执业药师资格考试辅导 药物分析
第六章 色谱法
第一节 概 述
一、概念
色谱法:是一种物理或物理化学分离分析方法。
优点:高灵敏度、高选择性、高效能、分析速度快、应用范围广。
应用:各国药典中广泛用作定性鉴别、纯度检查、含量测定。
分类:
流动相:气体→气相色谱法
液体→液相色谱法
固定相:固体或液体
气-固色谱法;气-液色谱法
液-固色谱法;液-液色谱法
操作形式:柱色谱法、平板色谱法、电泳法
分离机制:分配、吸附、离子交换、分子排阻及亲合色谱法
二、色谱过程:
是物质分子在相对运动的两相(固定相和流动相)间分配平衡过程,可用分配系数(K)和容量因子(k)来描述。
1.分配系数:组分在固定相和流动相之间的分配平衡时的浓度之比。
K = cs/cm
K:与组分、固定相、流动相的性质及温度有关。
K差异→分离
2.容量因子:质量分配系数,组分在固定相和流动相中的质量之比。
k= Ws/Wm
k= csVS/cmVM = KVS/VM
k: 与组分、固定相、流动相的性质及温度有关;与两相体积有关。
(k比K更易测定,常用k代替K)
# 组分的容量因子不等是色谱分离的先决条件
第二节 薄层色谱法(TLC)
掌握薄层色谱法的基本及方法
一、基本原理
(一)原理:
物理化学的分离技术:吸附剂均匀铺在光洁表面的玻璃板或塑料板----薄层→色谱分离。
固定相(吸附剂):硅胶、氧化铝。
吸附→解吸附→再吸附→再解吸附
难被吸附的化合物移动快些;易被吸附的化合物移动慢些,以达到分离
(二)特点:
优点:快速、简便、高选择、灵敏、显色方便
缺点:重现性差、不易保存、制备性薄层分离量不如柱色谱大
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Rf最佳范围0.3~0.5;可用范围0.2~0.8
(四)分离度: R=2d/(W1+W2)
d:两斑点中心间的距离;两色谱峰顶间距离(薄层扫描)
W:斑点宽度;色谱峰宽(薄层扫描)
R=2lo (Rf2 - Rf1)/(W1+W2)
二、吸附剂(略)
三、薄层制备(略)
四、吸附剂、展开剂选择(略)
五、点样与展开(略)
六、定性与定量分析
(一)定性分析:供试品、对照品点在同一薄层板上→展开显色后→供试品、对照品比移值一致→可认为供试品与对照品是同一物质。
(二)纯度检查:供试品、杂质、对照品点在同一薄层板上→展开剂展开、(显色)→杂质斑点颜色与对照品斑点比较,不得更深→可认为未超过规定的含杂质最高限量。
(三)定量分析:目视法;捕集斑点洗脱后测定。
B型题:
[96-100]中国药典(1990年版)方法是:
【答疑编号21060101】
掌握气相色谱法和高效液相色谱法的基本原理,气相色谱仪和高效液相色谱仪的基本组成,色谱系统的系统适用性试验的主要内容,定量分析方法。
第三节 气相色谱法(GC) :气体为流动相
(一)GC法分类:
固定相的物态分类:气-固 GSC;气-液 GLC
色谱柱分类:填充柱色谱;毛细管柱色谱(开口毛细管柱、填充毛细管柱)
分离过程:吸附;分配
(二)GC特点:
优点:高分离效能;高选择性(同位素、异构体);高灵敏度(10-11~10-12g);应用范围广(有机物20%);简便、快速。
缺点:沸点>450°C,难挥发物质;热稳定性差;没待测物纯品及相应的色谱定性数据不能分析。
一、基本原理
Van Deemter 速率理论;塔板理论
(一)色谱图、有关术语:
1.基线:
2.色谱峰:正常峰、前延峰、拖尾峰。
拖尾因子T=W0.05/2d1
T 0.95-1.05 对称峰
<0.95 前延峰
>1.05 拖尾峰
色谱峰:峰高、峰面积→定量
峰位(保留值)→定性
区域宽度(峰宽)→衡量柱效
X型题:
在气相色谱法中,与含量成正比的是色谱峰的:
A.保留体积
B.保留时间
C.相对保留值
D.峰高
E.峰面积
【答疑编号21060102】
答案:DE
B型题(91-95)
A.0.3 B.0.95~1.05 C.1.5 D.6 E.10
91.恒重是指两次称量的毫克数不超过 A
92.在色谱定量分析中,分离度R应大于 C
93.溶出度测定时,一般应采取供试品的片数为 D
94.含量均匀度测定时,一般初试应取供试品片数为 E
95.在气相色谱法中,除另有规定外,拖尾因子应为 B
【答疑编号21060103】
3.色谱峰区域宽度:
σ----
标准
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偏差,正态分布曲线上两拐点距离一半0.607h 时峰宽的一半
Y1/2(W1/2)=2.355σ;Y(W)=4σ
4.保留值(滞留值):
tM tR t’R Vm VR V’R
r2,1 = t’R2/ t’R1 = V’R2/ V’R1 = k2/k1
(二)塔板理论:
分馏过程概念、理论、方法→色谱
分配系数K=CL/CG(CS/Cm)
分配比k,容量因子,容量比,
k=WS/Wm=K× VL/VG=K× CS/Cm
n=(tR/s)2=5.54(tR/ Wh/2)2
H=L/n
(三)速率理论:H=A+B/u+C× u
二、气相色谱仪
(一)色谱柱
(二)固定液
常用的固定液: SE-30、SE-54、OV-17等
固定液的选择:相似相溶原则
(三)载体(担体)(略)
(四)毛细管色谱柱
开管型毛细管柱;填充型毛细管柱
(五)检测器:
1.浓度型检测器:热导、电子捕获
质量型检测器:FID
2.性能指标:
(1)灵敏度S:响应值----检测器的响应讯号对进样量(浓度或质量)的变化率
(2)检测限D(敏感度M)
(3)线性范围
(六)中国药典(2005年版)对气相色谱仪的一般要求
一般要求:载气:氮气
气化室(进样口)温度:高于柱温30~50℃
进样量μm
检测器:FID 温度高于柱温,并不低于100℃,→防水气凝结,250~350℃
一般色谱图30分钟内记录完毕
第四节 高效液相色谱法(HPLC)
一、概述
HPLC:液体作流动相,高压输液,高效固定相,高灵敏度检测器。
特点:HPLC 有机物80%(GC,有机物20%)
对挥发性低,热稳定性差,分子量大的高分子化合物,离子型化合物的分析分离,易收集分离产物→制备
分类:LLC 分配,离子交换色谱
LSC 吸附,离子对色谱
液-液分配色谱→化学键合固定相:极性(正相键合色谱);非极性(反相键合色谱)ODS(十八烷基硅烷键合相)
二、基本原理
GC:塔板理论、动力学理论→HPLC
三、各类HPLC
液-固吸附色谱法
液-液分配色谱法
正相色谱法;反相色谱法
离子抑制色谱法;反相离子对色谱法
四、高效液相色谱仪
1.贮液瓶
2.高压输液泵
3.色谱柱(分离系统)
4.检测器
5.数据处理系统
五、HPLC在药典中应用
(一)一般要求:
HPLC仪:
固定相:硅胶;化学键合硅胶;ODS C18、C8、氨基、氰基;
进样量:数ml;
室温:柱温;
检测器:紫外;
色谱图:20min;
系统适用性试验;
测定法同GC
(二)应用实例:
药典2005年版,186个品种,HPLC 测定
例:黄体酮,原料药的含量测定**
固定相:十八烷基硅烷键合硅胶
流动相:甲醇-水(66:33)
检测:254nm
理论板数:按黄体酮峰计算不低于1000
分离度:符合要求,黄体酮峰和内标物质峰R>1.5
内标:己烯酚
定量:内标峰面积
A型题:
各国药典对甾体激素类药物常用HPLC或GC法测定含量,主要原因是:
A.它们没有特征紫外吸收,不能用紫外分光光度法。
B.不能用滴定分析法进行测定。
C.由于“其它甾体”的存在,色谱法可消除它们的干扰。
D.色谱法比较简单,精密度好。
【答疑编号21060201】
答案:C
X型题
测定阿司匹林片和栓中药物的含量可采用的方法是:
A.重量法
B.酸碱滴定法
C.高效液相色谱法
D.络合滴定法
E.高锰酸钾法
【答疑编号21060202】
答案:BC
络合滴定法主要用于金属离子的测定;
阿司匹林易水解、氧化,不易用重量法(沉淀、过滤、干燥);
片剂淀粉不能用高锰酸钾法。
第五节 色谱系统适用性试验和定量分析方法
一、系统适用性试验
对照品试验,调整达规定的要求,规定分析状态下色谱柱最小理论塔板数,分离度,拖尾因子。
(1)柱效(最小理论塔板数) n=5.54(tR/ Wh/2)2tR(保留时间,min), Wh/2(半峰宽,cm)统一单位
(2)分离度 分离度R=2(tR2-tR1)/(W1+W2)
R 3 1.5
A型题:
测得两色谱峰的保留时间tR1=6.5min,tR2=8.3min,峰宽W1=1.0min,W2=1.4min,则两峰分离度R为:
A.0.22
B.1.2
C.2.5
D.0.75
E.1.5
【答疑编号21060203】
答案:E
(3)重复性(精密度):2.0%(相对标准偏差RSD)
(4)拖尾因子(T):0.95 ~ 1.05
二、定量方法:5种
三、应用实例:
2005年版药典维生素E(各种剂型),采用气相色谱法测含量
(1)色谱条件与系统适用性试验:
OV-17(硅酮)固定相,涂布浓度2%,柱温265°C,理论塔板数,按维生素E峰不低于500,VE峰与内标物质R>2。
(2)校正因子测定:内标,正三十二烷。
A型题:
中国药典(1990年版)收载的用气相色谱法测量含量的药物是:
A.盐酸氯丙嗪
B.维生素E
C.硫酸奎宁
D.碘解磷定
E.苯佐卡因
【答疑编号21060204】
答案:B
A型题:
中国药典(1995年版)采用气相色谱法测定维生素E含量,内标物质为:
A.正二十二烷
B.正二十六烷
C.正三十烷
D.正三十二烷
E.正三十六烷
【答疑编号21060205】
答案:D
A型题:
中国药典(1995年版)采用以下何法测定维生素E含量
A.酸碱滴定法
B.氧化还原法
C.紫外分光光度法
D.气相色谱法
E.非水滴定法
【答疑编号21060206】
答案:D
X型题:
HPLC法与GC法用于药物复方制剂的分析时,其系统适用性试验系指
A.测定拖尾因子
B.测定回收率
C.测定保留体积
D.测定分离度
E.测定柱的理论板数
【答疑编号21060207】
答案:ADE
第六节 电泳法
掌握电泳法的基本原理和方法类型、
毛细管电泳法的基本装置与分离模式
在电场的作用下,依据各组分之间淌度的不同而实现分离。
A型题
电泳法是:
A.在电场下测量电流的一种分析方法。
B.在电场下测量电导的一种分析方法。
C.在电场下测量电量的一种分析方法。
D.在电场下分离供试品中不带电荷组分的一种方法。
E.在电场下分离供试品中带电荷组分的一种方法。
【答疑编号21060208】
答案:E
一、基本原理
基本理论:
u=mE
u:离子的电泳迁移速度
m:电泳淌度(电泳度)
E:电场强度(电压梯度)
E一定,淌度差-两组分分离程度
电泳淌度与组分所带电量成正比
电渗:电泳所用的支持物(如滤纸)在溶液中带负电,而使接近其表面的缓冲液带正电,且形成双电层。在电场的作用下,带正电的缓冲液整体向负极移动,形成电渗。
电泳分离各组分的相对位置由组分的电泳泳动和缓冲液的电渗共同决定。
影响电泳分离的条件:
(1)缓冲液的pH值和离子强度→直接影响组分的荷电情况,是电泳分离的最重要条件。
(2)电场强度:一般是20V/cm
(3)样品浓度:1%
二、电泳仪(略)
直流稳压电源+电泳室
三、各类电泳法
(1)纸电泳法
(2)醋酸纤维素电泳法
(3)琼脂糖凝胶电泳法
(4)聚丙烯酰胺凝胶电泳法
(5)SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳法
四、毛细管电泳法
以弹性石英毛细管为分离通道,以高压直流电场为驱动力,依据样品中各组分之间淌度和分配行为上的差异而实现分离。
设备主要部件:0~30kV可调稳压稳流电源、内径小于100mm长度一般为30~100cm的弹性石英毛细管、电解槽、检测器和进样装置。
毛细管电泳的分离模式:毛细管区带电泳(CZE)、毛细管凝胶电泳(CGE)、胶束电动毛细管色谱(MEKC)、亲和毛细管电泳(ACE)、毛细管电泳色谱(CEC)、毛细管等电聚焦电泳(CIEF)、毛细管等速电泳(CITP)。
毛细管电泳法的系统适用性试验和测定法同高效液相色谱法。
A型题:
用电位法测定溶液 pH值时,需用标准缓冲液对酸度计进行定位:
A.定位后,更换玻璃电极测量中不会产生较大误差。
B.定位后,测量中定位钮不能再变动。
C.定位后,变动定位钮对测量无影响。
D.定位后,只要不动定位钮,可以使用数天。
E.酸度计测量的准确度只与标准缓冲液的准确度有关。
【答疑编号21060209】
答案:B
第七节 氧瓶燃烧法
掌握氧瓶燃烧法的基本原理,仪器装置与测定方法及其注意事项
一、基本原理
将有机药物放入充满氧气的燃烧瓶中进行燃烧,等燃烧产物吸入吸收液后,再采用适宜的分析方法进行鉴别、检查,或测定卤素、硫等其它元素的含量。
二、仪器装置和设备
(1)燃烧瓶:磨口、硬质、玻璃锥形瓶。
体积:3~5mg→150~250ml
20~30mg→300~500mg
50~60mg→1000ml
0.6~0.7ml→2000ml
瓶口→器皿状,能封水,水封。
→瓶塞→空心,熔封铂丝一根,下端螺旋状、网状;2/3瓶身长。
(2)称样用材料及称样:
无灰滤纸(固体样品);纸袋(液体样品)。
(3)氧气:-钢瓶。避免导气管污染。
(4)吸收液:
定量吸收,并转为合适测定价态。
水;水-NaOH;水-NaOH-浓H2O2;HNO3(1→30)。
三、燃烧操作法
称样→包样→放样,尾部露出。
加吸收液→通氧(1分钟){小心急速}
点燃→放入燃烧瓶→水封瓶口→燃烧完全
燃完→振摇→吸收→放置15分钟
空白试验
四、注意事项
1.燃烧完全;
2.吸收完全;
3.防爆;
4.氟化物→石英燃烧瓶;
5.Pt→Ni-Cd
五、应用
测定对象:有机卤素、硫、硒等杂质检查;
含卤素、硫有机药物鉴别及含量测定
X型题
选择氧瓶燃烧法所必备的实验物品:
A.磨口、硬质、玻璃锥形瓶
B.铂丝
C.普通滤纸
D.氢气
E.无灰滤纸
【答疑编号21060210】
答案:ABE
X型题
氧瓶燃烧法装置中有:
A.磨口、硬质玻璃锥形瓶
B.磨口、软质玻璃锥形瓶
C.铂丝
D.铁丝
E.铝丝
【答疑编号21060211】
答案:AC
A型题
氧瓶燃烧法测定含氯有机药物时所用吸收液多为
A.H2O2溶液
B.H2O2-NaOH溶液
C.NaOH溶液
D.硫酸肼饱和液
E.NaOH-硫酸肼饱和液
【答疑编号21060212】
答案:C
X型题
氧瓶燃烧法可用于
A.含卤素有机药物的含量测定
B.醚类药物的含量测定
C.检查甾体激素类药物中的氟
D.检查甾体激素类药物中的硒
E.芳酸类药物的含量测定
【答疑编号21060213】
答案:ACD
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