胃泌素释放肽前体融合蛋白的制备及其在肿瘤研究中的应用

胃泌素释放肽前体融合蛋白的制备及其在肿瘤研究中的应用 胃泌素释放肽前体融合蛋白的制备及其在 肿瘤研究中的应用 ? 828?皇虽药塑与lf2007年11月第7卷第l1期ChineseRemedies&Clinics,November2007,Vol7,No.11 胃泌素释放肽前体融合蛋白的制备及其 在肿瘤研究中的应用 朱爱萍张青云王雅明徐建军邓丽娟 【摘要】目的克隆胃泌素释放肽前体(pro—GRP)~,构建重组质粒pGEM—T—pro—GRP和表达载体 PMS,31b—pro—GRP,在大肠杆菌中热诱导表达并制备融合蛋白. 方法 快递客服问题件处理详细方法山木方法pdf计算方法pdf华与华方法下载八字理论方法下载 从BGC823胃癌细胞中提取总RNA,利用 pro—GRP特异引物,扩增人pro—GRP分子的eDNA全长.将pro—GRP基因定向克隆于pGEM—T载体转化JM109, DNA测序鉴定基因序列.将pro—GRP基因定向克隆于原核高效表达载体PMS一31b,转化大肠杆菌POP2136经 42热诱导表达MS2-pro—GRP融合蛋白.将融合蛋白分离纯化后,十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS— PAGE)凝胶鉴定.结果经聚合酶链反应(PCR)扩增成功获得210bp的pro—GRP基因,目的基因序列正确. SDS—PAGE显示热诱导后表达的融合蛋白分子量约为18000.结论成功克隆pro,GRP基因,并表达和纯化了 PMS一31b—pro—GRP融合蛋白,为建立pro—GRP 检测 工程第三方检测合同工程防雷检测合同植筋拉拔检测方案传感器技术课后答案检测机构通用要求培训 方法奠定了基础. 【关键词】胃泌素释放肽;克隆;制备;应用 Prepareandapplicationofrecombinanthumanpro-gastrinreleasingpeptidezHUAi-ping.Z HANGQing-yurg— WANGYa-ming,uJian-jlzn.DENGLi-jlZO2Z.DepartmentofClinicalLaboratory,Peking UniversitySchoolofOn— cology,BeOing1Oo036.China 【Abstract】 ObjectiveToclonethehumanpro-gastrinreleasingpeptide(pro-GRP)gene,constructthepGEM- T—pro—GRPrecombinantplasmidandPMS一3lb—pro— GRPvector.andtoproducethefusionproteinbyheat—induced expressioninEseheriehiacoli.MethodsThetotalRNAwasextractedfromBGC823cells.Usingpro—GRPspecific primers.wesamplifiedthefull—lengthcDNAofhumanpro—GRP.TheRT— PCRproductswereligatedtopGEMvector totransfeetJM109forDNAsequencing.Afterthis,therecombinantpro— GRPwasligatedtotheexpressionvector pMS'3lbandtransfeetedintoEcolifPOP2136).whereMS2-pro— GRPfusionproteinwasexpressedbyheat—induction at42degreeCelsius.ResultsTheacquiredgenewas210bpanditssequencewascorrect.Thegeneproduct.char- aeterizedbySDS— PAGE.appearedtobeafusionproteinwithmolecularweightof18000.ConclusionTheclone, expressionandpurificationofhumanpro-gastrinreleasingpeptidelayafoundationfordetectionofpro-GRP. 【Keywords】Gastrinreleasingpeptide;Cloning;Preparation;Application 胃泌素释放肽(gastrinreleasingpeptide,GRP) 是蛙皮素样肽的同系物…,是一种其他胃肠道激素 的有效的促分泌素或调节肽,是正常人脑,胃的神经 纤维以及胎儿肺的神经内分泌组织中存在的激素, 许多小细胞肺癌(SCLC)细胞株和肿瘤组织中也分 泌GRP,且富含GRP受体(GRPR),低水平GRP即 可刺激SCLC细胞DNA合成,因而GRP被认为是 SCLC的自主生长因子拉].是SCLC的重要产物,血 GRP*平是SCLC重要的标志物. 资料表明,GRP和GRPR在肿瘤的发生,发展 及其治疗中起着重要的作用].由于GRP可被肽 基金项目:北京市科委肿瘤分子生物学高技术 实验室 17025实验室iso17025实验室认可实验室检查项目微生物实验室标识重点实验室计划 基金资助项 目(953850500) 作者单位:100036北京大学临床肿瘤学院北京肿瘤医院检验科 (第—作者现在山西医科大学第二医院检验科) 通讯作者:张青云,Email:zhqy208@163.com 链端解酶快速降解,所以很难在血清中检测到GRP. 胃泌素释放肽前体(pro—GRP),是GRP的前体结构, 根据其部分氨基酸的变异可分为3种生物大分子. 这3种pro—GRP分子具有共同的C末端序列(3l一 98),它可在血浆中稳定表达,且pro—GRP水平代表 GRP水平和GRP基因表达.是一种新的SCLC的肿 瘤标志物,正逐渐应用于临床.pro—GRP作为SCLC 新的肿瘤标记物具有敏感性高,特异性强的特点,并 可准确反映SCLC对化疗的反应.可见pro—GRP融 合蛋白的制备能为进一步研究GRP的功能,应用提 供必备的实验支持.目前国内未见pro—GRP融合蛋 白制备的报道,现将我们做的部分工作 报告 软件系统测试报告下载sgs报告如何下载关于路面塌陷情况报告535n,sgs报告怎么下载竣工报告下载 如下. 1资料与方法 1.1菌种,质粒:BGC823胃癌细胞株,大肠杆菌菌 株JM109,POP2136和原核表达载体PMS一31b由北 京肿瘤医院检验科提供. 中国药物与临床2007年11月第7卷第11期 ChineseRemedies&Clinics,November2007,Vol7,No.11 1.2主要试剂及酶类:dNTPs,DeepVentDNAPoly— merase,TaqDNAPolymerase,RNA酶抑制剂,M— MLV逆转录酶,限制性内切酶EcoRI,XbaI,T4DNA Ligase,pGEM—TVectorSystems为Promega公司产 品:DNA回收试剂为天为时代公司产品;胰蛋白胨, 酵母菌提取粉,细菌琼脂粉,琼脂糖为Oxoid公司产 品. 1.3RT—PCR扩增pro—GRP目的基因:Trizol法提 取BGC823胃癌细胞RNA.逆转录体系中加入 RNA2.5l,OligodT(0.5g/1)1l,DEPCH2O9.8 l,70~(210min再加RNAsin(50U/1)1l,5xM— MLVBuffer5l,dNTP(10mmol/L)2Ixl,M—MLV (200u/t~])0.1l,0.1mol/LDTF5l,DEPCH2O 0.9l,反应总体积25l,37?1h后,立刻放人冰 中,即为逆转录后的pro—GRP—cDNA 1.4特异性引物扩增pro—GRP—cDNA:据已知人 pro-gestrinreleaseingpeptide,pro-GRP基因序列合 成其上,下游引物,上游引物为5AAAGAA,rrCAT— GAGCACAGGGGAGTC,rrCTTCTG3,下游引物为5 AAATCTAGATCAATCTrrGAAG,rrGCTGCTATCC3 f上海申友生物技术公司合成).在25IxlPCR反应体 系中分另0力?人pro—GRP—cDNA1l,10xTaqbufier 2.5l,DeepVent酶1l,dNTP(10mmol/L)2Ixl, MgCL2(25mmol/L)2Ixl,pro—GRP上,下游引物(10 I~mol/L)各0.5ill,DEPCH2O16l.混匀后94?5 min;94?30S,58oC30S,72oC30S,扩增8个循 环;94oC30S,64oC30S,72oC30S,扩增25个循 环;72?延长反应10min.将PCR产物进行1.0%琼 脂糖凝胶电泳,同时用DNA胶回收试剂盒纯化. 1.5重组测序质粒的构建及克隆测序:按照TA克 隆试剂盒说明.将纯化的PCR产物连接到pGEM—T 载体中,用常规氯化钙法转化JM109感受态,接种至 含氨苄青霉素的LB平板中,IFFG+X—gal筛选阳性 克隆,提取重组质粒DNA,PCR扩增后EcoRI,X— bal双酶切消化质粒DNA,1.0%琼脂糖凝胶电泳鉴 定.上海申友生物技术公司提供狈4序服务 1.6原核表达载体PMS—pro—GRP的构建:SDS碱 裂解法大量制备原核表达质粒载体PMS一3lb.用聚 乙二醇沉淀法纯化制备的DNA.EcoRI,X—bal双酶 切消化PMS一31b及pGEM—T—pro—GRP质粒DNA 回收琼脂糖凝胶中的pro—GRP—DNA和载体PMS一 3lb—DNA.连接产物转化大肠杆菌POP2136.挑取抗 氨苄阳性克隆培养,酶切和电泳同上,参照参考文献 ? 829? [3]步骤操作. 1.7MS一pro—GRP融合蛋白的表达与纯化:原核重 组表达载体PMS一3lb—pro—GRP菌株在含氨苄的LB 培养基中经42?热诱导表达蛋白.收集细菌沉淀后 经溶菌酶加去污剂,超声,裂解包涵体.10%十二烷 基硫酸钠聚丙烯凝胶电泳(SDS—PAGE).经电洗脱, 浓缩透析,获得纯化的MS一pro—GRP融合蛋白.10% SDS—PAGE电泳鉴定条带位置是否正确操作.参照 文献『3,12]操作. 2结果 2.1pro—GRP—PCR结果:以逆转录的pro—GRPcD— NA为模板进行PCR扩增,扩增产物经1.0%琼脂糖 凝胶电泳分析,可见在200—300bp处出现一特异条 带,与pro—GRP的210bp相对分子质量大小相符 (图1). 15o0 1O00 3o0 2o0 M:100bp梯厦DNA 标准 excel标准偏差excel标准偏差函数exl标准差函数国标检验抽样标准表免费下载红头文件格式标准下载 带:1.2,3:不同的pro—GRP扩增产物 图1pro—GRP扩增产物电泳结果 2.2pGEM—T—pro—GRP重组质粒的鉴定结果:pro— GRP的PCR产物经琼脂糖回收后,与pGEM—T载体 连接.重组质粒pGEM—T—pro—GRP经EcoRI/xbaI双 酶切后,在3000及200—300bp附近分别有一条 DNA带,这与载体pGEM—T及pro—GRP片段大小相 吻合(图2). 3o0 2o0 MI:EcoRI+Hind111消化的DNA标准带:M2:100bp梯度DNA 标准带:1:pro-GRP-PCR产物:2:未酶切pGEM—T-pro—GRP质 粒:3,4:EcoRI/XbaI双酶切的不同pGEM—T-pro—GRP质粒 图2pGEM—T—pm—GRP重组质粒鉴定结果 ? 830?中国药物与临床2007年11月第7卷第11期 ChineseRemedi~&Clinics,November2007,Vol7,No.11 2-3.核苷酸序列测定:经对阳性克隆测序发现,已 插入测序载体的目的片断基因序列仅在第154位碱 基由T变为c,其它序列与文献报道完全一致,表明 得到了预期的目的片断. 2.4pMS-pro—GRP的重组质粒鉴定结果:pGEM— T—pro—GRP经EcoRl/XbaI酶切回收后.与经同样酶 切的原核表达质粒PMS一31b连接重组.从图3可看 出:PMS—pro—GRP重组质粒经EcoRl/XbaI双酶切 后.在3700及200—300bp附近分别有一条DNA 带,这与载体PMS一31b及pro—GRP片段大小相符. bpMI12345M2bp 300 20o l00 Ml:100bp梯度DNA标准带M2:EeoRl+HindW~化的DNA标准带;l, 2:EcoRI/XbaI双酶切不同的PMs_RP质粒;3,4:分别为EcoRl/Xbal 双酶切后回收的Pro--GRP片断和PMS载体片断;5:未酶切质粒PMS—pro— GRP 图3重组质粒'PMS-pro-GRP酶切鉴定 2.5MS一pro—GRP融合蛋白的表达和纯化: POP2136细菌经原核表达质粒PMS—pro—GRP转化, 42?热诱导,能够表达MS一pro—GRP融合蛋白,表 达的融合蛋白分子量约18000左右(第4泳道).从 图4可以看出.诱导菌在18000之处比非诱导菌多 一 条蛋白带.诱导蛋白以包涵体的形式存在(第6泳 道),而裂解菌的上清中几乎没有;经纯化的Ms2一 pro—GRP融合蛋白有一条明显的蛋白带(第7泳 道). 69o00 43o00 29000 18O0o M:蛋白分子量标准 1.3:分别为30"C中生长含PMS和PMS--pro-GRP的细菌裂解总蛋白; 2,4:分别为42"C中生长含PMS和PMS—pm-GRP的细菌裂解总蛋白; 5.6:分别为42~C中生长含PMS—Pro—GRP的细菌裂解上清和沉淀蛋 白;7:纯化的MsRP蛋白 图4MS2-Pro—GRP在大肠杆菌POP2136中的表达和纯化 3讨论 本研究从人BGC823胃癌细胞系中提取总 RNA,RT-PCR得到eDNA.用特异性引物,DEEP VENT聚合酶和TaqDNA聚合酶扩增了包括pro— GRP(31—98)在内的DNA全长,共210bp,琼脂糖凝 胶电泳结果显示条带位置基本正确(图1).与 pGEM—T载体连接,转化大肠杆菌JM109,经EeoRI/ XbaI双酶切鉴定条带位置正确(图2).DNA测序结 果显示在第154位碱基由T变为C.其他序列与文 献报道一致.这一位点碱基的改变能否影响蛋白功 能有待进一步研究. 重组质粒pGEM-T—pro—GRP经EeoRl/XbaI酶 切回收后.与经同样酶切回收的原核表达质粒载体 PMS一31b连接重组.PMS—pro—GRP重组质粒经 EeoRl/XbaI双酶切后.在3700及200,300bp附近 分别有一条DNA带,这与载体PMS一31b及pro— GRP片段大小相符(图3).由于PMS一31b载体上有 一 段MS(相对分子质量约100oo)与pro—GRP(相 对分子质量约8ooo)连接构成的融合蛋白相对分子 质量约为18000(图4),可见MS2一pro—GRP经42? 热诱导后在18000附近有一条蛋白表达带,且表达 于包涵体中.上清中几乎没有. 研究表明Ig-to]:GRP及其GRPR不仅存在于人体 正常组织中.同时也存在于多种肿瘤组织中,且配体 与受体亦可同时表达于部分肿瘤组织中.GRP主要 表达于SCLC癌,嗜铬细胞瘤,某些前列腺癌和子宫 内膜癌等.在多数SCLC,乳腺癌细胞系,雄激素非依 赖的前列腺癌细胞],人胰腺癌细胞系HPAF,胃癌 细胞系s?A,结肠癌细胞系HT-29,恶性胶质瘤,肾 癌细胞,成神经细胞瘤中都有GRPR的表达[. GRP异常表达于各种癌中.以自主分泌,异常分 泌,神经内分泌的方式作用于其特异性受体影响多 种信号传导途径,直接刺激或抑制肿瘤的生长,GRP 及其GRPR可能在肿瘤的发生,发展过程中起着重 要的作用.因此阻断GRP与相应受体的结合或受体 后的各种信号传导途径,便成为肿瘤治疗的新策略. 研制针对GRP的抗体,以及受体拮抗剂,将会在体 内外抑制肿瘤细胞的生长,对肿瘤的治疗有重要的 意义[. 由此可见大量制备GRP融合蛋白能广泛应用 于:?作为配体与表达在各种肿瘤中的受体结合检 测肿瘤中是否有GRPR的表达,为肿瘤的体外诊断 提供实验依据.?作为一种抗原能免疫动物(小鼠) 制备鼠抗人pro—GRP单克隆抗体,研制国产化试剂 盒.为今后进一步研究GRP的基因结构,功能,临床 应用提供经济,实用,必备的实验支持.?为研制 中国药物与临床2007年11月第7卷第11期 ChineseRemedies&Clinics,November2007,Vol7,No.11 GRPR拮抗剂,用于肿瘤的靶向治疗奠定了基础. 总之.进一步研究GRP及其受体GRPR的基因 结构和功能将会为各种肿瘤的基因诊断,基因治疗, 药物的研制开发提供实验基础,国产化的pro—GRP 蛋白及其单克隆抗体将会有广阔的应用前景. 参考文献 1ChristianW,QuXP'XiaoDM.Biologicrelevanceofmammalian bombesin-likepeptidesandtheirreceptorsinhumanmalignan— cies.CurrOpinEndocrinolDiabet,2003,10:60—71. 2周明非,张贺秋.凌世淦.小细胞肺癌肿瘤标志物一胃泌素释放 肽前体酶联免疫检测方法的研究进展.军事医学科学院院刊, 2000,24(2):l43一l46. 3Samtx~kJ.FritschEF,ManiatisT.Moloecularcloning:alabora— torymanual,2nded.NewYork:ColdSpringHarborLaboratory Press,1989. 4ShibayamaT,UeokaH,NishiiK,eta1.Complementaryroleof progastr/nreleasingpeptide(proGRP)andneuronspecificenolase (NSE)indiagnosisandprognosisofsmallcelllungcancer (SCLC).JLungCancer,2001,32(1):61—69. ? 831? 5余秉翔,刘庆锋,陈良安.酉泌素释放肽前体作为小细胞肺癌标 志物的临床研究.中国肺癌杂志,2003,6(3):209—210. 6余文聘,王文莉,黄杰雄,等.胃泌素释放肽前体在小细胞肺癌 诊断中的临床研究.河北医学,2006,12(8):703—704. 7杨谨,李容.李昂,等.胃泌素释放肽前体片段3l一98检测对小 细胞肺癌的临床意义.中华肿瘤杂志,2000,22(3):216—218. 8杨德昌,杨拴盈.肺癌诊断及治疗进展.中华结核和呼吸杂志, 2004,27(1):l8一l9. 9LevinL,LicciJA,TownsendCMJ,eta1.Expressionofgastrin— releasingpeptideinendometrialcancer.JAmCollegeSurgeons. 20o3,196(6):898—9O4. 1O王东旺.蛙皮素及其同类物与肿瘤的关系.现代诊断与治疗, 2005,16(4):225-227. 1lYashiM,MuraishiO,KobayashiY,eta1.Elevatedsel'umprogas— trin-releasingpeptidef3l一98)inmetastaticandandrogeninde— pendentprostatecancerpatients.Prostate.2002,5l:84—97. 12朱爱萍,张青云,王雅明,等.人神经元特异性烯醇化酶基因克 隆及单克隆抗体的制备与鉴定.中华检验医学杂志,2005,28 (2):197-199. (收稿日期:20o7—08—01) 硫普罗宁注射液致过敏性休克一例 于忠辉张宁吕慧怡 患者男,82岁.因重症肺炎一I型呼吸衰竭入院治疗,因 实验室检查肝功能丙氨酸转氨酶89.2U/L.天冬氨酸转氨酶 66.7U/L,为保肝降酶使用硫普罗宁片(凯西莱片),因患者不 配合口服药物治疗,改用硫普宁注射液(凯西莱注射液,用法 为0.2g,每日2次,静脉滴注).静脉滴注该药10ml左右后, 患者出现周身皮肤发痒,恶心,继而意识丧失,休克,血压90/ 60mmHg,心率120次/min,呼吸20次/min,立即停药,改为 0.9%氯化钠注射液静脉滴注,应用多巴胺,去甲肾上腺素升 压,甲泼尼龙静脉滴注,苯海拉明肌肉注射,羟乙基淀粉静脉 滴注补充血容量.2h后患者血压,心率,意识均恢复正常,生 命体征稳定. 讨论该患者住院期间原发病已得到有效治疗.因发现 转氨酶异常,使用硫普罗宁,用药期间未使用其他药物,在输 注过程中发生休克.可以判断是由硫普罗宁引起.硫普罗宁为 一 种新型的含巯基类化合物,可使肝细胞线粒体中的ATP酶 作者单位:l16027大连医科大学附属二院药剂科 ? 病例报告? 活性降低,ATP含量增高,电子传递功能正常,从而改善肝细 胞功能,对抗各类肝损伤负效应…,但该药所含的游离巯基对 少数患者可能引起严重的过敏反应[2],使用该药前应仔细询 问患者有无药物过敏史,用药过程中应增加稀释液,减慢滴 速.控制在30滴/min左右,并密切观察患者反应,有不良反应 发生时及时救治.同时警告患者避免再次应用此药或其他含 游离巯基的药物.建议使用该药前按适当方法进行皮试,同时 建议生产企业在药品说明书中标明过敏性休克的不良反应. 起到警示作用. 参考文献 1陈新谦.金有豫,汤光.新编药物学.15版.北京:人民卫生出版 社.2003. 2吴秀英,夏米西努.硫普罗宁注射液致变态反应2例.医药导报, 2005,24(4):329. (收稿日期:20o7—06—01)