去离子水中，贮于棕色瓶中;
0.1mol/L KNO溶液:2.5275g KNO溶于250ml 0.1mol/L PH 7.5 的磷酸缓冲33
液中;
30%三氯乙酸溶液:30g三氯乙酸，水溶后定容至100ml。 方法:
1. 标准曲线制作
同离体法
2. 酶反应及活性测定
? 取样 称取作物叶片1.0—2.0g共4份，剪成1cm左右的小段，放于4只三角瓶中，其中1份作对照，另外3份做酶活性测定用。
? 反应 先向对照三角瓶中加入1ml30%三氯乙酸溶液，然后各三角瓶中都加入9ml 0.1mol/L KNO溶液，混匀后立即放入干燥器中，抽气1min再通入空气，3
再抽真空。反复几次，以排除组织间隙的气体，至叶片完全沉入瓶底，以便底物溶液进入组织。最后通入氮气密封后，在25?黑暗中反应0.3h，分别向测定瓶(对照瓶除外)加入1ml 30%三氯乙酸终止酶反应。
? 比色测定 将各瓶摇匀静置2min后，各取2ml反应液，加入1ml磺胺和1ml 萘基乙烯胺，摇匀显色15min后，于4000r/min下离心5min，取上清液于540nm处测其吸光值。根据标准曲线计算出反应液中生成的亚硝态氮总量(ug)。 3. 原始数据记录。
4. 结果计算 同离体法
注意事项:
1. 硝酸还原酶容易失活，离体法测定时，操作应迅速，并且在4?下进行。 2. 取样宜在晴天进行，最好提前一天施用一定量的硝态氮肥，取样部位应一致。
3. 硝酸盐还原过程应在黑暗中进行，以防亚硝酸盐还原为氨。
4. 从显色到比色时间要一致，显色时间过长或过短对颜色都有影响。
浙公网安备 33021202002483