重组牛碱性成纤维细胞生长因子凝胶
Chongzu Niu Jianxing Chengxianwei Xibao Shengzhangyinzi Ningjiao
Recombinant Bovine Basic Fibroblast Growth Factor Gel
本品系由高效
表
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达牛碱性成纤维细胞生长因子基因的大肠杆菌，经发酵、分离和高度纯化后，加入凝胶基质制成。含适宜稳定剂、防腐剂，不含抗生素。
1.基本要求
生产和检定用设施、原料及辅料、水、器具、动物等应符合现行版《中国药典》三部“凡例”的有关要求。
2 制造
2.1 工程菌菌种
2.1.1名称及来源
重组牛碱性成纤维细胞生长因子工程菌株系由带有牛碱性成纤维细胞生长因子基因的重组质粒转化的大肠杆菌菌株。
2.1.2 种子批建立
应符合 “生物制品生产检定用菌毒种管理规程”的规定。
2.1.3 菌种检定
主种子批和工作种子批的菌种应进行以下各项全面检定。
2.1.3.1 划种LB琼脂平板
应呈典型大肠杆菌集落形态，无其他杂菌生长。
2.1.3.2染色镜检
应为典型的革兰氏阴性杆菌。
2.1.3.3 对抗生素的抗性
应与原始菌种相符。
2.1.3.4 电镜检查（工作种子批可免做）
应为典型大肠杆菌形态，无支原体、病毒样颗粒及其他微生物污染。
2.1.3.5 生化反应
应符合大肠杆菌生物学性状。
2.1.3.6 牛碱性成纤维细胞生长因子表达量
在摇床中培养，应不低于原始菌种的表达量。
2.1.3.7 质粒检查
该质粒的酶切图谱应与原始重组质粒相符。
2.1.3.8目的基因核苷酸序列检查（工作种子批可免做）
目的基因核苷酸序列应与批准序列相符。
2.2 原液制备
2.2.1 种子液制备
将检定合格的工作种子批菌种接种于适宜的培养基（可含适量抗生素）中培养，供发酵罐接种用。
2.2.2 发酵用培养基
采用适宜的不含抗生素的培养基。
2.2.3 种子液接种及发酵培养
在灭菌培养基中接种适量种子液。在适宜温度下进行发酵，应采用经批准的发酵工艺，并确定相应的发酵条件，如温度、PH值、溶氧、补料、发酵时间等。
2.2.4 发酵液处理
用适宜的方法处理菌体。
2.2.5 纯化
采用经批准的纯化工艺进行纯化，使其达到3.1项要求，即为牛碱性成纤维细胞生长因子原液。加入稳定剂，除菌过滤后保存于适宜温度，并规定其有效期。
2.2.6 原液检定
按3.1项进行。
2．3 半成品制备
采用的基质应符合凝胶剂基质要求（附录I M）。
2.3.1配制与除菌
应按经批准的配方进行。
2.3.2凝胶制备
应按经批准的工艺进行。凝胶剂应均匀、细腻，在常温时保持胶状，不干涸或液化。
2.3.3半成品检定
按3.2项进行。
2.4 成品
2.4.1 分批
应符合“生物制品分批规程”规定。
2.4.2 分装
应符合“生物制品分装和冻干规程”规定。
2.4.3 规格
应为经批准的规格。
2.4.4 包装
应符合“生物制品包装规程” 和附录I M的有关规定。
3 检定
3.1 原液检定
3.1.1 生物学活性
依法测定（附录X G）。
3.1.2 蛋白质含量
依法测定（附录VI B 第二法）。
3.1.3 比活性
为生物学活性与蛋白质含量之比，每1mg 蛋白质应不低于1.7×105IU。
3.1.4 纯度
3.1.4.1 电泳法
依法测定（附录IV C）。用非还原型SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法，分离胶胶浓度为15.0％，加样量应不低于10μg（考马斯亮蓝R250染色法）或5μg（银染法）。经扫描仪扫描，纯度应不低于95.0％。
3.1.4.2 高效液相色谱法
依法测定（附录III B）。色谱柱采用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以A相（三氟乙酸-水溶液：取1.0ml三氟乙酸加水至1000ml，充分混匀）、B相（三氟乙酸-乙腈溶液：取1.0ml三氟乙酸加入色谱纯乙腈至1000ml，充分混匀）为流动相，在室温条件下，进行梯度洗脱（0～70%B相）。上样量不低于10(g，于波长280nm处检测，以牛碱性成纤维细胞生长因子色谱峰计算理论塔板数应不低于2000，按面积归一化法计算，牛碱性成纤维细胞生长因子主峰面积应不低于总面积的95.0%。
3.1.5 分子量
依法测定（附录IV C）。用还原型SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法，分离胶胶浓度为15.0％，加样量应不低于1.0μg，制品两条蛋白带的分子质量应分别为17.5kD+1.875kD和22.0kD+2.20kD。
3.1.6 外源性DNA残留量
每1支应不高于10ng（附录 IX B）。
3.1.7 等电点
主区带应为9.0～10.0,供试品的等电点与对照品的等电点图谱一致（附录IV D）。
3.1.8 紫外光谱扫描
用水或生理氯化钠溶液将供试品稀释至约100μg/ml～500μg/ml，在光路1cm、波长230nm～360nm下进行扫描,最大吸收峰波长应为277±3nm（附录II A）。
3.1.9 肽图（每半年测定一次）
依法测定(附录VIII E),应与对照品图形一致。
3.2 半成品检定
3.2.1 生物学活性
应按经批准的方法预处理供试品，依法测定（附录 X G ），应符合规定。
3.2.2无菌检查
应按经批准的方法预处理供试品，依法检查（附录XII A），应符合规定。
3.3 成品检定
除外观、装量检查外，应按经批准的方法预处理供试品后，进行其余各项检定。
3.3.1 鉴别试验
按免疫印迹法（附录VIII A）或免疫斑点法（附录VIII B）测定，应为阳性。
3.3.2 物理检查
3.3.2.1 外观
应为无色透明凝胶。
3.3.2.2 装量
依法检查(附录V F)，应符合规定。
3.3.3 pH值
按经批准的方法对样品进行预处理,应为6.5～7.5（附录V A）。（按1：5的比例用水对凝胶进行稀释）
3.3.4 生物学活性
按经批准的方法对样品进行预处理，应为标示量的70%～200%（附录X G）。（用RPMI1640培养基预稀释后测定）
3.3.5 无菌检查
依法检查（附录XII A），应符合规定。
4 保存、运输及有效期
于2～8℃避光处保存和运输。自生产分装之日起，按批准的有效期执行。
5 使用说明
应符合“生物制品包装规程”的规定和批准的内容。
浙公网安备 33021202002483