农药残留分析8第四章 农药残留测定方法-2

4.2 高效液相色谱法 4.2.1 概述 高效液相色谱法(High Performance Liquid Chromatography, HPLC)是20世纪60年代末期，在经典液体柱色谱的基础上，引入了气相色谱的理论和技术，并加以改进而发展起来的新型高效分离分析技术。高效液相色谱法是指流动相为液体的色谱技术。在技术上采用高压泵、高效固定相和高灵敏度检测器，实现了分析速度快，分离效率高和操作自动化。高压是高效液相色谱法的突出特点，系统内压力可达15~35MPa。由于流动相流经色谱柱时，柱内填料细密，受到阻力很大，为使流动相迅速通过色谱柱，携带农药样品进入检测室，就必须对流动相施以高压。近年来由于化学键合固定相的出现，高效液相色谱柱效可达3万塔板/m以上（气相色谱填充柱约为2000塔板/m），使分离效率大大提高。 高效液相色谱法是现代农药残留分析不可缺少的手段。高效液相色谱仪也是农药残留分析实验室必备的仪器设备。它解决了热稳定性差，难于气化、极性强的农药残留分析问 题 快递公司问题件快递公司问题件货款处理关于圆的周长面积重点题型关于解方程组的题及答案关于南海问题 。高效液相色谱法技术的进步，目前已经不仅仅是气相色谱法的重要补充和多残留分析方法的一种重要选择，而是随着高灵敏、通用型检测器的成功开发并应用，有希望胜任绝大多数农药残留分析任务。 1. 高效液相色谱法的特点 高效 由于使用了细粒度的高效填充柱和均匀填充技术，高效液相色谱法分离效率极高，柱效一般可达每米104理论塔板数。近年来出现的微型填充柱（内径为1mm）和毛细管液相色谱柱（内径为0.05mm），柱效超过了每米105理论塔板数，能够实现极为有效的分离。 高速 由于使用高压泵输送流动相；采用梯度洗脱装置；用检测器在柱后直接检测洗出液成分等原因，HPLC完成分离分析的时间只需几分钟到几十分钟，比经典液相色谱法要快得多。 高灵敏度 紫外、荧光、电化学等高灵敏度检测器的使用，使HPLC的灵敏度可与气相色谱法媲美。 高度自动化 现代先进的高效液相色谱仪配有计算机，不仅能够自动处理数据、打印分析结果，而且能够对仪器的全部操作包括流动相的选择、流速、柱温、检测器波长选择，以及进样、梯度洗脱方式等进行程序控制，成为全自动化的仪器。 不受分析试样挥发性和相对分子质量的限制，可用于分离高沸点、相对分子质量大、热稳定性差的农药残留及其代谢物的检测。 2. 基本原理 液相色谱法主要被分成两个类型：平面色谱（薄层色谱和纸色谱）和柱色谱。柱色谱可分为经典柱色谱（低压）和高效液相色谱（高压）。高效液相色谱法又可分为4种主要类型：液固吸附色谱法（LSC）；液液分配色谱法（LLC），主要是键合相色谱法（BPC）；离子交换色谱法（IEC）；空间排阻色谱法（SEC）。与经典的柱色谱法不同，高效液相色谱法采用高压泵，填充微粒固定相的短柱，并且随着组分的流出检测器就可以将样品的浓度记录下来。高效液相色谱法原理与经典的柱色谱法相同，它的进步主要依赖于色谱仪硬件的开发。高压泵能保证当压力不断升高的情况下，流量的精度没有变化，同时有大量的各种类型和规格的色谱柱供选用。 高效液相色谱法分离模式可分为4种基本形式（见图4-15）。建立农药残留分析的高效液相色谱方法，选用哪种分离模式取决于被分析农药的结构、性质以及对样品中所含有的干扰物质的分离（见图4-16）。一般讲，高效液相色谱法分析测定农药残留量以液液分配色谱的键合相色谱法最为常用。在这4种分离模式中，根据固定相和流动相相对极性有2种操作方式： 正相色谱法(NPC)：固定相的极性比流动相大，非极性组分先流出色谱柱；随着流动相极性的降低，被分析的组分保留时间增加。 反相色谱法(RPC)：固定相的极性比流动相小。绝大多数极性组分先流出，随着流动相极性的增加，被分析的组分保留时间延长。反相高效液相色谱法是农药残留分析最常用的一种操作方式。 ⑴. 液固色谱法 通常也叫液固吸附色谱法。流动相为液体，固定相为吸附剂，固定相（常用硅胶）通常为没有包裹固定液的液相色谱法。样品中各组分因对固定相表面吸附作用的差异，得以分离和分析。色谱柱内充填固体吸附剂，利用吸附剂表面活性中心进行吸附，试样不进入固定相内部。流动相带着被测组分进入柱子时，吸附剂不仅对不同的组分具有不同的吸附力，而且对流动相分子也具有一定的吸附作用，在吸附剂表面各组分分子之间及各组分分子与流动相分子之间发生吸附竞争，保留值由这两种因素决定。 液固吸附色谱法的特点：①. 适合可溶于有机溶剂的非离子型化合物的分离，特别是异构体及具有不同极性的取代基的化合物的分离。适合于分析非极性和中性化合物，极性化合物可能在色谱柱上产生不可逆的吸附。②.分析结果重复性差，柱稳定性不好。③.样品组分吸附在吸附剂的活性部位有变质和损失的可能。这种方法在农药残留分析上应用的相对较少。 ⑵. 液液分配色谱法 流动相和固定相都是液体的液相色谱法。利用样品组分在互不相溶的两种液相中分配系数的不同得以实现分离和分析。流动相和固定相为两种互不相溶的液体，两者之间有一个明显的分界面，流动相流过色谱柱时，很大面积上与固定相接触，流动相中的样品组分在两相之间很快进行平衡分配，由于它们在两相之间相对溶解度的差异，会以不同速度流经色谱柱，从而得到分离。 液液色谱的特点：①.可使用多种溶剂，固定液抗冲刷能力强，不需要预饱和，再现性能非常稳定。②.分离适用性广，从非极性化合物到极性化合物，都可以作其分离对象。③.为改善分离度可以进行梯度洗脱，能做高精度定量分析。基于这些特点，液液分配色谱法广泛地用于各种样品中农药残留量的分析测定。 ⑶. 离子交换色谱法 根据离子交换的原理进行分离的液相色谱法。基于作为固定相的离子交换剂（薄膜型离子交换树脂和离子交换键合固定相）上可电离的离子，与流动相中具有相同电荷的溶质离子进行可逆交换，依样品中不同组分的离子对交换剂具有不同的亲合力而将其分离。 离子交换色谱法固定相，主要有以下类型：①.微粒树脂型。②.表面多孔壁。③.硅胶键合相多孔微粒。硅胶骨架上引入各种离子基团，或涂渍键合有机离子交换剂。流动相多采用在水溶液中含有一定离子强度的缓冲液，或与水混溶的有机溶剂。如：甲醇，乙醇，乙腈，二氧六环等。 离子交换色谱法特点：①.少数农药品种可以在水溶液中离子化，可以采用电导检测器测定。②.除离子交换外，还可能有吸附和分配作用。 ⑷. 空间排阻色谱法 依据分子大小、形状而分离的液相色谱法。用化学惰性的具有网状结构的多孔性物质作固定相，试样组分按分子大小构型进行分离，其作用近似于分子筛效应：试样进入色谱柱后，随流动相在凝胶外部间隙及凝胶孔穴旁流过，体积大的分子不能渗透到凝胶缝隙里去，而较早地被淋洗出来；中等体积分子产生部分渗透作用；小分子可以渗透到孔穴里去，因此较晚被冲洗出来，从而达到分离的目的。水或水溶液作流动相的凝胶色谱称为凝胶过滤色谱；有机溶剂作流动相的凝胶色谱称为凝胶渗透色谱。 凝胶色谱固定相有3种类型：①.软性凝胶，如网状交联多聚葡萄糖等。②.半刚性凝胶，如交联聚苯乙烯等。③.刚性凝胶，如多孔硅胶等。流动相为水、缓冲盐溶液、乙醇、四氢呋喃、甲苯、间甲苯酚、N,N–二甲基甲酰胺等。 凝胶色谱法特点：①.非离子型的高分子化合物，样品分子量差别愈大愈易分离。②.可测聚合物的分子量分布。③.是一种最稳定的分离手段，不会引起样品变质和损失。 3. 基本流程 高效液相色谱仪由输液系统、进样系统、分离系统、检测系统、控制和数据处理系统组成，其流程如图4-17。 ⑴. 输液系统 一般由贮液器及脱气装置、高压输液泵、梯度洗脱装置构成，其功能是给分离系统提供稳定的能将混合组分分离的高压液体。 ①. 贮液器 贮液器一般是玻璃或聚四氟乙烯衬里的塑料容器，容积0.5~2L。有时也用普通的500mL溶剂瓶。流动相中会溶解空气（水更明显）含有的微粒杂质，因此流动相在转入贮液器前必须过滤和脱气。制备好的流动相先过滤后脱气，过滤器采用全玻璃系统，用0.45(m水系或有机系的微孔滤膜进行过滤。置于贮液器底部的输液导管，需要安装孔径10(m的不锈钢质或铝质或聚四氟乙烯材料的过滤头，该过滤头要定期清洗，特别是在水中的那只，使之保持通畅。流动相脱气是非常重要的，因为流动相中溶解的空气在低压部件，如检测器里会逸出气泡来，气泡的出现会使检测器的噪声加大。若气泡吸入高压泵液缸，会导致压力不稳或停工。 脱气有在线和离线两种处理方式。某些商品化贮液器配备有流动相在线脱气装置，如图4-18，装有加热器，温度调节器和磁力搅拌器。 离线脱气常用方法有：A. 真空脱气法，是应用微型真空泵进行脱气。即在充装流动相的密闭容器中抽真空使溶解气体从流动相中逸出而除去。该方法不适合混合好的流动相脱气，因为长时间的抽真空脱气会改变流动相的配比。B. 超声波脱气法，将贮液器超声波振荡5~10min达到脱气的目的。有资料报道，将上述两种方法联合使用脱气效果最佳。C. 吹气脱气法，向流动相中吹入氦气，把溶解在流动相中的空气带出。该方法国内采用较少，主要原因是氦气难得，成本高。为防止某种溶剂被氧化，有时可在贮液器液面上加正压充氮气或氦气保护。加正压也有利于流动相进入高压泵液缸。 ②. 高压输液泵 由于高效液相色谱柱中填料颗粒较细，通常为5~10(m，而且致密。这样通过柱子的流动相会受到很大的阻力，为缩短分析时间，必须使用高压泵，向色谱柱提供流量稳定、重现性好的流动相。对高压输液泵的要求如下： A. 流量稳定，输出的流动相脉冲小，流量精度和重复性优于0.3%。 B. 流量范围宽，分析型为0.1~10mL/min范围内连续可调，容易调节。适应微柱，有的高压泵最小体积流量为0.01mL/min。制备型色谱仪所用高压输液泵最大流速可达100mL/min。 C. 输出压力高，密封性能好。最高输出压力可达40~50MPa。 D. 泵液缸体积小，方便更换流动相，减少系统平衡时间。 E. 耐腐蚀性好。多用不锈钢、聚四氟乙烯材料制造，也有用精密陶瓷的。泵的活塞多采用石英杆，单向阀通常是用红宝石或蓝宝石做成。 F. 具有等梯度和梯度洗脱功能，噪声低且具有安全过压保护装置。 G. 易于维护和维修。 商品高压输液泵有恒流、恒压两种类型。恒流泵使输出的液体流量稳定；而恒压泵使输出的液体压力稳定。恒流泵有往复式柱塞泵、注射泵；恒压泵有气动放大泵。在色谱实际分析操作中，柱系统的阻力由于某些原因可能有所变化，因此恒流泵比恒压泵更优越。在目前高效液相色谱仪上采用最多的是往复柱塞泵（见图4-19）。工作时电动机带动偏心轮转动，偏心轮驱动活塞在液缸内往复运动。柱塞向后运动时，液缸内形成真空，这时出口单向阀关闭，流动相在大气压力或正压下自入口单向阀进入液缸。柱塞向前运动时，单向阀动作反向，达到一定压力时，流动相自出口单向阀压出到色谱柱。如此循环往复，使流动相连续进入色谱柱。当柱塞往复运动加快时，提供的流速加大，反之就小。因为在泵处于吸液冲程时没有输出，流动相流量的脉动将使仪器无法正常工作，所以多采用双柱塞和加脉动阻尼器来减少脉动。增加柱塞，脉动减小，流量更平稳，但泵成本高、故障率高。若想让柱塞泵正常工作，一个很重要的条件就是液缸内不能进入气泡或进入后及时排出。柱塞密封垫是易损件，当泵漏液时必须更换。 过去压力表示单位比较多，我国目前采用的 标准 excel标准偏差excel标准偏差函数exl标准差函数国标检验抽样标准表免费下载红头文件格式标准下载 压力单位为帕Pa，与各种常见的其它压力单位换算见表4-7。 表4-7 压力换算表 MPa(兆帕) (N/m2) PSI(磅/英寸2) (b/in2) 标准大气压 （atm） 毫米汞柱(托Torr) (0℃,mmHg) 巴 (bar) 公斤力/厘米3 (kgf/cm3) 1 145.038 9.869 7500.62 10 10.197 ③. 梯度洗脱装置 所谓的梯度洗脱，就是将两种或两种以上的不同极性的溶剂进行混合，作为流动相使用。在进样过程中，连续不断地按预先拟定的程序改变流动相的浓度和极性。由于流动相极性发生变化，使得选择性得以改善，从而提高了分辨能力，缩短了分离时间。常用的梯度洗脱有低压洗脱、高压洗脱。高压梯度装置是用高压泵分别将两种或三种不同极性的溶剂输入混合器，充分混合后进入色谱柱。典型的高压梯度洗脱程序见表4-8。从图4-20可以看出，多元低压梯度洗脱只需要一个高压泵，而多元高压梯度洗脱就需要多个高压泵。 表4-8 典型的高压梯度洗脱程序 时间(min) 流速（mL/min） 流动相Ａ泵(%) 流动相Ｂ泵(%) 初始 1.0 10 90 5.0 50 50 15.0 80 20 初始化平衡10 10 90 ⑵. 进样系统 通常由手动六通进样阀或自动进样器组成。通过进样系统可以实现取样、进样两个目的。进样就是将待分析的样品送入色谱柱的一种装置（见图4-21）。对进样系统的要求是：进样重复性好，进样时对分离系统的压力、流量影响小；样品在进样阀处不得因漏出、吸附，渗透而损失；取样时不能将气泡带入定量管。液相色谱法进样难度较大，主要原因是系统处于高压状态。在液相色谱法中，有三种进样技术，一是直接注射器进样，二是停流进样，三是阀进样。前两种技术由于压力过高或对分离有影响已经很少采用。目前把样品引入色谱柱中主要是通过六通进样阀。进样阀内装有定量管，样品溶液在常压下靠进样器注入定量管，并把管中的流动相顶出，再转动阀门，在保持高压不停状态下，将处于常压状态下的样品送入高压流路系统(图4-22)。进入分离系统的准确样品量控制有两种方式，可选其中一种。一种是利用定量管切入（10(L，20(L，50(L，100(L），另一种是通过进样器。当采用定量管时，通常需要注入5~10倍定量管体积的样品量，保证阀体中的流动相被驱赶彻底。当采用进样器定量时，定量管的体积要比进样量大。定量管的体积不宜过大，否则系统每次进样时压力波动较大。 手动进样阀通常有美国Rheodyne公司生产的7125型、7125i型、9725型、9725i型进样阀。7125型的阀体为不锈钢材料制成，9725型的为PEEK材料制成，适于离子色谱分析时使用。i表示这种进样阀具有触发同步信号线。每进样一次，自动启动记录仪。还有一种电动进样阀，由电动机控制装样状态，每次进样完毕，当样品进入分析柱一定时间后，电动机自动将阀置于装样状态。在实际分析中，还可以使用十通阀，在线给两个柱子进样。 现在生产的高效液相色谱仪都可以选配自动进样器装置。自动进样器在程序控制器或计算机控制下可自动完成取样、进样、清洗等一系列操作，使用者只需事先编好程序，将处理好的样品按顺序装入贮样装置即可。自动进样器的优点是可以节约使用者的有效时间，这一点在梯度洗脱、多残留分析或方法建立时非常有用；缺点是价格昂贵，故障率高，维修困难，样品瓶需要严格的清洗程序。 ⑶. 分离系统 包括保护柱（图4-23）、分析柱（图4-24）及柱恒温箱。该系统是色谱仪的核心部位。保护柱起到保护分析柱的作用，固体微粒、污染物首先被保护柱挡住。保护柱可以定期清洗或弃掉。当发现有鬼峰或分离度下降时，首先应考虑保护柱是否被污染。保护柱和分析柱要配套使用，才能真正起到保护作用，即氨基分析柱就要用氨基保护柱。分析柱又是核心的核心，起到对进入色谱系统混合组分分离的作用，即混合组分从分析柱入口刚进去时，各组分都站在同一条起跑线上，经分离后，从柱尾端出来时，它们就拉开了距离，逐一进入检测系统。 ⑷. 检测系统 一般由独立的检测器或附属部件构成，其功能是将物理或化学特性转变为可处理的电信号。 ⑸. 控制和数据处理系统 该系统一般由控制硬件、软件，数据处理软件包、计算机组成。现代高效液相色谱仪都通过计算机来控制或进行数据处理。除标准化的要求以外，不同的生产厂家开发出各自的软件，如WATERS公司的Millennium工作站等。 4.2.2 流动相和固定相 1. 流动相 流动相是影响分离的一个重要调节因素。一种理想的液相色谱流动相溶剂应具有低粘度，检测器兼容性好，样品容易回收和低毒等特性。 正相高效液相色谱法流动相常以己烷做基础溶剂。当洗脱极性较强的组分时，通常用二氯甲烷、四氢呋喃来调节极性。 反相高效液相色谱法采用的流动相多为甲醇、乙腈配合水。一般情况下甲醇–水体系能够满足多数样品的分离要求，但乙腈在农药残留分析中也是极为重要的洗脱剂。乙腈的特性是粘度低、样品峰形好，可在较低波长下使用，但乙腈的价格较甲醇贵。反相高效液相色谱法溶剂强度图见4-25。 离子色谱淋洗液主要是缓冲溶液。分析阴离子时用NaCO3/NaHCO3缓冲溶液；分析阳离子用甲烷磺酸溶液。 现在国内市场上也能购买到HPLC级的溶剂。对一些不符合要求的溶剂也可以在实验室进行处理制备。流动相中许多溶剂都有一定毒性，在分析过程中，要注意采取预防 措施 《全国民用建筑工程设计技术措施》规划•建筑•景观全国民用建筑工程设计技术措施》规划•建筑•景观软件质量保证措施下载工地伤害及预防措施下载关于贯彻落实的具体措施 ，譬如通风。 对常用流动相的要求： 水 水是反相高效液相色谱法最重要的溶剂，它也是最难纯化和保持其特性的流动相之一。水的纯度至关重要，特别是在痕量分析，检测器处于高灵敏度状态时。长时间使用纯度满足不了要求的水，有时会出鬼峰。水的纯化可以采用蒸馏、离子交换等方法。水中有机物可以用高锰酸钾或通过一根C18柱去除。水中容易滋生微生物，一定要用新鲜的，最好每天换水，更换时间最长也不要超过7天。电蒸馏水或去离子水必须至少在全玻璃系统下重蒸馏一次才能上机使用。可以采用下列程序检验水的纯度：首先泵100mL水通过C18柱，然后跑一个线性梯度洗脱，流速1mL/min，10min流动相甲醇从0升到100%，保持15min，通过一个在线紫外检测器测定。要求在0.08AUFS档位基线漂移小于10%，几乎不出峰，即使出峰其峰高也小于满刻度值3~5%。 在使用电化学或其他高灵敏度检测器时，二次蒸馏设备需要采用全石英玻璃系统。 乙腈 反相高效液相色谱常用的溶剂，实验室常用的只能满足紫外检测器的需要。这样的试剂很难符合荧光和电化学检测器的要求。 甲醇 反相高效液相色谱常用的溶剂之一，其杂质主要是水。市面上能够买到紫外光谱纯的商品，但它的主要问题也是有些特性满足不了荧光和电化学检测分析。 氯代烃类溶剂 在正相高效液相色谱中常用的二氯甲烷等氯代烃类溶剂中，添加稳定剂甲醇或乙醇。乙醇能够提高流动相的极性，缩短正相高效液相色谱分析中各组分的保留时间。各批次之间浓度的变化也许会影响重复性。国内市场上可能不容易买到不含稳定剂的氯代烃类溶剂，但是可以用氧化铝柱吸附的办法或者用水提取脱掉。不含稳定剂的氯代烃类溶剂可以缓慢的分解，特别是与其他溶剂共存时。分解的盐酸会腐蚀不锈钢部件，损害色谱柱。以戊烯为稳定剂的氯代烃类溶剂可避免上述产生的问题。 醚类溶剂 这类溶剂中常添加稳定剂防止其氧化，如四氢呋喃中加有对苯二酚。这种稳定剂有紫外吸收，干扰紫外检测。可以采用在蒸馏中加入氢氧化钾去除。另外，这类溶剂中的氧化物可用氧化铝柱吸附净化。 2．固定相 液相色谱固定相按化学组成分类可分为微粒硅胶、高分子微球和微粒多孔碳等主要类型；按结构和形状分为薄壳型和全孔型，无定型和球型；按填料表面改性与否可分为吸附型和化学键合型；也可以按洗脱模式分成吸附、液液键合、离子交换和凝胶渗透4类。常用的微粒型吸附剂见表4-9。 在高效液相色谱填料的发展过程中曾使用过大颗粒全多孔硅胶，表面多孔硅胶即薄壳型填料（( 30(m）、小颗粒全多孔硅胶（( 3~10(m）见图4-26。现在广泛采用的是小颗粒全多孔硅胶材料。 载体的要求是孔容大（＞1mL/g），比表面积大（＞200m2/g），孔径在8~15nm。对固定液的要求是粘度不宜太高。低粘度的固定液扩散系数大，反应速度快，柱效高。同时还要求选用对紫外光不敏感的固定液。 硅胶的结构见图4-27。一般认为，微酸性的硅醇基官能团在分离中起着重要作用，而硅氧烷键只有很少影响或没有影响。硅醇基官能团本身具有不同程度的酸性。在相邻硅原子上的酸性最强的羟基由于形成分子内氢键而常常引起如化学吸附、色谱峰拖尾的效应。为了减少这一影响，通常采用化学键合固定相。 表4-9 HPLC中常用的微粒型吸附剂 商 品 名 称 粒度 ((m) 比表面积(m2/g) 孔径 (mm) 形状 生 产 厂 家 氧化铝 LiChrosorb Alox-7 5,10 7~90 15 非球 E.Merek Spherisorb-A 1,10,20 95 15 球 Phase separations 硅胶 YWG 5,7,10 300 6~8 非球 青岛海洋化工厂 YQG 5 400 8 球 青岛海洋化工厂 GYQG 3,5 300 10 球 北京化学试剂所 Hypersil 3,5,10 170 10 球 Hypersil Lichrosorb SI 60 5,10,20 500 6 非球 E.Merek Lichrosorb SI 100 5,20,20 300 10 非球 E.Merek Lichrosphere SI 100 3,5,10 250 10 球 E.Merek Nucleosil 3,5,10 300,500 50,100 球 Macherey-Nagel Partisil 5,10,20 400 6 非球 Whatman (-Porasil 10 300 10 非球 Waters Spherisorb-S 5,10,20 220 8 球 Phase separations Ulerasphere 5 球 Alltech Vydac TP-101 10 100 33 球 Separations Group Zorbax-sil 6~8 300 60 球 Du Pont 液液分配色谱的固定相通常由载体（一般为硅胶）和固定液两部分组成。液固吸附色谱只有载体，载体外部不涂渍或键合固定液。离子色谱的固定相通常为离子交换树脂。 在液液分配色谱法上，现已广泛采用化学键合固定相。高效液相色谱法常见的化学键合固定相见表4-10。它是借助于化学反应的方法将有机分子以共价键连接在色谱载体上。化学键合固定相突出的优点是耐流动相冲洗，热稳定性好，在很大程度上减弱了固定相表面的活性位点。反相高效液相色谱中广泛使用的固定相是C18又称ODS，即十八烷基的英文缩写。C8也是常用的一种，它更适于分析极性大一点的农药品种。 表4-10 HPLC常用的化学键合固定相及性质 类型 牌 号 名 称 官能团 粒度((m) 形状 简要说明 极性键合固定相 弱极性 Nucleosil-NMe2 二甲胺基 6,10 球形 也可做弱阴离子交换 LiChrosorb DIOL 二醇基 10 非球形 分离酸、酚 Fe-Sil-X-1 氟乙基 13±5 非球形 羰基化合物分析 中强极性 YWG-GN 腈基 10 非球形 8%C (-Bondapak CN 腈基 10 非球形 9%覆盖量 Partisil ODS 腈基、氨基 10 非球形 氨基/腈基=2/1，70℃稳定 Partisil ODS2 硝基 5,10 球形 球形 用于有双键亲和力的样品分析 Zorbax ODX 腈基 10 强极性 (-Bondapak C18 氨基 10 非球形 有（20~30）(m制备柱填料 LiChrosorb RP-18 氨基 5,10 非球形 用于糖类和肽分析 Supelcosil LC-18 氨基 10 非球形 9%覆盖量 Nucleosil C18 氨基 5,10 球形 也可用于反相 非极性键合固定相 长键 YWG-C18H37 C18硅烷 10 非球形 有（20~30）(m制备柱填料 YQG- C18 C18硅烷 5 球形 一氯硅烷键合，15%C MicroPak CH C18硅烷 10 非球形 聚合层，22%C Panisil ODS C18硅烷 5,10 非球形 5%C Partisil ODS2 C18硅烷 5,10 非球形 16%C,单分子层，未封底 Zorbax ODS C18硅烷 6 球形 15%C，散装填料8(m (-Bondapak C18 C18硅烷 10 非球形 10%C LiChrosorb RP-18 C18硅烷 5,10 非球形 22%C，部分聚合，pH=1~9 Supelcosil LC-18 C18硅烷 5 球形 11%C，HMDS封尾 Nucleosil C18 C18硅烷 5,10 球形 15%C 短键 LiChrosorb RP-8 C8硅烷 5,10 非球形 13%~14%C pH=1~9 Nucleosil C8 C8硅烷 5,10 球形 15%C Zorbax C8 C8硅烷 6 球形 15%C YWG-C6H5 苯基硅烷 10 非球形 7%C (-Bondapak Pheny1 C8硅烷 10 非球形 16%C Lichrosorb RP-2 二甲基硅烷 5,10 非球形 5%C （续前表） 离子交换键合固定相 阳离子 YWG-SO3H 磺酸基 10 非球形 Partisil 10 SCX 磺酸基 10 非球形 pH=1.5~7.5 LiChrosorb KAT 磺酸基 5,10 非球形 孔径10nm Zorbax SCX 磺酸基 7 球形 pH=2~9 阴离子 YWG-R4NCl 季铵离子 10 非球形 LiChrosorb AN 季铵离子 5,10 非球形 孔径10nm Nucleosil SB 季铵离子 5,10 球形 pH=1~9 Vydac 301 TP 季铵离子 10 球形 pH=1~9 常见的正相键合固定相有4种类型： ⑴. 形成硅-氧-碳键的固定相 ⑵. 形成硅-碳键的固定相 ⑶. 形成硅-氧-硅-碳键的固定相 ⑷. 形成硅-氮-碳键的固定相 在硅胶上的反相键合固定相类型如： 4.2.3 色谱柱 高效液相色谱法使用的色谱柱通常为优质不锈钢制成，内径均匀，抛光，无轴向沟槽。在离子色谱仪上或要求较宽pH值范围使用的色谱柱也可以用塑料材质制成如PEEK，但是这种柱子不耐压，不锈钢柱可耐压80MPa。不锈钢色谱柱的内部结构见图4-28。常用的分析型色谱柱内径4.6cm，长度为20~25cm，在建立分析方法时可以考虑使用短柱，如果需要特别高的分离度，可以使用长柱。填料粒度通常为3~10(m。填料5(m的色谱柱通常兼顾柱效、重现性、可靠性，效果最好。3(m的色谱柱通常可以实现快速分析，但粒度太细易堵塞。普通实验室无法填充高效液相色谱柱，有好的柱填料还必须具备填充设备才能生产出高效能的色谱柱。常见的商品牌号色谱柱见表4-11。 表4-11 常见的商品牌号色谱柱 分离类型 填料 规格（柱长/内径，mm） 正相柱 Hypersil CN(CPS-1),5(m 250×4.6 Hypersil NH2(APS-1),5(m 250×4.6 Zorbax NH2 ,5(m 250×4.6 反相柱 Hypersil ODS-2(C18),5(m 250×4.6 Hypersil C18–BDS,3(m 150×4.6 Inertsil CN-3,5(m 250×4.6 Kromasil C18,5(m 250×4.6 Lichrospher C18,5(m 200×4.6 4.2.4 检测器 在液相色谱检测器的发展过程中，出现过40多种检测器，目前广泛应用约十几种，在农药残留分析上应用的主要有紫外—可见光检测器、二极管阵列检测器、荧光检测器、电化学检测器、质谱检测器和目前极具应用潜力的蒸发光散射检测器。 1. 检测器的分类 高效液相色谱仪的检测器按其性质、应用范围、测量原理等可以有多种分类方法。但是，目前认为可分为两大类，通用型检测器和专用型检测器。 ⑴. 通用型检测器 也称为总体性能检测器。它可连续测量色谱柱流出物（包括流动相和待测物）的全部特性变化，通常采用差分法测量。这类检测器如电导检测器、示差折光检测器。通用型检测器适用范围广，但由于对流动相有响应，易受温度、流速和流动相组成变化的影响，通常灵敏度低且不能用于梯度洗脱。 ⑵. 专用型检测器 也称为溶质性能检测器。它可测量被分离样品某种组分特性的变化。这类检测器对样品中组分的某种物理或化学性质敏感，而这类性质流动相不具备或在操作条件不显示。这类检测器包括紫外检测器、荧光检测器等。 2. 检测器的性能指标 高效液相色谱使用的检测器对噪声、漂移、灵敏度、检测限、线性范围和响应有一些基本的要求，有关知识可参见本章第一节相关 内容 财务内部控制制度的内容财务内部控制制度的内容人员招聘与配置的内容项目成本控制的内容消防安全演练内容 。表4-12列出了几种常见高效液相色谱检测器的性能。 3. 常用检测器 ⑴. 紫外–可见光检测器 紫外检测器(ultraviolet-visible detector，UV–VIS)是液相色谱仪应用最广泛的检测器，为高效液相色谱仪的基本配置，在各种检测器中其使用率高达70%左右，对物质总数的80%有紫外吸收的均有响应，既可测190~350nm光谱范围的紫外光吸收变化，又可向350~900nm光谱范围延伸。在目前报道的高效液相色谱法测定农药残留分析的文献中，约有90%是采用紫外检测器。紫外检测器主要有以下特点：灵敏度高，可达0.001AUFS；噪声低，可降至10-5AU；对中等强度紫外吸收的农药，最小检出量可达10-11g，最低检出浓度可达10-10g/mL；对流动相组成的变化或温度变化不敏感，适于梯度洗脱；对无紫外吸收的物质无响应或响应很小，容易选用在检测波长下无紫外吸收的流动相，如甲醇和水等；它为非破坏性检测器，可用于制备色谱或与其它检测器联用，结构简单，操作方便，便于维修。 表4-12 液相色谱检测器性能一览表 规 格 紫外（UV） 荧光（FLD） 电化学（ECh） 蒸发光散射（ELSD） 类型 专用 专用 通用 通用 梯度洗脱 能 能 不能 能 线性范围 104 105 105 106 最小检出量(g) 10-11 10-14 10-8 10-9 对流速敏感性 无 无 有 无 对温度敏感性 低 低 2% 低 信号单位 吸光度，A 荧光度 电导率，(s/cm 光散射 ①. 工作原理 紫外检测器工作原理基于朗伯–比尔定律。该定律指出，当一束平行单色光辐射通过物质溶液时，如果溶剂不吸收光，则溶液的吸光度与吸光物质的浓度和光经过溶液的距离成正比，见式4-24。 ………………………………………（4.24） 式中A为吸光度，I0为入射光强度，I为透射光度，ε为样品的摩尔吸光系数，b为光程长，c为样品的浓度。 待测农药对紫外光吸收的特性取决于农药的分子结构，当分子结构中存在生色团、助色团就会对紫外光产生吸收，吸收的本质是某一特定波长的光量子能量等于农药分子外层电子从基态跃迁至激发态轨道的能量，满足这一条件时才能产生吸收几率。摩尔吸光系数大的农药测定起来通常较为灵敏。在选择检测波长时，通常要选择该农药分子的最大吸收波长，有时也综合考虑流动相、杂质的影响。用接近最大波长来检测通常会降低方法的最低检出浓度，有时也影响线性关系。 ②. 结构 紫外检测器由光源、分光系统、流通池和检测系统四大部分组成。从光源和分光系统得到朗伯-比耳定律中要求的单色光，单色光通过测量池时，一部分光被待测农药分子吸收，剩余的透射光到达检测系统的光电倍增管，由它将光信号转换为电信号，再经过电子电路放大，最后得到与待测农药浓度成正比的仪器输出信号并记录下来进行处理。 紫外检测器按光路可分为单光路和双光路两种。单光路紫外检测器由于缺少补偿电路，稳定性差，现在很少使用。双光路检测器包括检测（样品）光路，参比（多为空气）光路两部分构成。常见的结构类型见图4-29。 紫外检测器按波长来分，有固定波长（多为254nm）和可变波长两类，第一类已经很少被应用于农药残留分析，原因是对许多农药来说，最大吸收波长不一定都是254nm。 紫外检测器的光源通常由氘灯和钨灯组成。氘灯提供紫外光源，它发出的波长最低可达到165nm。常规氘灯的使用波长范围在195~400nm之间；可见光源由钨灯提供，波长范围是400~850nm之间。在停泵全波长扫描时，氘灯与钨灯之间有一个灯切换过程的程序。紫外检测器也有用氙灯单独提供全波长190~700nm光源的检测器。 分光系统包括聚光镜、狭缝机构和单色器。可变波长检测器采用光栅做单色器。光栅单色器的优点是固定的狭缝宽度可以产生几乎恒定的带宽，色散均匀，呈线性，与波长无关。 ③. 使用及 注意事项 软件开发合同注意事项软件销售合同注意事项电梯维保合同注意事项软件销售合同注意事项员工离职注意事项 在农药残留分析过程中，在保证基线噪声允许的情况下，尽可能地提高灵敏度。在多残留分析时，为了使各组分峰都获得最灵敏的检测，有些紫外检测器可以对波长编程控制。在日常分析工作结束后，要用甲醇或乙腈彻底清洗色谱柱和检测室30min以上，防止有些组分在检测器测量池中沉积，造成流动相回路部分堵塞，从而影响检测工作。在双波长紫外检测器上可检测两个通道的能量，如果两者相差较大，说明测量池可能被堵塞和污染，这时就需要进行清洗。当测量池中有气泡时，吸光度值会不停的变化，这时可以用胶塞瞬间堵住流动相出口，产生一个压力松开后即可将气泡带出。在实际分析工作中要严防检测器出口堵塞，导致压力过高，石英测量池爆裂。 ⑵．二极管阵列检测器 二极管阵列检测器(diode array detector，DAD)的成功开发是高效液相色谱技术的重要进展。1975年Talmi首次报道，1982年第一台商品DAD检测器问世。色散型紫外检测器只能测定某一波长时吸光度与时间关系曲线，即只能做二维图谱。二极管阵列检测器可以获得吸光度、时间、波长的三维光谱色谱图（图4-30），可以做出任意时间下的吸光度–波长曲线。这一功能可以对农药标准物质的纯度进行检验。早期的二极管阵列检测器灵敏度偏低，光谱分辨率远低于色散型紫外检测器。现在的高分辨率DAD几乎可以和色散型紫外检测器相媲美。光电二极管数目也从35支上升到1024支，光学系统也有了质的飞跃。 工作原理和结构 主要特点是用光电二极管阵列同时接受来自流通池的全光谱透过光。为实现这一功能，它在光路结构上与色散型紫外检测器有重要区别。光电二极管阵列检测器是令光线先通过样品流通池，然后由一系列分光技术，使所有波长的光在接收器上同时被检测。二极管阵列检测器的结构如图4-31，氘灯光源连续发光， 经过消色差透镜系统聚焦在测量池内，然后透过光束经聚焦后通过入射狭缝进入多色仪。在多色仪中，透过光束在全息光栅的表面色散，并投射在二极管阵列元件上。多色仪能操作其聚焦面与接受器吻合，阵列上的各个元件同时收到不同波长的光波。 ⑶．荧光检测器 ①. 工作原理 许多化合物有光致发光现象，荧光属于其中的一种。化合物受到入射光的照射后，吸收辐射能，发出比吸收波长长的特征辐射，当入射光停止照射时，特征辐射也很快消失，这种辐射光线就是荧光。荧光产生的实质是原子中电子由最低振动能级下降到基态中的某些不同能级的能量释放。被化合物吸收的光称为激发光，产生的荧光称为发射光。荧光的波长总要比分子吸收的紫外光波长长，这种光一般是可见光。对于稀溶液，荧光强度与荧光物质溶液浓度、摩尔吸光系数、吸收池厚度、入射光强度、荧光量子效率及荧光收集效率等成正相关，在相对条件下，物质的荧光强度与该物质溶液浓度成正比，这是荧光检测器的定量依据。 ②. 结构 荧光检测器(fluorescence detector，FLD)包括以下基本部件：激发光源；选择激发波长用的单色器；流通池；选择发射波长用的单色器及用于检测发光强度的光电检测器（见图4-32）。 由氙灯光源发出的光，经激发光单色器后，得到所需要的激发光波长。激发光通过样品流通池，一部分光线被荧光物质吸收。荧光物质激发后，向四面八方发射荧光。为消除入射光与散射光的影响，一般要取与激发光成直角的方向测量荧光。近年来，还出现一种激光诱导荧光检测器，其主要区别是光源采用了激光器。 ③. 使用注意事项 荧光检测器的最大特点是灵敏度极高，比紫外检测器约高2个数量级，最小检出量可达10-14g。它具有良好的选择性，能够避免不发荧光的成分干扰。线性范围虽不如紫外检测器，但也可达到104~105。尽管可采用柱后衍生的方法去测定那些具有潜在荧光的农药，但还是分析对象范围相对较窄。 流通池容易被污染，必要时可以用铬酸洗液浸泡过夜。 并不是所有的农药都能产生荧光。常用于荧光检测器检测的农药品种有苯并咪唑类农药如甲基硫菌灵等。对草甘膦可采用柱前衍生的方法进行测定。甲基吡恶磷、多菌灵、涕必灵都可以用荧光检测器测定。 ⑷. 电化学检测器 ①.工作原理 电化学检测器(electrochemical detector，ECh)是根据电化学原理和物质的电化学性质进行检测的。在液相色谱中对那些没有紫外吸收或不能发出荧光但具有电活性的农药，可采用电化学检测法。电化学检测器在农药残留分析上主要有安培检测器和电导检测器。前者是以测量电解电流的大小为基础，后者则以测量液体的电阻变化为根据。 ②.安培检测器(amperometric detector，AMD) 电化学检测器中应用最广泛的一种检测器。它要求在电解池中发生电解反应，即在外加电压的作用下，利用待测农药在电极表面上发生氧化还原反应引起电流的变化而进行测定的一种方法。工作电极是安培检测器的心脏，通常用玻璃碳材料制成，参比电极一般为Ag/AgCl电极，辅助电极为不锈钢或金、白金材料（见图4-33）。 ③.电导检测器(conductive detector，CD)与安培检测器不同，电导检测池内没有电化学反应发生，样品的浓度是通过测量溶液中离子的电导变化获得的。电导检测器的结构见图4-34。电导检测器主要是用于离子分析，在农药残留分析上只有少数几个品种。该检测器在实际使用中对水、淋洗液有较严格的要求，离子分析时一般整个流路系统都用PEEK材料，避免不锈钢材料对淋洗液产生影响或淋洗液对不锈钢材料的腐蚀。电导池在使用前后发现有污染时，可用1:1硝酸溶液处理数分钟，以消除污染。在分析过程中，要注意温度对电导率的影响，一般每升高1℃，电导率会增加2~2.5%。 安培检测器已经用于乙撑硫脲ETU的检测，最低检出浓度可达0.01~0.02mg/kg。三乙膦酸铝也可以用电导检测器测定其在植物源样品中的残留量。 ⑸. 质谱检测器(mass spectrometric detector，MSD) 质谱仪作为高效液相色谱仪的检测器是农药残留分析领域的热点，有关详细情况可参阅本章4.4。 ⑹. 光电导检测器 光电导检测器(photoconductivity detector，PCD)是利用某些化合物受强烈紫外光照射引起光电离形成离子的现象，在电导池中检测。这种检测器对卤代物和许多含硫和氮的光敏化合物有选择性响应。光电导检测器对某些化合物的灵敏度比紫外检测器还高。 ⑺. 蒸发光散射检测器 1985年世界上第一台蒸发光散射检测器(evaporative light-scatter detector，ELSD)问世，它标志着高效液相色谱仪高灵敏度、通用型质量检测器的诞生。蒸发光散射检测器对紫外检测器不能检测的化合物如碳水化合物、醇类、磷脂类、脂肪酸、表面活性剂、萜烯酸酯等梯度分析中显示出非常大的优势。最近，美国EPA报道了用蒸发光散射检测器测定磷脂类Lyso-PE植物生长调节剂在番茄、黄瓜等蔬菜上的残留量。随着低温蒸发光散射检测器（ELSD–LT）的出现，它在农药残留分析领域会有更多的应用。 ①. 工作原理 当一束光线通过一间充满烟雾的房间就会发生光散射现象。在一定的角度测得的光散射强度与烟雾粒子大小和数量成正比，这就是蒸发光散射检测器定量分析的原理。理论上讲它可以检测挥发性低于流动相的所有化合物。经色谱柱分离的组分随流动相进入雾化器中，利用高速气流喷成一薄雾，雾化为微小液滴的流动相进入加热的蒸发器(漂移管)蒸发，不挥发的目标化合物微粒化后进入光路发生光散射，散射光被光电倍增管捕获检测。 ②. 结构 蒸发光散射检测器由柱流出物雾化部件、流动相蒸发部件、目标化合物检测系统三部分组成(见图4-35、表4-13)。开始设计采用不分流的技术，基线噪声大，不能检测半挥发性化合物。现已广泛使用分流技术，对雾化器和蒸发管改进后，蒸发光散射检测器也可在低温下工作， 这样对检测热不稳定的化合物更有效。一般的蒸发光散射检测器蒸发时需要高温，高温时容易产生基线稳定性和操作性上的问题。低温蒸发光散射检测器（ELSD–LT）克服了这些问题，在40℃左右的低温下也可正常工作，即使100%水的流动相在32℃低温下也可稳定蒸发。 表4-13 3种蒸发光散射检测器 Alitech 500 Sedex 55 Ddl 31 光源 激光 卤素灯 卤素灯 检测器 光电二极管 光电倍增管 光电倍增管 蒸发温度℃ 室温~140 室温~100 室温~180 流动相(水相)mL/min 0~1 0~5 0~4 气体消耗量L/min 2.5~5 3 5~6 检测限 (ng 5 0.1 1 ③. 使用及注意事项 该检测器可以用于梯度洗脱，与各个厂家生产的高效液相色谱仪联接方便。在实际工作中，操作只涉及到两个参数，即雾化载气流压力和蒸发器温度。雾化载气流压力影响雾化器中液滴的形成，导致对检测器的影响，信噪比随压力升高而升高。蒸发器温度对检测器响应的影响也是随温度升高而加大。流动相蒸发趋向完全，信噪比上升。不同的流动相有不同的设定温度。常用的流动相蒸发温度见表4-14。蒸发光散射检测器工作时必需备有氮气发生器，空气压缩机等供气源，而且必须在装有排风设备的屋内使用。 表4-14 蒸发器温度设定 流动相 沸点℃ 蒸发器温度℃ 流动相 沸点℃ 蒸发器温度℃ 正己烷 69 93 乙腈 82 130 异辛烷 99 130 异丙醇 82 110 氯仿 61 108 乙醇 78 105 二氯甲烷 40 75 甲醇 65 120 四氢呋喃 66 95 水 100 150 丙酮 56 90 甲醇-水(60(40) 132 ⑻. 衍生分析 有些农药品种可以通过衍生的方法检测。衍生分柱前和柱后2种方式。柱前衍生不受反应时间的限制，缺点是待测物可能有损失，衍生化反应试剂可能会干扰分离。现有的荧光检测器、可见光检测器、电化学检测器广泛采用柱后衍生的方法。3种柱后衍生方法见图4-36。A型反应器为开管式（Open tubular reactor），样品在反应器中反应速度快，反应时间小于1分钟，适于胺类化合物的检测，适用的衍生化反应试剂为苯二醛；B型反应器为分流式（Segmented stream tubular reactor），反应时间5~30min；C型反应器为填充床式（Packed bed reactor），反应时间介于上述两者之间，为0.3~5min。 4.2.5 高效液相色谱仪的日常维护 高效液相色谱仪需要日常精心的维护和保养，以便仪器处于正常的工作状态，延长色谱柱的使用寿命，保证分析数据更为准确可靠。 1. 高压泵的日常维护 长色谱柱或使用了很长一段时间的色谱柱或加大流动相的流速，柱压会明显提高，高压泵的噪声也会加大，这属于正常现象。高压泵的高压限制自动保护值不要设置太高，日常分析为20~30MPa。当超压报警，高压泵停止泵液时，要逐级拆开管路，找出堵塞处排除后，再复位工作。在维修高压泵时要特别小心，防止固体颗粒进入泵体，划伤密封环、阀球、座和柱塞。 2. 对流动相的要求 所用的流动相和样品溶液必须经过0.45(m的滤膜过滤才能上机使用。即使过滤后在分析柱前也要加装保护柱。流动相所用的水必须新鲜，可以用纯水仪制备或自行蒸馏，水质应符合实验室二级水规格。通常的做法是对电热蒸馏水再用全套玻璃蒸馏器重蒸馏一次。要注意用超声波清洗器定期在稀硝酸或甲醇中清洗过滤头，过滤头不通畅会容易导致进入高压泵的流动相产生气泡。流动相在一定pH值下操作时，要注意空气中CO2溶解在流动相内对pH值变化的影响。更换流动相时，如果两种流动相互不相溶，需采用过渡溶剂将前一种流动相逐步溶解彻底洗脱后才能换相。 3. 进样系统的维护 使用指定的进样器，防止进样器针头划伤阀体。在农药残留分析周期内，不要进行有干扰的常量分析。 4. 色谱柱的日常维护 每次开机时，流量要逐渐增强或降低，避免突然增压或降压，使柱床受到冲击，产生空隙。不要接反柱头或其它连接拧的太紧，不漏液即可，如果拧得过紧易损坏接头螺纹。在使用缓冲溶液做流动相时，更换甲醇前，一定要用水将盐冲洗干净，否则盐沉积可能导致色谱柱彻底堵塞报废。高效液相色谱柱与气相色谱毛细管柱不同，保护再好也有一定的使用寿命。毛细管柱在防止干烧的情况下，可以使用很长一段时期。液相色谱柱的寿命与流动相种类及处理，色谱仪操作的流量和压力，样品的净化处理有关。色谱柱是否报废，主要取决于对样品的分离度和在一定流量下的柱压。不要试图拧开色谱柱管，这样可能导致柱效显著下降，色谱柱提前报废。柱子经过反冲、清洗和再生往往很难提高柱效。色谱柱中的填料往往随温度升降产生膨胀和收缩，在某些情况下，温度突然变化会损坏柱床，因此使用时温度要逐渐升高，实验结束时柱子慢慢降到室温再停泵。每次实验结束后，反相色谱操作方式要用100%甲醇或乙腈冲洗色谱柱20分钟以上才能关机。拆卸后的色谱柱两端用盲头螺丝拧紧，防止封存的溶剂挥发。反相填料要用甲醇，正相键合相用2,2,4–三甲基戊烷封存，置于干燥避光处保管。 5. 数据处理系统和工作站的维护和升级 配备色谱工作站的高效液相色谱仪，通常由仪器生产厂商专门开发的软件操作系统来控制仪器的工作状态和数据处理。在安装和使用这类软件时要注意适用的计算机操作系统的版本和语言，对计算机的硬件设备要驱动，使之正常工作，否则可能导致计算机经常死机，影响正常的分析工作。最好要对原机器带来的软件进行拷贝或妥善存档。高效液相色谱仪软件操作和数据处理系统升级通常要收费。高效液相色谱仪的操作人员要对计算机的知识和使用熟悉，能解决实际分析工作中遇到的问题。对于不具备这方面能力的人要进行培训，非工作人员不要随便启动计算机和高效液相色谱仪。 4.2.6 定性与定量分析 高效液相色谱法的定性与定量分析可参阅本章气相色谱法的内容。在定性方面，除采用与标准物质的相对保留时间比对外，还可以利用检测器的选择性、紫外检测器全波长扫描功能、改变流动相组成时农药的保留值变化规律定性。在农药残留分析上通常采用外标法定量，很少采用内标法。在农药原药和制剂定量分析上，当对分析准确度和精密度有较高要求时，可采用内标法分析。内标物通常选用邻苯二甲酸酯类同系物。除非是建立方法研究，日常定量分析只采用单点校正或两个浓度标准溶液建标进行测定。 图4-16 液相色谱分离模式选择图 阳离子交换柱，水为流动相 是 否 阴离子 是 图4-15 高效液相色谱分离模式 � EMBED OrgPlusWOPX.4 ��� 是 是 是 否 否 否 否 否 空间排阻色谱 凝胶过滤色谱 反相阴离子对离子，C8,C18,有机溶剂和水为流动相 反相键合色谱，有机溶剂 和水为流动相 凝胶渗透色谱 离子交换色谱 离子抑制色谱 很强的脂溶性 可离子化吗？ � eq \o\ad(分子大小差别大,　　　　　　　)� 阴离子交换柱，水为流动相 反相阴离子对离子，C8, C18有机溶剂和水为流动相 阴离子 离子对 反相键合相色谱，C18,有机溶剂和水为流动相 液固吸附色谱，硅胶，极性溶剂 溶于有机溶剂 试样的分子量>2000 是 液固吸附色谱，硅胶，强极性流动相 反相键合相色谱，C8,有机溶剂和水为流动相 正相键合相色谱，CN,NH2,有机溶剂 1-贮液器 2–搅拌、超声脱气器 3–梯度洗脱装置 4–高压输液泵 5–流动相流量显示 6–柱前压力表 7–输液泵泵头 8–过滤器 9–阻尼器 10–六通进样阀 11–色谱柱 12–检测器 13–记录仪(或数据处理装置) 14–回收废液罐 图4-17 高效液相色谱仪流程示意图 1–高压输液泵 2–贮液器 3–膜过滤器 4–塑料膜管线（体积12mL，气体可渗透出来） 5–传感器 6– 控制电路 7–电磁阀 8–真空泵 9–脱气后流动相至过滤器 10–脱气单元 图4-18 高效液相色谱仪在线脱气结构示意图 图4-19 往复式柱塞泵 a,b-低压梯度洗脱 c-高压梯度洗脱 图4-20 低压梯度和高压梯度洗脱装置示意图 c b a 图4-22 六通进样阀示意图 图4-21 Rheodyne 7125 六通进样阀 图4-24 各种高效液相色谱柱 图4-23 保护柱 图4-25 反相色谱溶剂强度图 四氢呋喃(水 甲醇(水 乙腈(水 图4-26 液相色谱填料的类型 图4-27 硅胶结构示意图 1–柱管 2–压帽 3,6–卡套 4–筛板 5–接口 7–螺丝 8–输液管 图4-28 柱结构示意图 图4-29 紫外–可见光检测器示意图 图4-30 三维色谱图 1–氘灯 2–消色差透镜 3–斩光器 4–测量池 5–光电二极管阵列 6– 全息光栅 图4-31 二极管阵列检测器示意图 图4-32 荧光检测器示意图 图4-33 三电极安培检测器示意图 1-流动相入口 2-连接螺母 3，6-硅橡胶密封 4-铂电极 5-有机玻璃 7-电极导线 图4-34 电导检测器示意图 1-光电倍增管 2-检测室 3-钨/卤灯 4-蒸发管 图4-35 ELSD检测池结构示意图 A-开管式反应器B-分流式反应器 C-填充床反应器 图4-36 柱后衍生示意图 � EMBED Equation.3 ��� PAGE 73 _1092806960.bin _1131906811.unknown