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首页 中国药典2005 Word 版2005年版3部附录

中国药典2005 Word 版2005年版3部附录.doc

中国药典2005 Word 版2005年版3部附录

山东蓝天白云001
2018-09-07 0人阅读 举报 0 0 0 暂无简介

简介:本文档为《中国药典2005 Word 版2005年版3部附录doc》,可适用于医药卫生领域

中国药典三部附录(年版)种页码数:版药典附录第页附录VIGA群脑膜炎球菌多糖第一法测磷法(仲裁法)本法用于测定细菌荚膜多糖在色谱柱中的分配系数(KD)和多糖在规定KD值以前的回收率。试剂()流动相取氯化钠.g、叠氮钠.g加水使溶解成ml混匀用O.mol/L氢氧化钠溶液调节pH至.O。()蓝色葡聚糖溶液取蓝色葡聚糖mg加流动相使溶解成ml。()维生素B溶液称取mg维生素B加流动相使溶解成ml。色谱柱的制备取琼脂糖B凝胶或琼脂糖CLB凝胶约ml加流动相ml充分搅拌放置约小时使其沉淀倾去上层含悬浮颗粒的悬液。如此反复~次后加流动相ml混匀抽去凝胶中的空气装于.cm×cm色谱柱中约cm高.用流动相洗脱流速为每小时~ml以~倍柱床体积的流动相洗脱(约m)使柱床平衡。色谱柱的标定取蓝色葡聚糖溶液lml加于已平衡的色谱柱中以流动相洗脱流速每小时~ml用组分收集器收集洗脱液每管收集~ml照紫外可见分光光度法(附录ⅡA)在波长nm处测定各管洗脱液的吸光度以吸光度为纵坐标洗脱液体积(m)为横坐标分别作图nm波长处的峰顶洗脱液体积为空流体积V。取维生素B溶液lml自“加于已平衡的色谱柱中起同法操作nm波长处的峰顶洗脱液体积为柱床体积Vi。测定法取供试品约lml(含多糖抗原~mg如为冻干制品可用流动相溶解)加于已标定的色谱柱中用流动相洗脱用组分收集器收集洗脱液每管收集ml照磷含量测定法(附录ⅦA)测定每管洗脱液的磷含量。以供试品每管洗脱液的磷含量为纵坐标洗脱液体积(m)为横坐标作图主峰峰顶洗脱液体积为Ve。按下式计算KD=vevViV。式中KD为供试品分配系数Ve为供试品洗脱液体积mlV为空流体积mlVi为柱床体积ml。计算供试品在KD值<.的多糖回收率Rx(%)=AxAt×%式中Rx为KD值<O.供试品的多糖回收率Ax为供试品在KD值<O.各管洗脱液的磷含量之和At为供试品所有管洗脱液的磷含量之和。第二法仪器法试剂与色谱柱的制备同第一法。色谱柱的标定取蓝色葡聚糖溶液lml与维生素B溶液.ml混匀后加于已平衡的色谱柱中以流动相洗脱流速每小时~ml检测波长nm用组分收集器收集洗脱液记录色谱图色谱图中第一峰为蓝色葡聚糖峰峰顶的洗脱液体积为空流体积V第二峰为维生素B的峰峰顶的洗脱液体积为柱床体积Vi。测定法取供试品约lml(含多糖抗原~mg如为冻干制品可用流动相溶解)加于已标定的色谱柱中用流动不同种类的气体混  合物产生常用乙炔空气火焰。改变燃气和助燃气的种类及比例可以控制火焰  的温度以获得较好的火焰稳定性和测定灵敏度。  ()石墨炉原子化器由电热石墨炉及电源等部件组成。其功能是将供试品溶  液干燥、灰化再通过高温原子化阶段使待测元素形成基态原子。一般以石  墨作为发热体炉中通入保护气以防氧化并能输送试样蒸气。  ()氢化物发生原子化器由氢化物发生器和原子吸收池组成可用于砷、硒、  锡、锑等元素的测定。其功能是将待测元素在酸性介质中还原成低沸点、易受  热分解的氢化物再由载气导入由石英管、加热器等组成的原子吸收池在吸  收池中氢化物被加热分解并形成基态原子。  ()冷蒸气发生原子化器由汞蒸气发生器和原子吸收池组成专门用于汞的  测定。其功能是将供试品溶液中的汞离子还原成汞蒸气再由载气导入石英原  子吸收池进行测定。  .单色器其功能是从光源发射的电磁辐射中分离出所需要的电磁辐射仪  器光路应能保证有良好的光谱分附录lIC荧光分析法辨率和在相当窄的光谱带  (O.nm)下正常工作的能力波长范围一般为.O~.nm。  ·检测系统由检测器、信号处理器和指示记录器组成·应具有较高的灵敏度  和较好的稳定性并能及时跟踪吸收信号的急速变化。  .背景校正系统其作用是校正供试品原子化时蒸气相对吸收测定的干扰  常用的背景校正系统有以下四种:连续光源(在紫外区通常用氘灯)、塞曼效应、  自吸效应、非吸收线等。  在原子吸收分光光度分析中必须注意背景以及其他原因引起的对测定的  干扰。仪器某些工作条件(如波长、狭缝、原子化条件等)的变化可影响灵敏  度、稳定程度和干扰情况。在火焰法原子吸收测定中可采用选择适宜的测定  谱线和狭缝、改变火焰温度、加入络合剂或释放剂、采用标准加入法等方法消  除干扰在石墨炉原子吸收测定中可采用选择适宜的背景校正系统、加入适  宜的基体改进剂等方法消除干扰。具体方法应按各品种项下的规定选用。  测定法  第一法(标准曲线法)在仪器推荐的浓度范围内制备含待测元素的对照品溶  液至少份浓度依次递增并分别加入各品种项下制备供试品溶液的相应试  剂同时以相应试剂制备空白对照溶液。将仪器按规定启动后依次测定空白  对照溶液和各浓度对照品溶液的吸光度记录读数。以每一浓度次吸光度读数  的平均值为纵坐标、相应浓度为横坐标绘制标准曲线。按各品种项下的规定  制备供试品溶液使待测元素的估计浓度在标准曲线浓度范围内测定吸光  度取次读数的平均值从标准曲线上查得相应的浓度计算元素的含量。  第二法(标准加入法)取同体积按各品种项下规定制备的供试品溶液份分别  置个同体积的量瓶中除()号量瓶外其他量瓶分别精密加入不同浓度的待  测元素对照品溶液分别用去离子水稀释至刻度制成从零开始递增的一系列  溶液。按上述标准曲线法自“将仪器按规定启动后”操作测定吸光度记录读  数将吸光度读数与相应的待测元素加入量作图延长此直线至与含量轴的  延长线相交此交点与原点问的距离即相当于供试品溶液取用量中待测元素的  含量(如图图略)。再以此计算供试品中待测元素的含量。此法仅适用于第一法标准  曲线呈线性并.通过原点的情况。  当用于杂质限度检查时取供试品按各品种项下的规定制备供试品溶  液另取等量的供试品加入限度量的待测元素溶液制成对照品溶液。照上  述标准曲线法操作设对照品溶液的读数为a供试品溶液的读数为bb值应小  于ab。        书页号:版药典三部附录页  附录ⅫB支原体检查法  主细胞库、工作细胞库、病毒种子批、对照细胞以及临床治疗用细胞进行  支原体检查时应同时进行培养法和指示细胞法(DNA染色法)。病毒类疫苗的病  毒收获液、原液采用培养法检查支原体必要时亦可采用指示细胞法筛选培  养基。也可采用经国家药品检定机构认可的其他方法。  第一法培养法  推荐培养基及其处方  ()支原体肉汤培养基  猪胃消化液ml氯化钠g  牛肉浸液(:)ml葡萄糖g  酵母浸粉g酚红g  pH值±。于℃灭菌分钟。  ()精氨酸支原体肉汤培养基  猪胃消化液ml葡萄糖g  牛肉浸液(:)mlL精氨酸g  酵母浸粉g酚红g  氯化钠g  pH值±。于℃灭菌分钟。  ()支原体半流体培养基按()项处方配制培养基中不加酚红加入琼脂  ~g。  ()支原体琼脂培养基按()项处方配制培养基中不加酚红加入琼脂  ~g。  培养基灵敏度检查(变色单位试验法)()菌种肺炎支原体(ATCC株)口腔  支原体(ATCC株)。由国家药品检定机构分发。  ()操作将菌种接种于适宜的支原体培养基中经℃±℃培养至培养基变  色盲传两代后将培养物接种到待检培养基中做倍系列稀释肺炎支原体  稀释至〈〉~〈〉接种在支原体肉汤培养基内口腔支原体稀释至  〈〉~〈〉接种在精氨酸支原体肉汤培养基内。每个稀释度接种支试  管置℃±℃培养~天观察培养基变色结果。  ()结果判定以接种后培养基管数的以上呈现变色的最高稀释度为该培养  基的灵敏度。  液体培养基的灵敏度:肺炎支原体(ATCC株)应达到〈〉口腔支原  体(ATCC株)应达到〈〉。  检查法()供试品如在分装后小时以内进行支原体检查者可贮存于~℃  超过小时应置-℃以下贮存。  ()检查支原体采用支原体半流体培养基和支原体肉汤培养基(或支原体琼脂  培养基)。半流体培养基(或琼脂培养基)在使用前应煮沸~分钟冷却至℃  左右然后加入灭能小牛血清(培养基:血清为:)并可酌情加入适量青霉素  充分摇匀。液体培养基除无需煮沸外使用前亦应同样补加上述成分。  取每支装量为ml的支原体半流体培养基(已冷至℃±℃)和支原体肉汤培养  基各支每支培养基接种供试品~ml置℃±℃培养天。于接种后的第  天从支中取支进行次代培养每一支培养基转种支原体半流体培养基及支原  体肉汤培养基各支置℃±℃培养天每隔天观察一次。  ()结果判定培养结束时如接种供试品的培养基均无支原体生长则供试  品判为合格如疑有支原体生长可取加倍量供试品复试如无支原体生长  供试品判为合格如仍有支原体生长则供试品判为不合格。  【附注】质量检定部门应会同培养基制造部门定期抽检支原体培养基灵敏  度。  第二法指示细胞培养法(DNA染色法)  将供试品接种于指示细胞(无污染的Vero细胞或经国家药品检定机构认可的其  他细胞)中培养后用特异荧光染料染色。如供试品污染支原体在荧光显微镜  下可见附在细胞表面的支原体DNA着色。  试剂()二苯甲酰胺荧光染料(Hoechst)浓缩液称取二苯甲酰胺荧光染料  mg加入ml不含酚红和碳酸氢钠的Hank※s平衡盐溶液中在室温用磁力搅拌  ~分钟使完全溶解-℃避光保存。  ()二苯甲酰胺荧光染料工作液无酚红和碳酸氢钠的Hank※s溶液ml中加入二  苯甲酰胺荧光染料浓缩液ml混匀。  ()固定液乙酸:甲醇(:)混合溶液。  ()封片液量取molL枸橼酸溶液ml、molL磷酸氢二钠溶液ml、甘油  ml混匀调pH至。  培养基及指示细胞()DMEM完全培养基  ()DMEM无抗生素培养基  ()指示细胞(已证明无支原体污染的Vero细胞或其他传代细胞)取培养的Vero  细胞经消化后制成每ml含〈〉的细胞悬液以每孔ml接种孔细胞培养板  或其他容器每孔再加无抗生素培养基ml于二氧化碳孵箱℃±℃培养过  夜备用。  供试品处理()细胞培养物将供试品经无抗生素培养液至少传一代然后  取细胞已长满的且天未换液的细胞培养上清液待检。  ()毒种悬液如该毒种对指示细胞可形成病变并影响结果判定时应用对支  原体无抑制作用的特异抗血清中和病毒后或用不产生细胞病变的另一种指示细  胞进行检查。  ()其他供试品检查时所选用的指示细胞应为该供试品对其生长无影响的细  胞。  测定法于制备好的指示细胞培养板中加入供试品(细胞培养上清液)ml(毒种  或其他供试品至少ml)置二氧化碳孵箱℃±℃培养~天。指示细胞培养  物至少传代次末次传代培养用含盖玻片的孔培养板培养~天后吸出培养  孔中的培养液加入固定液ml放置分钟吸出固定液再加ml固定液固定  分钟吸出固定液使盖玻片在空气中干燥加二苯甲酰胺荧光染料(或其他  DNA染料)工作液ml加盖室温放置分钟吸出染液每孔用水ml洗次吸  出水盖玻片于空气中干燥取洁净载玻片加封片液一滴分别将盖玻片面向  下盖在封片液上制成封片。用荧光显微镜观察。  用无抗生素培养基ml替代供试品同法操作作为阴性对照。  用已知阳性的供试品标准菌株ml替代供试品同法操作作为阳性对照。  结果判定()阴性对照仅见指示细胞的细胞核呈现黄绿色荧光。  ()阳性对照荧光显微镜下除细胞外可见大小不等、不规则的荧光着色颗  粒。  当阴性及阳性对照结果均成立时试验有效。  如供试品结果为阴性则供试品判为合格如供试品结果为阳性或可疑时  应进行重试如仍阳性时供试品判为不合格。        页码数:版药典附录第页  附录ⅢA纸色谱法  纸色谱法系以纸为载体以纸上所含水分或其他物质为固定柑用展开剂  进行展开的分配色谱。供试品经展开后可用比移值(Rf)表示其各组成成分的  位置(比移值一原点中心至斑点中心的距离/原点中心至展开剂前沿的距离)  但由于影响比移值的因素较多凶而一般采用在相同实验条件下与对照物质对  比以确定其异同。作为药品的鉴别时供试品在色谱图中所显主斑点的位置与  颜色(或荧光)应与对照品在色谱图中所显主斑点相同。作为药品的纯度检查  时可取一定量的供试品经展开后按各品种项下的规定检视其所显杂  质斑点的个数或呈色深度(或荧光强度)。作为药品的含量测定时将主色谱斑  点剪下洗脱后.冉用适宜的方法测定。  .仪器与材料  ()展开容器通常为圆形或长方形玻璃缸缸上具有磨口玻璃盖应能密闭。  用于下行法时盖上有孔可插入分液漏斗用以加入展开剂。在近顶端有一  用支架架起的玻璃槽作为展开剂的容器槽内有一玻棒用以压住色谱滤纸  槽的两侧各支一玻棒用以支持色谱滤纸使其自然下垂避免展开剂沿色谱滤  纸与溶剂槽之间发生虹吸现象。用于上行法时在盖上的孔中加塞塞中插入  玻璃悬钩以便将点样后的色谱滤纸挂在钩上并除去溶剂槽和支架。  ()点样器常用具支架的微量注射器或定量毛细管应能使点样位置正确、集  中。  ()色谱滤纸应质地均匀平整具有一定机械强度不含影响展开效果的杂  质也不应与所用显色剂起作用以致影响分离和鉴别效果必要时可进行处  理后再用。用于下行法时取色谱滤纸按纤维长丝方向切成适当大小的纸条  离纸条上端适当的距离(使色谱滤纸上端能足够浸入溶剂槽内的展开剂中并使  点样基线能在溶剂槽侧的玻璃支持棒下数厘米处)用铅笔划一点样基线必要  时可在色谱滤纸下端切成锯齿形便于展开剂滴下。用于上行法时色谱滤纸  长约cm宽度则按需要而定必要时可将色谱滤纸卷成筒形点样基线距底  边约.cm。  .操作方法  ()下行法将供试品溶解于适宜的溶剂中制成一定浓度的溶液。用定量毛细管  或微量注射器吸取溶液点于点样基线上溶液宜分次点加每次点加后俟  其自然干燥、低温烘干或经温热气流吹干样点直径为~mm点间距离约为  .~.cm样点通常应为圆形。  将点样后的色谱滤纸的点样端放在溶剂槽内并用玻棒压住使色谱滤纸通过  槽侧玻璃支持棒自然下垂点样基线在支持棒下数厘米处。展开前展开缸内  用各品种项下规定的溶剂的蒸气使之饱和一般可在展开缸底部放一装有规定  溶剂的平皿或将浸有规定溶剂的滤纸条附着在展开缸内壁上放置一定时间  俟溶剂挥发使缸内充满饱和蒸气。然后添加展开剂使浸没溶剂槽内的色谱滤  纸展开剂即经毛细管作用沿色谱滤纸移动进行展开展开至规定的距离后  取出色谱滤纸标明展开剂前沿位置俟展开剂挥散后按规定方法检出色谱斑  点。  ()上行法点样方法同下行法。展开缸内加入展开剂适量放置俟展开剂蒸气  饱和后再下降悬钩使色谱滤纸浸入展开剂约O.cm展开剂即经毛细管作  用沿色谱滤纸上升除另有规定外一般展开至约cm后取出晾干按规定  方法检视。  展开可以单向展开即向一个方向进行也可进行双向展开即先向一个  方向展开取出俟展开剂完全挥发后将滤纸转动。再用原展开剂或另  一种展开剂进行展开亦可多次展开、连续展开或径向展开等。        书页号:附录  附录I制剂通则  本通则适用于治疗用生物制品包括血液制品、免疫血清、细胞因子、单克隆  抗体、免疫调节剂、微生态制剂等。预防用生物制品按具体品种的要求进行。        页码数:版药典附录第页  附录ⅨG质粒丢失率检查法  大肠杆菌表达系统的工程菌含有表达目的蛋白的表达质粒质粒上一般带  有抗生素抗性基因便于筛选在菌体传代过程中在一定浓度的抗生素环境  下(如种子培养液)质粒丢失后菌体便不能存活而在不含抗生素的发酵培养  液中随着传代代次的提高可能有部分大肠杆菌丢失了质粒失去了抗生素  抗性基因也同时失去表达目的蛋白的能力。通过比较在含有或不含抗生素培  养基的菌体存活数可以检测质粒的丢失率考察质粒稳定性。  实际操作中一般用模拟发酵或发酵过程实时收集的发酵液包括最后阶段(  传代最多代次)的收集液经过适当稀释后涂布于不含抗生素的培养基上在  ℃培养过夜挑取不少于个单菌落分别接种到含抗生素和不含抗生素的  培养皿中在℃培养过夜。比较二者差异一般应重复次以上计算质粒丢  失率。工艺验证中应规定质粒丢失率并应在允许的范围内。        页码数:版药典附录第页  附录XI重组链激酶生物学活性测定法  本法系依据链激酶和纤溶酶原形成的复合物能激活游离的纤溶酶原为有生  物学活性的纤溶酶纤溶酶能降解人纤维蛋白为可溶性的纤维蛋白片段在纤  维蛋白平板上出现透明的溶解圈以此定量测定重组链激酶的生物学活性。  试剂()人凝血酶溶液用生理氯化钠溶液配制成每lml含IU于℃保存。  ()人纤溶酶原溶液用生理氯化钠溶液配成每lml含.mg于℃保存。  ()人纤维蛋白原溶液试验前配制配制前将人纤维蛋白原和备用的生理氯  化钠溶液均在℃水浴预热分钟然后用适量生理氯化钠溶液溶解℃水浴  静置保温分钟使其完全溶解配制成每lml含mg溶液待用。  标准品溶液的制备按使用说明书将重组链激酶生物学活性测定国家标准  品复溶后用生理氯化钠溶液稀释成每lml含IU、IU、.IU、.IU、  .IU等个稀释度待用。  供试品溶液的制备供试品按标示量加生理氯化钠溶液复溶后用生理氯化  钠溶液稀释至约每lml含IU或μg。  测定法取琼脂糖mg加生理氯化钠溶液ml煮沸使之溶胀置~℃水  浴中平衡加每lml含Iu人凝血酶溶液μl人纤溶酶原溶液(每lml含.mg)  μ边加边摇匀加每lml含mg人纤维蛋白原溶液.ml不停地摇匀浑浊  后立即倒入直径cm的平皿中水平放置充分凝固后℃放置至少分钟待  用(应在两天之内使用)。在含纤维蛋白平皿内打孔孔径为mm在孔内分别加  入供试品溶液和标准品溶液每孔μl每个稀释度做两个孔℃湿盒水平放  置小时。纵向和横向量取溶圈直径各次取平均值。以标准品溶液各个稀  释度的生物学活性的对数对相应的溶圈直径的对数进行直线回归并求得回归  方程根据供试品的溶圈直径的对数求得供试品的生物学活性。        页码数:版药典附录第页  附录XD重组人白介素生物学活性测定法(CTLL细胞/MTT比色法)  本法系根据在不同白介素(IL)的浓度下其细胞依赖株CTLL细胞存活率  不同以此检测IL的生物学活性。  试剂()RPMI培养液取RPMI培养基粉末袋(规格为L)加水溶解并稀  释至ml加青霉素IU和链霉素IU再加碳酸氢钠.g溶解后混  匀除菌过滤℃保存。  ()基础培养液取新生牛血清(FBS)ml加RPMI培养液ml。℃保存。  ()完全培养液取基础培养液ml加重组人白介素至终浓度~IU。℃  保存。  ()PBS取氯化钠.Og、氯化钾.g、磷酸氢二钠.g、磷酸二氢钾O.g  加水溶解并稀释至ml经℃分钟灭菌。  ()噻唑蓝(MTT)溶液取MTT.g加PBS溶解并稀释成ml经O.μm滤膜过  滤除菌。℃避光保存。  ()裂解液%十二烷基硫酸钠溶液使用期限不得超过个月。  CTLL细胞应为偏酸性、略微浑浊液体传代后~小时用于重组人白介  素生物学活性测定。  标准品溶液的制备取重组人白介素生物学活性测定的国家标准品按使用  说明书复溶后用基础培养液稀释至每lml含U。在孔细胞培养板中做倍  系列稀释共个稀释度每个稀释度做个孔。每孔分别留μl标准品溶液弃  去孔中多余溶液。以上操作在无菌条件下进行。  供试品溶液的制备将供试品按标示量复溶后用基础培养液稀释成每lml约含  IU。在孔细胞培养板中做倍系列稀释共个稀释度每个稀释度做  孔。每孔分别留μl供试品溶液弃去孔中多余溶液。以上操作在无菌条件下  进行。  测定法CTLL细胞用完全培养液于℃、%二氧化碳条件下培养至足够量  离心收集CTLL细胞用RPMI培养液洗涤次然后重悬于基础培养液中配  制成每lml含.O×个细胞的细胞悬液置℃%二氧化碳条件下备用。在  加有标准品溶液和供试品溶液的孔细胞培养板中每孔加入细胞悬液μ  于~C、%二氧化碳培养~小时。然后每孔加入MTT溶液μl于℃  %二氧化碳培养~小时后每孔加入裂解液μl于℃、%二氧化碳条  件下保温~小时。以上操作均在无菌条件下进行。混匀细胞板中的液体  放人酶标仪以nm为参比波长于波长nm处测定吸光度记录测定结果。  试验数据采用计算机程序或四参数回归计算法进行处理。并按下式计算试  验结果  供试品生物学活性(IU/m)=Pr*Ds*EsDr*Er  式中Pr为标准品生物学活性Iu/ml  Ds为供试品预稀释倍数  Dr为标准品预稀释倍数  E为供试品相当于标准品半效量的稀释倍数  Er为标准品半效稀释倍数。        页码数:版药典附录第页  附录XH重组人表皮生长因子生物学活性测定法  (细胞增殖法/MTT比色法)  本法系依据重组人表皮生长因子对小鼠胚胎成纤维细胞(Balb/cT细胞)的  生长具有刺激作用Balb/cT细胞的生长状况因重组人表皮生长因子生物学  活性的不同而异以此检测重组人表皮生长因子的生物学活性。  试剂()RPMI培养液RPMI培养基粉末袋(规格为L)加水溶解并稀释  至ml加青霉素IU和链霉素Iu再加碳酸氢钠.g溶解后混匀  除菌过滤℃保存。  ()维持培养液量取新生牛血清ml加RPMI培养液至ml。  ()完全培养液量取新生牛血清ml加RPMI培养液至ml。  ()PBS取氯化钠g、氯化钾O.g、磷酸氢二钠.g、磷酸二氢钾O.g  加水溶解并稀释至ml的溶液经℃分钟灭菌。  ()噻唑蓝(MTT)溶液取MTT粉末.g加PBSml使溶解经O./μm滤膜  过滤除菌。℃避光保存。  标准品溶液的制备取重组人表皮生长因子标准品按说明书复溶后用维持培  养液稀释至每lml含IU。在孔细胞培养板中做倍系列稀释共个稀释度  每个浓度做个孔。以上操作在无菌条件下进行。  供试品溶液的制备将供试品按标示量复溶后用维持培养液稀释成每lml约  含IU。在孔细胞培养板中做倍系列稀释共个稀释度每个浓度做个  孔。以上操作在无菌条件下进行。  测定法Balb/cT细胞株用完全培养液于℃、%二氧化碳培养控制细胞  浓度为每lml含.×~.*个细胞传代后~小时用于生物学活性测  定。弃去培养瓶中的培养液消化和收集细胞用完全培养液配成每lml含  .*~.×个细胞的细胞悬液接种于孔细胞培养板中每孔μ。  在℃、%二氧化碳条件下培养。小时后换成维持培养液。置℃、%二氧  化碳培养小时。制备的细胞培养板弃去维持液加入标准品溶液和供试品溶  液每孔μ。置℃、%二氧化碳培养~小时。每孔加入MTT溶液μl  于℃、%二氧化碳培养小时。以上操作在无菌条件下进行。弃去培养板中  的液体后向每孔中加入二甲基亚砜(DMSO)μ混匀后在酶标仪上以nm  为参比波长于波长nm处测定吸光度记录测定结果。  试验数据采用计算机程序或四参数回归计算法进行处理。并按下式计算结果  供试品生物学活性(IU/m)=Pr*Ds*EsDr*Er  式中Pr为标准品生物学活性IU/ml  Ds为供试品预稀释倍数  Dr为标准品预稀释倍数  Es为供试品相当于标准品半效量的稀释倍数  Er为标准品半效稀释倍数。        页码数:版药典附录第页  附录XB重组人促红素体内生物学活性测定法(网织红细胞法)  本法系依据人促红素(EPO)可刺激网织红细胞生成的作用给小鼠皮下注射  EPO后其网织红细胞数量EPO注射剂量的增加而升高。利用网织红细胞数对红  胞数的比值变化通过剂量一反应平行线法检测EPO体生物学活性。  试剂()乙二胺四乙酸二钾抗凝剂称取乙二胺乙酸二钾mg加生理氯化钠  溶液ml溶解混匀使用时新鲜配制。  ()稀释液取O.g牛血清白蛋白加生理氯化溶液溶解并稀释至ml即得。  标准品溶液的制备按标准品说明书将EPO标品复溶用稀释液将EPO标准品  稀释成高、中、低剂量EPO标准溶液。  供试品溶液的制备用稀释液将供试品稀释成中、低个剂量与EPO标准溶液  单位相近的供试品溶液。  测定法按低、中、高(如IU/鼠、IU/U/鼠)个剂量组分别给近交系  ~周龄小鼠性BALB/C小鼠)或BDF小鼠皮下注射EPO标准品及供试品溶液  每组至少只每鼠注射量为不大于O.ml。在注射后的第天从小鼠眼眶采血  ~滴置于预先加入μlEDTAK抗凝剂的采血管中。取抗凝用全自动网织红  细胞分析仪计数每只小鼠血液中的网织红细胞数对红细胞总数的比值(Ret%)。  按注射剂量(IU)对Ret%的量反应平行线测定法(二部附录XIV)计算试品体内生物学  活性。        页码数:版药典附录第页  附录XE重组人粒细胞刺激因子生物学活性测定法(NFS细胞/MTT比色法)  本法系依据小鼠骨髓白血病细胞(NFS细胞)的生长状况因重组人粒细胞刺  激因子(GCSF)生物学活性的不同而不同以此检测GCSF的生物学活性。  试剂()RPMI培养液取RPMI培养基粉末袋(规格为L)加水溶解并稀  释至ml加青霉素IU和链霉素IU再加碳酸氢钠.g溶解后混  匀除菌过滤℃保存。  ()基础培养液取新生牛血清ml加入RPMI培养液ml中。℃保存。  ()完全培养液基础培养液中加入重组人粒细胞刺激因子至最终浓度为每lml  含ng或每lml含IU  ()PBS取氯化钠g、氯化钾.g、磷酸氢二钠g、磷酸二氢钾O.g加  水溶解并稀释成ml经℃分钟灭菌。  ()噻唑蓝(MTT)溶液取MTT粉末.g加入PBSml中配制成每lml含.mg  的溶液经·μm滤膜过滤除菌。℃避光保存。  ()裂解液取盐酸ml、TritonX溶液ml加异丙醇配制成ml的溶液。  室温避光保存。  标准品溶液的制备取重组人粒细胞刺激因子生物学活性测定标准品按说明  书复溶后用基础培养液稀释至每lml含~IU。在孔细胞培养板中进行  倍系列稀释共个稀释度每个稀释度做个孔每孔分别留μl标准品溶  液弃去孔中多余溶液。以上操作在无菌条件下进行。  供试品溶液的制备将供试品按标示量复溶后用基础培养液稀释成约每lml  含~IU。在孔细胞培养板中做倍系列稀释共个稀释度每个稀释  度做个孔每孔分别留μ供试品溶液弃去孔中多余溶液。以上操作在无  菌条件下进行。  测定法NFS细胞株用完全培养液于℃、%二氧化碳培养控制细胞浓度  为每lml含.*~·*个细胞传代后~小时用于生物学活性测定。将  试验所用溶液预温至℃。取足量NFS细胞培养物离心收集NFS细胞用  RPMI培养液洗涤次然后重悬于基础培养液配成每lml含.O×个细胞的  细胞悬液置℃备用。在加有标准品溶液和供试品溶液的孔细胞培养板中  每孔加入细胞悬液ml于℃、%二氧化碳培养~小时。每孔加入MTT  溶液μl于℃、%二氧化碳培养小时。以上操作在无菌条件下进行。每  孔加入裂解液μl混匀后放入酶标仪以nm为参比波长于波长nm  处测定吸光度记录测定结果。  试验数据采用计算机程序或四参数回归计算法进行处理。并按下式计算结果  供试品生物学活性(IUm)=Pr*Ds*EsDr*Er  式中Pr为标准品生物学活性IU/ml  Ds为供试品预稀释倍数  Dr为标准品预稀释倍数  Es为供试品相当于标准品半效量的稀释倍数  Er为标准品半效稀释倍数。        页码数:版药典附录第页  附录XF重组人粒细胞巨噬细胞刺激因子生物学活性测定法  (TF细胞/MTT比色法)  本法系依据人红细胞白血病细胞(简称TF细胞)的生长状况因重组人粒细胞  巨噬细胞刺激因子(GMCSF)生物学活性的不同而不同以此检测GMCSF的生物  学活性。  试剂()RPMI培养液取RPMI培养基粉末袋(规格为L)加水溶解并稀  释至ml加青霉素IU和链霉素IU再加碳酸氢钠.g溶解后混  匀除菌过滤℃保存。  ()基础培养液取新生牛血清ml加入RPMI培养液ml中。℃保存。  ()完全培养液基础培养液加重组人粒细胞巨噬细胞刺激因子至终浓度为每lml  含.ng或每lml含IU。  ()PBS取氯化钠g、氯化钾.g磷酸氢二钠.g、磷酸二氢钾O.g加  水溶解并稀释至m经℃分钟灭菌。  ()噻唑蓝(MTT)溶液取MTT粉末.g溶于PBSml中配制成每lml含mg的  溶液经O.μm滤膜过滤除菌。℃避光保存。  ()裂解液取盐酸ml、TritonX溶液ml加异丙醇配制成ml的溶液。  标准品溶液的制备取重组人粒细胞巨噬细胞刺激因子标准品按说明书复溶  后用基础培养液稀释至每lml含~IU。在孔细胞培养板中进行倍系列  稀释共个稀释度每个稀释度做个孔。每孔分别留μl标准品溶液弃去  孔中多余溶液。以上操作在无菌条件下进行。  供试品溶液的制备将供试品按标示量复溶后用基础培养液稀释成约每lml含  ~IU。在孔细胞培养板中做倍系列稀释共个稀释度每个稀释度做  个孔。每孔分别留μl供试品溶液弃去孔中多余溶液。以上操作在无菌条件  下进行。  测定法TF细胞株用完全培养液于℃、%二氧化碳培养控制细胞浓度为  每lml含.O×~.×个细胞传代后~小时用于生物学活性测定。将  试验所用溶液预温至℃。取足量TF细胞培养物离心并收集TF细胞用基  础培养液洗涤次然后重悬于基础培养液中配成每lml含.×个细胞的细胞  悬液置℃备用。向加有标准品溶液和供试品溶液的孔细胞培养板中加入  细胞悬液每孔μl于℃、%二氧化碳培养~小时后每孔加入MTT  溶液μl于℃、%二氧化碳培养小时以上操作在无菌条件下进行。再  向上述各孔加裂解液μl混匀后放入酶标仪以nm为参比波长于波  长nm处测定吸光度记录测定结果。  试验数据采用计算机程序或四参数回归计算法进行处理。并按下式计算结  果  供试品生物学活性(IU/m)=Pr*Ds*EsDr*Er  式中Pr为标准品生物学活性IU/ml  Ds为供试品预稀释倍数  Dr为标准品预稀释倍数  Es为供试品相当于标准品半效量的稀释倍数  Er为标准品半效稀释倍数。        页码数:版药典附录第页  附录XA重组乙型肝炎疫苗(酵母)体外相对效力检查法  本法系以酶联免疫法测定供试品中的乙型肝炎表面抗原(HgsAg)含量并以参  考品为标准采用双平行线分析法计算供试品的相对效力。  试剂()PBS(pH.)取氯化钠.g、磷酸二氢钠(NaHP·H)O.g和磷酸  氢二钠(NaHP.HO).g加适量水溶解调pH至.加水稀释至ml。  ()供试品处理液取%二乙醇胺.ml和%TritonX.ml加PBS  .ml混匀备用。  ()供试品稀释液取牛血清白蛋白.Og加PBS溶解并稀释至ml备用。  参考品溶液及供试品溶液的制备精密量取参考品及供试品O.ml各加入  .ml供试品处理液加盖混匀在~℃静置~分钟。将处理后的参考  品和供试品分别以供试品稀释液进行适当稀释稀释后取:、:、  :、:、:及其他适宜稀释度进行测定每个稀释度做双份测  定。阴性对照为供试品稀释液(双份)阴性和阳性对照均不需稀释。  测定法按试剂盒使用说明书进行。相同试验在天内应重复两次。试剂盒阴  性和阳性对照的吸光度均值应在试剂盒要求范围内试验有效。次测定的数据  均用量反应平行线测定法(二部附录ⅪV)计算相对效力。以次相对效力的几何均  值为其体外相对效力。以参考品为标准供试品相对效力几何均值不小于.  判为合格。        书页号:版药典三部附录页  附录IA注射剂  注射剂系指以生物制品原液为原料药物加入适宜稳定剂或其他辅料等制成  的可供注入体内的无菌溶液、乳液、混悬液及临用前用无菌溶剂复溶为溶液、  混悬液的无菌冻干制剂。  注射剂可分注射液、注射用无菌粉末。  注射液系指注入体内的无菌溶液型注射液、乳液型注射液或混悬型注射液。  可用于皮下注射、皮内注射、肌内注射、静脉注射和静脉滴注。其中供静脉  滴注用的大体积(除另有规定外一般不小于m)注射液也称静脉输液。  注射用无菌粉末(以冷冻干燥法制备的称为注射用冻干制剂)系指供临用前以  适宜的无菌溶液配制成澄清溶液或均匀混悬液的无菌粉末或无菌块状物。可用  适宜的注射用溶剂配制后注射也可用静脉输液配制后静脉滴注。  注射剂在生产和贮藏期间应符合下列有关规定。  一、所用生物制品原液、半成品和成品的生产及质量控制应符合相关品种要  求。  二、所用溶剂必须安全无害并不得影响疗效和质量。一般分为水溶性溶剂  和非水溶性溶剂。  ()水溶性溶剂最常用的为注射用水也可用O.%氯化钠溶液或其他适宜的  水溶液。  ()溶解注射用冻干制剂的无菌溶剂通常也称注射用稀释剂主要为灭菌注  射用水、氯化钠注射液应符合本版药典(二部)的规定。其他注射用稀释剂  除另有规定外应进行无菌、热原或细菌内毒素及异常毒性检查并应符合规  定。  三、配制注射剂时可根据制品的性质加入适宜的附加剂。常用的有pH值调  节剂、稳定剂、增溶剂、抗氧剂、防腐剂等。所用附加剂应不影响制品的疗  效对检验不产生干扰。  注射剂中防腐剂的浓度应加以控制常用防腐剂如苯酚的浓度应不高于  O.%硫柳汞的浓度应不高于O·%。除另有规定外供静脉用的注射液不  得添加任何防腐剂并慎用增溶剂。抗氧剂可增加生物学活性物质在冻干后贮  存期间的稳定性如维生素C、维生素E、硫代硫酸钠等。赋形剂能使生物学活  性物质在冻干时和冻于后成形不致飞扬损失如蔗糖、山梨醇、乳糖等。  四、注射剂常用的容器有玻璃安瓿、玻璃瓶、塑料瓶及预装式注射器等应  符合国家标准规定瓶塞的质量亦应符合国家有关标准规定。  五、注射液的实际分装量应符合“生物制品分装和冻干规程”的规定。  除另有规定外多剂量包装的注射剂每一容器的装量不得超过次注射剂  量。  六、注射剂在灌装后应立即熔封或加塞严封。要求真空或充氮封口者容器  内应先排除空气然后真空熔封或填充纯氮气熔封。对温度敏感的制品在灌封  过程中应控制温度灌封完成后的注射剂应立即置于规定的温度下保存。  七、注射用冻干制剂分装后应及时冷冻干燥采用适宜条件按“生物制品分装  和冻干规程”进行。冻干后残留水分应符合相关品种的要求。  除另有规定外熔封或严封后的注射剂应采用减压法或其他适宜的方法进  行容器检漏。  八、除另有规定外应置~℃避光贮存和运输。  注射剂应进行以下相应检查。  【装量】除另有规定外注射液应符合规定。  注射液的标示装量为ml或ml以下者取供试品支ml以上至ml者取供试品  支开启时注意避免损失将内容物分别用相应体积的干燥注射器及注射针  头抽尽然后注入标化的按量入而设计的量具内(量具的大小应使待测体积至少  占其额定体积的%)在室温下检视。测定混悬液的装量时应先摇匀再用  干燥注射器及注射针头抽尽后同前法操作室温检视。每支注射液的装量均  不得少于其标示量。  标示装量为ml以上的注射液照最低装量检查法(附录VF)检查应符合规定。  【装量差异】除另有规定外注射用冻干制剂的装量差异限度应符合规  定。  检查法取供试品瓶(支)除去标签、铝盖容器外壁用乙醇洗净干燥开  启时注意避免玻璃屑等异物落入容器中分别迅速精密称定倾出内容物容  器可用水、乙醇洗净·在适宜条件下干燥后再分别精密称定每一容器的重量  求出每瓶(支)的装量与平均装量。每瓶(支)中的装量与平均装量相比较应符  合下列规定。如有瓶(支)不符合规定应另取瓶(支)复试应符合规定。  【可见异物】除另有规定外照可见异物检查法(附录VB)检查应符合规定。  【无菌】照无菌检查法(附录ⅫA)检查应符合规定。        书页号:版药典三部附录页  附录ⅡA紫外一可见分光光度法  仪器的校正和检定  .波长由于环境因素对机械部分的影响仪器的波长经常会略有变动因  此除应定期对所用的仪器进行全面校正检定外还应于测定前校正测定波长。  常用汞灯中的较强谱线.nm.nm·nm·tml.nm  .nm.nm.nm·nm.nm与.nm或用仪器中  氘灯的·nm与.nm谱线进行校正钬玻璃在波长·nm.nm  .nm.nm·nm·Onm.nm.nm与.nm处有尖锐吸  收峰也可作波长校正用但因来源不同或随着时间的推移会有微小的变化  使用时应注意。  .吸光度的准确度可用重铬酸钾的硫酸溶液检定。取在~C干燥至恒重的  基准重铬酸钾约mg精密称定用O.OOmol/I。硫酸溶液溶解并稀释至  ml在规定的波长处测定并计算其吸收系数并与规定的吸收系数比较  应符合表中的规定。  ┏━━━━━━━━━┳━━━━━━━┳━━━━━━┳━━━━━━┳━━━━━┓  ┃波K/nm┃(/i~、)┃G.~)v)┃(最小)┃(~v)┃  ┣━━━━━━━━━╋━━━━━━━╋━━━━━━╋━━━━━━╋━━━━━┫  ┃吸收系数(ECM)┃.┃.┃.┃.┃  ┃的规定值┃┃┃┃┃  ┃吸收系数(E)┃.O~┃.~┃.O~┃.~┃  ┃的许可范围┃.O┃.┃.┃.┃  ┗━━━━━━━━━┻━━━━━━━┻━━━━━━┻━━━━━━┻━━━━━┛  .杂散光的检查可按下表所列的试剂和浓度配制成水溶液置lcm石英吸  收池中在规定的波长处测定透光率应符合表中的规定。  ┏━━━━━━┳━━━━━━━┳━━━━━━━━┳━━━━━━┓  ┃试剂┃NN/%(g/m)┃测定垌波长/nm┃透光率/%┃  ┣━━━━━━╋━━━━━━━╋━━━━━━━━╋━━━━━━┫  ┃碘化钠┃.┃┃<O.┃  ┃亚硝酸钠┃.OO┃┃<O.┃  ┗━━━━━━┻━━━━━━━┻━━━━━━━━┻━━━━━━┛  含有杂原子的有机溶剂通常均具有很强的末端吸收。因此当作溶剂使  用时它们的使用范围均不能小于截止使用波长。例如甲醇、乙醇的截止使  用波长为nm。另外当溶剂不纯时也可能增加干扰吸收。因此在测定  供试品前应先检查所用的溶剂在供试品所用的波长附近是否符合要求即  将溶剂置cm石英吸收池中以空气为空白(即空白光路中不置任何物质)测定  其吸光度。溶剂和吸收池的吸光度在~nm范围内不得超过.在  l~nm范围内不得超过O·在~nm范围内不得超过.在nm以  上时不得超过O.。  测定法  测定时除另有规定外应以配制供试品溶液的同批溶剂为空白对照采  用CM的石英吸收池在规定的吸收峰波长±nm以内测试几个点的吸光度或  由仪器在规定波长附近自动扫描测定以核对供试品的吸收峰波长位置是否  正确。除另有规定外吸收峰波长应在该品种项下规定的波长±nml以内并  以吸光度最大的波长作为测定波长。一般供试品溶液的吸光度读数以在  .~O.之间的误差较小。仪器的狭缝波带宽度应小于供试品吸收带的半宽  度的十分之一否则测得的吸光度会偏低狭缝宽度的选择应以减小狭缝宽  度时供试品的吸光度不再增大为准。由于吸收池和溶剂本身可能有空白吸收  因此测定供试品的吸光度后应减去空白渎数或由仪器自动扣除空白读数后再  计算含量。  当溶液的pH值对测定结果有影响时应将供试品溶液和对照品溶液的pH值  调成一致。  .鉴别和检查分别按各品种项下规定的方法进行。  .含量测定一般有以下几种。  ()对照品比较法按各品种项下的方法分别配制供试品溶液和对照品溶液  对照品溶液中所含被测成分的量应为供试品溶液中被测成分规定量的%±%  所用溶剂也应完全一致在规定的波长处测定供试品溶液和对照品溶液的吸光  度后按下式计算供试品中被测溶液的浓度:  Cx=(Ax/AR)CR  式中cx为供试品溶液的浓度  Ax为供试品溶液的吸光度  cR为对照品溶液的浓度  AR为对照品溶液的吸光度。  ()吸收系数法按各品种项下的方法配制供试品溶液在规定的波长处测定其  吸光度再以该品种在规定条件下的吸收系数计算含量。用本法测定时吸收  系数通常应大于并注意仪器的校正和检定。  ()计算分光光度法计算分光光度法有多种使用时均应按各品种项下规定的  方法进行。当吸光度处在吸收曲线的陡然上升或下降的部位测定时波长的  微小变化可能对测定结果造成显著影响故对照品和供试品的测试条件应尽可  能一致。计算分光光度法一般不宜用作含量测定。  ()比色法供试品本身在紫外一可见区没有强吸收或在紫外区虽有吸收但为  了避免干扰或提高灵敏度可加入适当的显色剂显色后测定这种方法为比  色法。  用比色法测定时由于显色时影响显色深浅的因素较多应取供试品与对照  品或标准品同时操作。除另有规定外比色法所用的空白系指用同体积的溶  剂代替对照品或供试品溶液然后依次加入等量的相应试剂并用同样方  法处理。在规定的波长处测定对照品和供试品溶液的吸光度后按上述()法  计算供试品浓度。  当吸光度和浓度关系不呈良好线性时应取数份梯度量的对照品溶液用溶  剂补充至同一体积显色后测定各份溶液的吸光度然后以吸光度与相应的浓  度绘制标准曲线再根据供试品的吸光度在标准曲线上查得其相应的浓度并  求出其含量。        页码数:版药典附录第页  附录ⅥE组胺人免疫球蛋白中  游离磷酸组胺测定法  本法系依据磷酸组胺与邻苯二甲醛在碱性条件下生成荧光衍生物以此测  定组胺人免疫球蛋白中游离磷酸组胺含量。  磷酸组胺对照品溶液的制备取磷酸组胺对照品mg精密称定置ml量瓶  中用O.m/L。盐酸溶液溶解并稀释至刻度摇匀作为磷酸组胺贮备  液一℃贮存备用。试验当天准确量取磷酸组胺贮备液O.ml置ml量瓶  中用O.mol/L盐酸溶液稀释至刻度即为磷酸组胺对照品溶液。  供试品溶液的制备取供试品O.ml加水.ml混匀加%三氯醋酸溶  液.ml混匀每分钟转离心分钟取上清液即为供试品溶液。  测定法取供试品溶液.ml置试管中加氯化钠g再加正丁醇.ml、  .mol/l氢氧化钠溶液·ml立即混匀分钟静置后取出正丁醇相.ml  加到已装有O.mol/L盐酸溶液.ml和正庚烷.ml的试管内震荡分钟弃  有机相取盐酸相.ml加入等体积水再加.mol/L氢氧化钠溶液.ml  混匀并迅速加入.%邻苯二甲醛一甲醇溶液O.ml立即混匀置~℃  分钟加O.tmol/L盐酸溶液.ml终止反应取终止反应后的溶液~加  入酶标板孔中用荧光酶标仪在激发波长nm和发射波长nm处测荧光强  度。  准确量取磷酸组胺对照品溶液.ml、.ml、·ml、·ml、O.ml、O.ml、  O.ml、O.ml分别置试管中各以.mol/L盐酸溶液补足至.ml向各  管中加水O.ml、%三氯醋酸溶液.ml混匀加氯化钠.g自"加正丁  醇.ml※’起同法操作。  将磷酸组胺对照品溶液的浓度对其相应的荧光强度作直线回归将供试品  溶液的荧光强度代人直线回归方程求出供试品溶液碱基含量(G)按下式计  算供试品游离组胺含量(ng/m)=G×.×.(稀释倍数)  【附注】磷酸组胺相对分子质量为.对照附录ⅥFo一乙酰基测定  法品溶液浓度按碱基计碱基与磷酸组胺相对分子质量比为:.。        页码数:版药典附录第页  附录VD融变时限检查法  本法系用于检查栓剂、阴道片等固体制剂在规定条件下的融化、软化或溶  散情况。  一、栓剂  仪器装置由透明的套筒与金属架组成(如图)。  图(图略)  透明套筒为玻璃或适宜的塑料材料制成高为mm内径为mm及适当  的壁厚。  金属架由两片不锈钢的金属圆板及个金属挂钩焊接而成。每个圆板直径  为mm具个孔径为mm的圆孔(如图)两板相距mm通过个等距的挂钩  焊接在一起。  检查法取供试品粒在室温放置小时后分别放在个金属架的下层圆板  上装入各自的套筒内并用挂钩固定。除另有规定外将上述装置分别垂直  浸入盛有不少于L的.℃±O.℃水的容器中其上端位置应  单位:mm  图(图略)  在水面下mm处。容器中装一转动器每隔分钟在溶液中翻转该装置一次。  结果判定除另有规定外脂肪性基质的栓剂粒均应在分钟内全部融化、  软化或触压时无硬心水溶性基质的栓剂粒均应在分钟内全部溶解。如有  粒不符合规定应另取粒复试均应符合规定。  二、阴道片  仪器装置同上述栓剂的检查装置但应将金属架挂钩的钩端向下倒置于  容器内如图示意。  图(图略)  一阴道片一玻璃板一水面  检查法调节水液面至上层金属圆盘的孔恰为均匀的一层水覆盖。取供试品  片分别置于上面的金属圆盘上装置上盖一玻璃板以保证空气潮湿。  结果判定除另有规定外阴道片片均应在分钟内全部溶化或崩解溶散  并通过开孔金属圆盘或仅残留少量无硬心的软性团块。如有片不符合规定  应另取片复试均应符合规定。        页码数:版药典附录第页  附录ⅦH枸橼酸离子测定法  第一法比色法  枸橼酸钠对照品溶液的制备取经减压干燥至恒重的枸橼酸钠  (CHNa·HzO)O.g精密称定置ml量瓶中加水溶解并稀释至刻度摇  匀精密量取ml置ml量瓶中用%三氯醋酸稀释至刻度摇匀即得。  供试品溶液的制备精密量取供试品.ml与水.ml加%三氯醋酸溶液  ml混匀置℃水浴加热分钟以每分钟转离心分钟取上清液备用。  测定法精密量取供试品溶液lml置ml具塞试管中精密加吡啶.ml混  匀再精密加醋酸酐·ml立即混匀并置~C土I~C的水浴中准确放置分钟  后照紫外可见分光光度法(附录ⅡA)在波长nm处测定吸光度。另精密量  取枸橼酸钠对照品溶液·ml、O.ml、O.ml、.ml分别置于具塞试管中  各精密加%三氯醋酸溶液.ml、O.ml、.ml、O·ml(其相对应的枸橼酸  离子含量为O.mmol/L、.mmol/L、.mmol/L、.mmol/L)自“精密加  吡啶.ml※’起同法操作。  用对照品溶液枸橼酸离子浓度和对应的吸光度作直线回归求得回归方程  计算出供试品溶液中的枸橼酸离子含量(mmol/L)再乘以供试品稀释倍数()  即为供试品枸橼酸离子含量(mmol/L)。  第二法高效液相色谱法  照高效液相色谱法(附录ⅢB)测定。  色谱条件用苯乙烯二乙烯基苯共聚物为基质的阳离子交换色谱柱(H)粒  度μm或μm内径.mm柱长mm柱温为℃流动相为.mol/L硫酸  溶液流速为每分钟.ml示差折光检测器。  测定法精密称取经减压干燥至恒重的枸橼酸钠(CHNa·H).g置  ml量瓶中用水溶解并稀释至刻度精密量取.ml、.ml、·ml分别  置ml量瓶中用水稀释至刻度摇匀即得相对应的.mmol/L、.  mmol/L、.mmol/L枸橼酸离子对照品溶液。分别精密量取μl注入液相色  谱仪记录色谱图另精密量取供试品溶液lml置m离心管中精密加  .%磺基水杨酸溶液lml混匀。室温下以每分钟转离心分钟。取上清  液同法测定。  用对照品溶液的枸橼酸离子浓度对峰面积进行直线回归求得回归方程  计算出供试品溶液枸橼酸钠含量(mmol/L)再乘以供试品稀释倍数()计算出  供试品枸橼酸离子含量(mmol/L)。  【附注】()根据供试品枸橼酸离子含量可适当调整枸橼酸离子对照品溶液  浓度。  ()直线回归相关系数应不低于.。  ()不同厂家的阳离子交换色谱柱(H)的流速、流动相、柱温等会有所不同  可根据色谱柱说明书对色谱条件进行适当调整。        页码数:版药典附录第页℃  附录ⅧE肽图检查法  本法系通过蛋白酶或化学物质裂解蛋白质后采用适宜的分析方法鉴定蛋  白质一级结构的完整性和准确性。  第一法胰蛋白酶裂解一反相高效液相色谱法  照高效液相色谱法(附录ⅢB)测定。  色谱条件用蛋白质与多肽分析用辛烷基硅烷键合硅胶或十八烷基硅烷键合  硅胶为填充剂柱温为℃±℃供试品保存温度为℃±O.℃以O.%三氟  乙酸的水溶液为流动相A液以O.%三氟乙酸的乙腈溶液为流动相B液流速  为每分钟lml梯度洗脱分钟(A液从%至%B液从O至%)检测波长为  nm。  检查法取供试品溶液及对照品溶液(均为每lml中含lmg的溶液如供试品和对  照品浓度不够则应浓缩至相应的浓度)分别用%碳酸氢铵溶液充分透析  按:(mg/mg)加入胰蛋白酶溶液取甲苯磺酰苯丙氨酰氯甲酮处理过的(或序列  分析纯)胰蛋白酶适量加%碳酸氢铵溶液溶解制成每lml中含O.mg的溶液  到供试品溶液与对照品溶液中在~C保温小时后按:加入%醋酸溶  液以每分钟转离心分钟精密量取上清液(或用O.μm滤膜滤过)μ  分别注入液相色谱仪梯度洗脱记录色谱图。将供试品溶液与对照品溶液的  图谱进行比较即得。  第二法溴化氰裂解法  检查法取供试品与对照品适量(约相当于蛋白质μg)用水透析小时冷  冻干燥加溴化氰裂解液取溴化氰O.g加甲酸()lml使溶解μl溶解室  温放置小时裂解物加水μ再冷冻干燥。冻干的裂解物用水复溶至适当  浓度。照SDS聚丙酰胺凝胶电泳法(附录ⅣC)(胶浓度%)进行电泳用银染法染  色。  将供试品图谱与对照品图谱进行比较即得

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