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zhanggj126
2018-09-09 0人阅读 举报 0 0 暂无简介

简介:本文档为《CDdoc》,可适用于高等教育领域

圆二色技术及应用CircularDichroismCD圆二色技术及应用一序言二基本原理三圆二色仪四氨基酸和肽的圆二色性五圆二色技术的应用一序言世纪,Huggens,偏振光年,Biot,石英能使偏振光的偏振面旋转,年Lowry,《OpticalRotatoryPower》年建立了第一台偏振光检测仪世纪年代以后圆二色仪出现二基本原理(一)几种偏振光的概念平面偏振光(planepolarizedlight)又称线偏振光(linearlypolarizedlight)对着光前进的方向观察时一束光波的电场矢量(或磁场矢量)都是在同一方向振动。圆偏振光对着光前进的方向观察时一束光波的电场矢量(或磁场矢量)端点在空间的轨迹是以光传播方向为轴的圆形螺旋(在平面上的投影为圆形)。电矢量方向沿逆时针方向旋转称为左圆偏振光电矢量方向沿顺时针方向旋转称为右圆偏振光平面偏振光左圆偏振光右圆偏振光椭圆偏振光对着光前进的方向观察时一束光波的电场矢量(或磁场矢量)端点在空间的轨迹是以光传播方向为轴的椭圆形螺旋(在平面上的投影为椭圆形)。自然光对着光前进的方向观察时一束光波的电场矢量(或磁场矢量)取所用可能方向没有一个方向较其它方向占有优势。(二)几种偏振光的关系振幅相等、角频率相等、相位相同左右圆偏振光合成线性偏振光参照面振幅相等、角频率相等、αφφ参照面相位不同左右圆偏振光合成线性偏振光aφa振幅不相等、角频率相等左右圆偏振光合成椭圆偏振光振幅相等、位相差波长两束线偏振光合成圆偏振光(二)光学活性和光学活性物质光学活性()手性物质含有不对称原子(结构)的物质。具有光学活性。一束平面偏振光进入手性分子时手性物质会将其分解为左右圆偏振光并进行不同的处理。()旋光现象左右圆偏振光在手性分子中的行进(旋转)速度不同通过样品后再次合成的偏振光相对于入射光旋转了一定角度。()圆二色性手性物质对左右圆偏振光的吸收程度不同出射时电场矢量的振幅不同通过样品后再次合成的偏振光就不是圆偏振光而是椭圆偏振光。光学活性物质(opticalactivesubstance)()定义具有光学活性的物质与手性物质等价。(三)旋光色散和圆二色谱旋光性通常用旋光度α表示α的大小随入射波长而变化的关系称为旋光色散(opticalrotatorydispersion,ORD)。圆二色性常用椭圆率(ellipticity)θ表示:ELErtgθ=ELErb(椭圆短轴)=a(椭圆长轴)文献上也常用光学活性物质对左、右圆偏振光的摩尔吸收系数的差别Δε来表示。ALARΔε=εLεR=ΔACL=CLΔA=ALARΔε或θ随波长而变化的关系称为圆二色谱(circulardichroism,CD)(四)CD与ORD和吸收光谱的关系旋光性和圆二色性联系:都是由光学活性分子的不对称性引起的二者之间相互联系由其一可推知其二。由KroningKramers将二者联系起来。差别:一个孤立的生色团在所有波长均有旋光性。圆二色性只在发生吸收的那些波长才能观测到。CD与ORD和吸收光谱的关系CD谱中在λ=λ处θλ取极值(峰值或最小值)ORD在λ=λ处φλ=科顿效应:CD谱与吸收谱峰位基本接近但吸收谱都是正值而CD谱则能显示正负。ε吸收谱PositivecottoneffectNegativecottoneffectλλλλλCD与ORD和吸收光谱相比在结构分析中的优点()吸收谱均是正值若同时存在多个吸收峰其互相交叠分析困难。()对于ORD谱任意波长处的旋光性是所有生色团贡献之和其极值与吸收谱不同。()CD谱线可正可负其极值与吸收谱一致。三旋光仪与圆二色仪(一)圆二色仪光路图单LIGHT色器棱调制解调器镜样前置光电品放大器探测器室(二)圆二色仪组成部分光源氙灯起偏器尼科耳棱镜:天然方解石Rochon棱镜:结晶状石英调制解调器(CDM)在其上施加几万赫兹的高频交变电压作用是将单色的平面偏振光以这种频率交替地变化为左、右旋圆偏振光。光电倍增管(PM)5样品杯由高度均匀的熔融石英制做不会带来附加的原二色性也不会对光产生散射。样品浓度要与样品杯光径配合使待测样品的OD值不大于2。氮气保护装置四氨基酸和肽的圆二色性(一)氨基酸的圆二色性氨基酸分子中具有紫外生色团的有吲哚基酚羟基苯基二硫键咪唑基羧基。酪氨酸色氨酸苯丙氨酸胱氨酸脯氨酸在近紫外区(nm)对CD谱有贡献羧基在nm显示正峰。(二)肽的的圆二色性Secondarystructureofmacromoleculeαhelix:nm()nm,nm()βsheet:nm()antiparallel:redshiftparallel:blueshiftnm()Unorderedstructure:()belownm()nmweakbandβturn:nm()nm()nm()band,weakredshiftαhelixβsheetunorderednm远紫外区(nm)(三)含有金属离子的生色团在波长大于nm的区域包括可见区域对CD谱的贡献主要来自像血红素一类含有金属离子的生色团这一波段CD谱常用于研究金属离子的氧化态、配位体以及链链相互作用。五圆二色技术的应用利用圆二色谱可以计算多肽二级结构的含量。θλ=fθαλ,αfθβλ,βfθγλ,γθλ,α、θλ,β、θλ,γ分别为α螺旋、β折叠和非周期结构在波长λ处的椭圆率值fα、fβ、fγ分别为α螺旋、β折叠和非周期结构在蛋白质中所占重量百分比。图:三种LRR(lysinerichrepeat)家族肽的CD谱CD谱非常适合研究蛋白质的构象变化()蛋白质蛋白质、蛋白质核酸结合的研究图A,Bob()和OctDNA复合物的CD谱图BOctDNABob()三元复合物的CD谱()克山病区粮饲养的豚鼠心肌线粒体膜的研究模型动物心肌线粒体膜的CD谱(a:病区粮喂养组b:病区粮补加蔬菜喂养组c:正常对照组)模型动物心肌线粒体细胞色素C的CD谱(a:病区粮喂养组周前死亡b:病区粮喂养组存活的c:正常对照组)()烟草花叶病毒侵染膜蛋白()疏水表面对球状蛋白质二级结构变化的诱导作用a:无规卷曲b:有β折叠c:有α螺旋d:α螺旋更多BSA在疏水石英板表面的CD谱(augml,Sbugml,Scugml,Sdugml,mineugml,溶液中的BSA)()磷脂膜诱导的蜂毒素二级结构的变化α螺旋β折叠无规卷曲α螺旋β折叠无规卷曲蜂毒素的CD谱(:蜂毒素插入单层膜的CD谱:蜂毒素吸附在单层膜上时的CD谱:在TrisHCL缓冲液中的蜂毒素CD谱)Conformationaltransition:fromalphahelixrichtobetasheetrichPrPcPrPscTypicalInitialConcentrations:ProteinConcentration:mgmlCellPathLength:mmStabilizers(Metalions,etc):minimumBufferConcentration:mMoraslowaspossiblewhilemaintainingproteinstabilityOnemayfindthattheproteinconcentrationneedstobeadjustedtoproducethebestdataChangingthishasaprofoundeffectonthedata,sosmallincrementsordecrementsarecalledforIfthatdoesnotproducereasonablygooddata,achangeinbuffercompositionmaybenecessaryItwouldalsobeagoodideatocheckthesampleforunforeseenaggregationviaDynamicLightScattering(DNArepairenzymesareanespeciallygoodexampleofthisbehavior)Ifbufferposesaproblem,cellswithshorterpath(mm)andacorrespondinglyincreasedproteinconcentrationandlongerscantimecanhelp思考问题Whatismeantby“farUV”lightWhenCDisappliedtoproteinswhatisthemainchromophore(absorbinggroup)thatislookedatWhatwavelengthrangedoesitabsorbinYouaremeasuringtheCDspectrumofaproteinusingammpathlengthcellYoufindthatthesignalisweakbecausetheconcentrationoftheproteinislowerthanyouwereinitiallytoldHowcouldyouovercomethisproblemandwhatdoyouhavetobecarefulofDoestheCDspectrumofaproteingivemostinformationaboutthe(i)primarystructure,(ii)secondarystructureor(iii)tertiarystructureDrawtheCDspectrumofanαhelixRemembertolabeltheaxesandmarkimportantpointswiththeirvaluesWhyisnitrogengasusedinCDinstrumentsDoesCDgiveinformationaboutwherethehelicesareinaproteinYouwishtostudythethermalstabilityofaproteinwithasingleburiedtryptophanresidueWhatmethodswouldyouconsiderusingandwhyMembraneproteinsaredifficulttostudybyCDTrueorfalseWhy参考文献《生物物理学》赵南明周海梦高教出版社-施普林格出版社,p《园二色性和旋光色散在分子生物学中的应用》鲁子贤崔涛施庆洛科学出版社CircularDichroismandLinearDichroism,AlisonRodgerandBengtNordén,OxfordUniversityPress《分析仪器手册》朱良漪孙亦梁陈耕燕化学工业出版社,pCircularDichroismandOpticalRotaryDispersionofProteinsandPolypeptides,AJAlder,NJGreenfieldandGDFasman,MethEnzymology,,()ComputedCircularDichroismSpectrafortheEvaluationofProteinConformation,NGreenfieldandGDFasman,Biochemistry,(),()CRCantorandPRSchimmel,BiophysicalChemistry,Vol,Chapter()EffectofTrifluoroethanolonProteinSecondaryStructure,FDSoennichsen,JEVanEyk,RSHodgesandBDSykes,Biochemistry,(),()ProteinSecondaryStructureandCircularDichroism:APracticalGuide,WCJohnson,PROTEINS,,()λθxE

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