[策划书]叶绿素等的测定方法

[策划书]叶绿素等的测定方法 叶绿素等的测定方法 1 叶绿素含量测定: 80,的丙酮液的配制:4L丙酮 + 1L蒸馏水。 称0.5g左右的叶片放在50ml的离心管(做三个重复)，加入25ml浓度为80,的丙酮液，放在黑暗处浸提大约36小时后取出，稀释4倍后分别在波长663nm、645nm、652nm和470nm下测定光密度，以80,的丙酮液为空白。(参考陈建勋，王晓峰主编的《植物生理学实验指导》,P35,36) 也可用95%乙醇溶液，在665、649、470nm处有最大吸收峰 Ca=13.95D665-6.8649 Cb=24.96D649-7.32D665 Cx.c=(1000D470-2.05Ca-114Cb)/245 2 抗氧化酶活性的定:(2.5g样) 0.05mol/L磷酸缓冲溶液 (PBS)(pH=7.8)溶液的配制:65.5506g Na2HPO4?12H2O + 2.65285g NaH2PO4?2H2O, 定容到4L。(参考陈建勋，王晓峰主编的《植物生理学实验指导》，P134)。 取低温保存的鲜样，称2g左右的叶片(或根)放在50ml的离心管，加入20ml浓度为0.05mol/L磷酸缓冲溶液(pH=7.8)(最好是较冷的磷酸缓冲溶液，防止研磨时温度过高使酶失活)，研磨(用磨碎机磨)，8000r/min的冷冻离心机下离心20分钟，上清液为粗酶液。 2.1丙二醛(MDA)的测定: 20,三氯乙酸(TCA)溶液的配制:称200g三氯乙酸，用蒸馏水定容到1000ml。(参考陈建勋，王晓峰主编的《植物生理学实验指导》,P124); 0.5% 硫代巴比妥酸(TBA)溶液的配制:称5g硫代巴比妥酸(TBA),用20,三氯乙酸(TCA)溶液溶解并定容到1000ml。(参考陈建勋，王晓峰主编的《植物生理学实验指导》,P124)(先加少量的氢氧化钠1mol/L溶解); 0.5ml酶液(对照用0.5ml的0.05mol/L pH=7.8的磷酸缓冲液代替酶液)(做三个重复)+ 3mlTBA――振荡――沸水浴上反应30min―― 冷却(至少30min)――比色(OD600、OD532、OD450)。(参考陈建勋，王晓峰主编的《植物生理学实验指导》，P124) 2.2超氧化物歧化酶(SOD)的测定: NBT(400ml)混合反应液br /> 392mlPBS(Ph=7.8),+0.0206g NBT+ 0.776g甲硫酸铵+8ml核黄素溶液+0.4ml EDTA-Na溶液 (100mlPBS缓冲溶液中含0.01204g核黄素)。 (另配)100ml PBS溶液加EDTA-Na 3.7224gEDTA-Na 测试时:取3ml反应液+0.05ml(根)或0.02 ml(叶)粗酶液，于光照培养箱中6-10分钟，OD650下测定吸光度。 2.3过氧化物酶(POD)的测定: 0.05mol/L磷酸缓冲溶液(PBS)(pH=7.0)溶液的配制:10.9251g Na2HPO4?12H2O + 3.042975g NaH2PO4?2H2O,定容到1000ml。 0.3%H2O2溶液的配制:吸2.5ml 30%H2O2，用0.05mol/L pH=7.0磷酸缓冲溶液(PBS)定容到250ml。 0.2%愈创木酚溶液的配制:称0.5g愈创木酚，用0.05mol/L pH=7.0 磷酸缓冲溶液(PBS)定容到250ml。 2ml 0.3%H2O2溶液 + 0.95ml 0.2%愈创木酚溶液 + 1ml 0.05mol/L pH=7.0磷酸缓冲溶液(PBS) + 0.02ml,,(原来为0.01)酶液(根加0.05ml酶液)(对照用0.05mol/L磷酸缓冲溶液代替酶液)(做三个重复)，记录470nm处OD降低速度。将每分钟OD增加0.01定义为1个活力单位。(参考陈建勋，王晓峰主编的《植物生理学实验指导》P121) 比色时加酶液，混合后即刻计时。 2.4 脯氨酸的测定 标准 excel标准偏差excel标准偏差函数exl标准差函数国标检验抽样标准表免费下载红头文件格式标准下载 曲线的制作: 编号 1 2 3 4 5 6 7 标准脯氨酸的量(ml) 0 0.1 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 H2O(ml) 1.0 0.9 0.8 0.6 0.4 0.2 0 冰乙酸(ml) 2 2 2 2 2 2 2 显色液(ml) 3 3 3 3 3 3 3 脯氨酸含量(μl) 0 1 2 4 6 8 10 0.5ml酶液(对照用0.5ml 80,乙醇代替)(做三个重复) + 1ml冰乙酸 + 1.5ml显色液―――混匀，沸水浴15min，冷却后测OD520。 2.5可溶性蛋白的测定(参考赵志杰，史国安，董新纯编的《植物生理学实验指导》) 牛血清白蛋白:配成100μg/ml和1000μg/ml。 90,乙醇:90ml乙醇 + 10ml蒸馏水。,,, 85,(W/V)磷酸:170ml磷酸 + 30ml蒸馏水。 考马斯亮蓝G-250:称0.2g考马斯亮蓝G-250溶于100ml 90,乙醇中， 加入85,(W/V)磷酸200ml，用蒸馏水定容到2L。常温下可保存一 个月。 标准曲线的制作: 配制0,100μg/ml血清白蛋白血液 管号 1 2 3 4 5 6 100μg/ml牛血清白蛋白(ml) 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 蒸馏水量(ml) 1.0 0.8 0.6 0.4 0.2 0 蛋白质含量(ml) 0 0.02 0.04 0.06 0.08 0.10 配制0,1000μg/ml血清白蛋白血液 管号 7 8 9 10 11 12 100μg/ml牛血清白蛋白(ml) 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 蒸馏水量(ml) 1.0 0.8 0.6 0.4 0.2 0 蛋白质含量(ml) 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 0.1ml 酶液(做三个重复) + 5ml考马斯亮蓝G-250―――混匀，放置2min后在595nm下比色。 2.6过氧化氢酶(CAT)的测定: 0.3%H2O2溶液的配制:吸5ml 30%H2O2，用0.05mol/L pH=7.0磷酸缓冲溶液(PBS)定容到500ml。 1 ml 0.3%H2O2溶液 + 1.9ml H2O + 0.1 ml 酶液，测定240nm处OD降低速度。将每分钟OD减少0.01定义为1个活力单位。(参考陈建勋，王晓峰主编的《植物生理学实验指导》P121) 2.7 抗坏血酸(ASA)的测定:(参考陈建勋，王晓峰主编的《植物生理学实验指导》,P125) 5, 三氯乙酸(TCA)溶液的配制:25g三氯乙酸，用蒸馏水定容到500ml。 10, 三氯乙酸(TCA)溶液的配制:25g三氯乙酸，用蒸馏水定容到 250ml。 150mmol/L NaH2PO4(pH 7.4)溶液的配制:100ml。 44, H3PO4溶液的配制:250ml。 4, 2,2-二联吡啶溶液的配制:250ml。 3, FeCl3溶液的配制:100ml。 首先标制作准曲线。 粗酶液的提取:取低温保存的鲜样，称0.5g左右的叶片(或根)放在50ml的离心管，加入15m 5,三氯乙酸(TCA)溶液(最好是较冷的三氯乙酸(TCA)溶液，防止研磨时温度过高使酶失活)，研磨(用磨碎机磨)，15000r/min的冷冻离心机下离心10分钟，上清液为粗酶液，用于抗坏血酸(ASA)含量的测定。(参考陈建勋，王晓峰主编的《植物生理学实验指导》P125,126) 测定:0.2ml 粗酶液 + 0.2ml 150mmol/L NaH2PO4(pH 7.4)溶液 + 0.2ml H2O，混匀(振荡)，至少30秒后，再依次分别加入:0.4 ml 10,三氯乙酸(TCA)溶液 + 0.4 ml 44, H3PO4溶液 + 0.4 ml 4, 2,2-二联吡啶溶液 + 0.2ml 3, FeCl3溶液，混合后在37?水浴中保温60min，测定OD525处的值。(参考陈建勋，王晓峰主编的《植物生理学实验指导》P125,126) 2.8 谷胱甘肽的测定: 4g新鲜材料 + 2ml 0.3mol/L醋酸汞 + 2ml 30,醋酸钠后研磨匀浆，转移到离心管中，以蒸馏水冲洗残渣，并以玻璃棒搅拌，净置10min， 使之充分沉淀，离心后弃去上清液，沉淀以水(每次10ml)在摇动情况下冲洗2次。向沉淀中加入10ml 1mol/L盐酸以溶解其中的谷胱甘肽，以玻璃棒搅拌5min后加入1ml 20,的碘化钾溶液，混匀，离心。上清液转入供滴定用的100ml玻璃管中，沉淀在搅动情况下以10ml水冲洗。离心后溶液与第一次离心液合并。向得到的溶液中加入0.5ml淀粉液，用1mmol/L KIO3滴定，直至出现不消失的蓝色为止。1ml 1 mmol/L 的KIO3相当于0.307mg谷胱甘肽。(参考《现代植物生理学实验指南》，中国科学院上海植物生理研究所编)。 2.9天冬酰胺合成酶(AS)的测定: 2.10 天冬酰胺转氨酶(AspAT)的测定: 3 硝酸还原酶(NR)的测定采用离体法:(1g样)(参考陈建勋，王晓峰主编的《植物生理学实验指导》,P27,29) 亚硝酸钠标准溶液(1μg/ml):称NaNO2 0.9857g ,定容到1000ml，再吸5ml定容到1000ml。 0.1 mol/L pH7.5的磷酸缓冲溶液:30.0905g Na2HPO4?12H2O + 2.4965g NaH2PO4?2H2O，加蒸馏水定容到1000ml。 3mol/L HCl:125ml浓盐酸加蒸馏水定容到500ml。 1, 磺胺溶液:5.0g磺胺溶于500ml 3mol/L HCl中。 0.2, a-萘胺溶液:1.0g a-萘胺溶于125ml冰醋酸后用蒸馏水定容到500ml，贮于棕色瓶中。 0.1mol/L KNO3溶液:5.055g KNO3溶于500mln 0.1 mol/L pH7.5的磷酸缓冲溶液。 0.025mol/L pH8.7的磷酸缓冲溶液:Na2HPO4?12H2O 8.8640g + NaH2PO4?2H2O 0.0570g，加蒸馏水定容到1L。 提取缓冲液:1.211g半胱氨酸 + 0.372g EDTA，溶于1L 0.025 mol/L pH8.7的磷酸缓冲溶液。 2mg/ml NADH 溶液:0.5g NADH溶于250ml 0.1 mol/L pH7.5的磷酸缓冲溶液(临用前配制)。 首先标制作准曲线br /> 取7支洁净烘干的15ml刻度试管加试剂，即配成0,2.0μg的系列标准亚硝态氮溶液。摇匀后在30?保温箱或恒温水浴中保温30min，然后在540nm波长下比色。以亚硝态氮(μg)为横坐标(x)，光密度值为纵坐标(y)绘标准曲线或建立回归方程。 各试剂加入顺序 管 号 1 2 3 4 5 6 7 亚硝酸钠标准液(ml) 0 0.2 0.4 0.8 1.2 1.6 2.0 蒸馏水(ml) 2.0 1.8 1.6 1.2 0.8 0.4 0 1, 磺胺溶液(ml) 4 4 4 4 4 4 4 0.2%α-萘胺(ml) 4 4 4 4 4 4 4 每管含NO2- (μg) 0 0.2 0.4 0.8 1.2 1.6 2.0 1g 材料+15ml提取缓冲液后研磨匀浆，转移到离心管中于4?、4000r/min下离心15min,上清液即为粗酶提取液，用于硝酸还原酶(NR)的测定。 0.4ml+1.2ml 0.1mol/L KNO3溶液 + 0.4mlNADH溶液后混匀(对照不加NADH溶液，而以0.4ml 0.1mol/L pH 7.5磷酸缓冲液代替)，在25?水浴中保温30min。保温结束后立即加入1ml磺胺溶液终止酶反应，再加1ml 0.2, a-萘胺溶液，显色反应15min后于4000r/min下离心5min，取上清液在540nm下比色测定吸光度。根据回归方程计算。