重组人表皮生长因子凝胶(酵母) (新增)重组人表皮生长因子凝胶（酵母）
Chongzu Ren Biaopi Shengzhangyinzi Ningjiao (Jiaomu)
Recombinant Human Epidermal Growth Factor Gel（Yeast）
本品系由高效表达人表皮生长因子基因的酵母，经发酵、分离和高度纯化后,加入凝胶基质制成。含适宜稳定剂，防腐剂，不含抗生素。
1 基本要求
生产和检定用设施、原料及辅料、水、器具、动物等应符合“凡例”的有关要求。
2 制造
2.1 工程菌菌种
2.1.1 名称及来源...
重组人表皮生长因子凝胶（酵母）
Chongzu Ren Biaopi Shengzhangyinzi Ningjiao (Jiaomu)
Recombinant Human Epidermal Growth Factor Gel（Yeast）
本品系由高效表达人表皮生长因子基因的酵母，经发酵、分离和高度纯化后,加入凝胶基质制成。含适宜稳定剂，防腐剂，不含抗生素。
1 基本要求
生产和检定用设施、原料及辅料、水、器具、动物等应符合“凡例”的有关要求。
2 制造
2.1 工程菌菌种
2.1.1 名称及来源
重组人表皮生长因子工程菌株，系由带有人工合成的人表皮生长因子基因的DNA片段整合到酵母菌染色体基因组中构建而成。
2.1.2 种子批的建立
应符合“生物制品生产检定用菌毒种管理规程”的规定。
2.1.3 菌种检定
主种子批和工作种子批的菌种应进行以下各项全面检定。
2.1.3.1 划种BMG1琼脂平板
应呈典型酵母菌菌落形态，无其他杂菌生长。
2.1.3.2 染色镜检
在光学显微镜下观察，应形状规则，用次甲兰染色，无死亡细胞。
2.1.3.3 筛选标志检查
应符合该基因表型特征。
2.1.3.4 人表皮生长因子表达量
在摇床中培养，应不低于原始菌种的表达量。
2.1.3.5 人表皮生长因子基因稳定性检查
涂BMG1琼脂平板，挑选至少50个克隆，用PCR检测人表皮生长因子基因，阳性率应不低于95％。
2.2 原液
2.2.1 种子液制备
将检定合格的工作种子批菌种接种于适宜的培养基（可含适量抗生素）中培养，供发酵罐接种用。
2.2.2 发酵用培养基
采用适宜的不含任何抗生素的培养基。
2.2.3 种子液接种及发酵培养
在灭菌培养基中接种适量种子液。在适宜温度下进行发酵，应采用经批准的发酵工艺，并确定相应的发酵条件，如温度、pH值、溶氧、补料、发酵时间等。
2.2.4 发酵液处理
用适宜的方法收集上清液。
2.2.5 纯化
采用经批准的纯化工艺进行纯化，使其达到3.1项要求，即为人表皮生长因子原液。除菌过滤后保存于适宜温度，并规定其有效期。
2.2.6 原液检定
按3.1项进行。
2.3 半成品制备
采用的基质应符合凝胶剂基质要求（附录I M）。
2.3.1配制与除菌
应按经批准的配方进行。
2.3.2凝胶制备
应按经批准的工艺进行。凝胶剂应均匀、细腻，在常温时保持胶状，不干涸或液化。
2.3.3 半成品检定
按3.2项进行。
2.4 成品
2.4.1 分批
应符合“生物制品分批规程”规定。
2.4.2 分装
应符合“生物制品分装和冻干规程”规定。
2.4.3 规格
应为经批准的规格。
2.4.4 包装
应符合“生物制品包装规程” 和附录ⅠM的有关规定。
3 检定
3.1 原液检定
3.1.1 生物学活性
依法测定（附录Ⅹ H）。
3.1.2 蛋白质含量
依法测定（附录Ⅵ B第二法）。
3.1.3 比活性
为生物学活性与蛋白质含量之比，每1mg 蛋白质应不低于5.0×105IU。
3.1.4 纯度
3.1.4.1 电泳法
依法测定（附录Ⅳ C）。用非还原型SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法，分离胶胶浓度为15.0％，加样量应不低于10μg（考马斯亮蓝R250染色法）或5μg（银染法）。经扫描仪扫描，纯度应不低于95.0％。
3.1.4.2 高效液相色谱法
依法测定（附录Ⅲ B）。色谱柱采用丁基硅烷键合硅胶为填充剂；以A相（三氟乙酸-水溶液：取0.5ml三氟乙酸加水至1000ml，充分混匀）、以B相（三氟乙酸-乙腈溶液：取0.5ml三氟乙酸加入色谱纯乙腈至1000ml，充分混匀）为流动相，在室温条件下，进行梯度洗脱（22～37%B相），上样量应不低于5μg，于波长280nm处检测，以人表皮生长因子色谱峰计算理论板数，应不低于500。按面积归一化法计算，人表皮生长因子主峰面积应不低于总面积的95.0％。
3.1.5 分子量
依法测定（附录Ⅳ C）。用还原型SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法，分离胶胶浓度为15.0％，加样量应不低于1.0μg，分子质量应为5.9kD+0.659kD。
3.1.6 外源性DNA残留量
每1支应不高于10ng（附录Ⅸ B）。
3.1.7 宿主菌蛋白残留量
应不高于总蛋白质的0.1%（附录Ⅸ E）。
3.1.8 甲醇含量
甲醇含量应不高于0.002％（附录Ⅲ C）。
3.1.9 等电点
主区带应为4.0～5.0，供试品的等电点与对照品的等电点图谱一致（附录IV D）。
3.1.10 紫外光谱扫描
用水或生理氯化钠溶液将供试品稀释至约100μg/ml～500μg/ml，在光路1cm、波长230nm～360nm下进行扫描,最大吸收峰波长应为277±3nm（附录Ⅱ A）。
3.1.11 肽图（每半年测定一次）
依法测定（附录Ⅷ E）,应与对照品图形一致。
3.1.12 N-末端氨基酸序列（至少每年测定一次）
用氨基酸序列分析仪测定，其N-末端序列应为：
Asn—Ser—Asp—Ser—Glu—Cys—Pro—Leu—Ser—His—Asp—Gly—Tyr—Cys—Leu。
3.1.13 鉴别试验
按免疫印迹法（附录Ⅷ A）或免疫斑点法（附录Ⅷ B）测定，应为阳性。
3.2 半成品检定
3.2.1 生物学活性
应按经批准的方法预处理供试品，依法测定（附录 X H），应符合要求。
3.2.2 无菌检查
应按经批准的方法预处理供试品，依法检查（附录Ⅻ A），应符合规定。
3.3 成品检定
除外观、装量检查外，应按经批准的方法预处理供试品后，进行其余各项检定。
3.3.1 鉴别试验
按免疫印迹法（附录Ⅷ A）或免疫斑点法（附录Ⅷ B）测定，应为阳性。
3.3.2 物理检查
3.3.2.1 外观
应为无色透明凝胶，无颗粒，不析水。
3.3.2.2 装量
依法检查(附录Ⅴ F)，应符合规定。
3.3.3 pH值
应为6.5～8.0（附录Ⅴ A）。
3.3.4 生物学活性
应为标示量的70%～200%（附录Ⅹ H）。
3.3.5 无菌检查
依法检查（附录Ⅻ A），应符合规定。
4 保存、运输及有效期
于4～25℃避光处保存和运输。自生产分装之日起，按批准的有效期执行。
5 使用说明
应符合“生物制品包装规程”、附录I M的规定和批准的内容。
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