关闭

关闭

关闭

封号提示

内容

首页 化药(二部品种)附录 蛋白质含量测定法

化药(二部品种)附录 蛋白质含量测定法.doc

化药(二部品种)附录 蛋白质含量测定法

开心
2018-09-08 0人阅读 0 0 0 暂无简介 举报

简介:本文档为《化药(二部品种)附录 蛋白质含量测定法doc》,可适用于医药卫生领域

附录××蛋白质含量测定组成蛋白质的基本单位是氨基酸氨基酸通过脱水缩合形成肽链蛋白质是一条或多条多肽链组成的生物大分子。不同品种应针对自身蛋白质特性选择适宜的测定方法并做相应方法学验证同时应尽可能选用与待测品种蛋白质结构相同或相近的蛋白质作对照品。第一法凯氏定氮法本法系依据蛋白质为含氮的有机化合物当与硫酸和硫酸铜、硫酸钾一同加热消化时使蛋白质分解分解的氨与硫酸结合生成硫酸铵。然后碱化蒸馏使氨游离用硼酸液吸收后以硫酸滴定液滴定根据酸的消耗量乘以换算系数即为蛋白质的含量。供试品溶液的制备照各品种项下规定的方法制备。测定法除另有规定外按测定法()操作。()本测定法适用于不含无机含氮物质及有机非蛋白质含氮物质的供试品。精密量取各品种项下规定的供试品溶液适量置凯氏定氮瓶中照氮测定法(附录VⅡD第二法)测定供试品溶液的含氮量除另有规定外氮转换为蛋白质的换算系数为。()本测定法适用于含有无机含氮物质及有机非蛋白质含氮物质的供试品。精密量取各品种项下规定的总氮量及非蛋白氮供试品溶液适量分别置凯氏定氮瓶中照氮测定法(中国药典年版二部附录第二法)测定以总氮量减去非蛋白氮量即为供试品溶液的含氮量除另有规定外氮转换为蛋白质的换算系数为。附注:非蛋白氮供试品溶液制备的常用方法:()钨酸沉淀法精密量取供试品适量(蛋白质含量不高于g)置ml量瓶中加水ml加%钨酸钠溶液mlmolL硫酸溶液ml加水至刻度摇匀静置分钟滤过取续滤液即得。(可依据蛋白质浓度适当调整%钨酸钠溶液及molL硫酸溶液用量使钨酸终浓度保持%。)()三氯醋酸沉淀法精密量取供试品适量(蛋白质含量约~mg)加等体积的%三氯醋酸溶液混匀静置分钟滤过取续滤液即得。(可依据蛋白质浓度适当调整%三氯醋酸溶液用量使三氯醋酸终浓度保持%。)适用范围:本法灵敏度较低适用于~mg氮的测定。氮转化成蛋白质的换算系数因蛋白质中所含氨基酸的结构差异会稍有区别。第二法福林酚法(lowry法)本法系依据蛋白质分子中含有的肽键在碱性溶液中与Cu螯合形成蛋白质-铜复合物此复合物使酚试剂的磷钼酸还原产生蓝色化合物同时在碱性条件下酚试剂易被蛋白质中酪氨酸、色氨酸、半胱氨酸还原呈蓝色反应。在一定范围内其颜色深浅与蛋白质浓度呈正比以蛋白质对照品溶液作标准曲线采用比色法测定供试品中蛋白质的含量。试剂碱性铜试液取氢氧化钠g碳酸钠g加水ml使溶解作为甲液取酒石酸钾g加水ml使溶解另取硫酸铜g加水ml使溶解将两液混合作为乙液。临用前合并甲、乙液并加水至ml。对照品溶液的制备除另有规定外取牛血清白蛋白对照品加水制成每ml中含mg的溶液。供试品溶液的制备照各品种项下规定的方法制备。测定法精密量取对照品溶液ml、ml、ml、ml、ml、ml分别置具塞试管中各加水至ml再分别加入碱性铜试液ml摇匀各加入福林酚试液取福林试液中的贮备液(molL酸浓度)→ml立即混匀置℃水浴中准确反应分钟置冷水浴分钟照紫外-可见分光光度法(附录IVA)在nm的波长处测定吸光度同时以号管作为空白。以对照品溶液浓度与其相对应的吸光度计算回归方程。另精密量取供试品溶液ml照标准曲线的制备方法自“加入碱性铜试液”起依法测定从回归方程计算供试品溶液中的蛋白质浓度并乘以稀释倍数即得。适用范围:本法灵敏度高测定范围为~μg。本法干扰物质较多对双缩脲反应产生干扰的离子同样容易干扰福林-酚反应且影响还要大。还原物质、酚类、柠檬酸、硫酸铵、Tris缓冲液、甘氨酸、甘露醇、糖类、甘油等均有干扰作用。第三法双缩脲法本法系依据蛋白质分子中含有的两个以上肽键在碱性溶液中与Cu形成紫红色络合物在一定范围内其颜色深浅与蛋白质浓度呈正比以蛋白质对照品溶液作标准曲线采用比色法测定供试品中蛋白质的含量。试剂双缩脲试液取硫酸铜g和酒石酸钾钠g加水ml使溶解边搅拌边加入%氢氧化钠溶液ml用水稀释至ml混匀即得。本试剂如有黑色沉淀出现即不适用。对照品溶液的制备除另有规定外取牛血清白蛋白对照品加水制成每ml中含mg的溶液。供试品溶液的制备照各品种项下规定的方法制备。测定法精密量取对照品溶液ml、ml、ml、ml、ml、ml分别置具塞试管中各加水至ml再分别加入双缩脲试液ml立即混匀室温放置分钟照紫外-可见分光光度法(附录IVA)在nm的波长处测定吸光度同时以号管作为空白。以对照品溶液浓度与其相对应的吸光度计算回归方程。另精密量取供试品溶液ml照标准曲线的制备方法自“加入双缩脲试液”起依法测定从回归方程计算供试品溶液中的蛋白质浓度并乘以稀释倍数即得。适用范围:本法快速、灵敏度低测定范围为~mg。本法干扰测定的物质主要有硫酸铵、Tris缓冲液和某些氨基酸等。第四法,'联喹啉,'二羧酸法(BCA法)本法系依据蛋白质分子在碱性溶液中将Cu还原为CuBCA(,'联喹啉,'二羧酸)与Cu结合形成紫色复合物在一定范围内其颜色深浅与蛋白质浓度呈正比以蛋白质对照品溶液作标准曲线采用比色法测定供试品中蛋白质的含量。试剂铜-BCA试液取,'联喹啉,'二羧酸钠g无水碳酸钠g酒石酸钠g氢氧化钠g与碳酸氢钠g加水使溶解成ml调节pH值至作为甲液另取%硫酸铜溶液作为乙液。临用前取甲液ml,加入乙液ml混匀即得。对照品溶液的制备除另有规定外取牛血清白蛋白对照品加水制成每ml中含mg的溶液。供试品溶液的制备照各品种项下规定的方法制备。测定法精密量取对照品溶液ml、ml、ml、ml、ml、ml分别置具塞试管中各加水至ml再分别加入铜-BCA试液ml立即混匀置℃水浴中保温分钟放冷照紫外-可见分光光度法(附录IVA)立即在nm的波长处测定吸光度同时以号管作为空白。以对照品溶液浓度与其相对应的吸光度计算回归方程。另精密量取供试品溶液ml照标准曲线的制备方法自“加入铜-BCA试液”起依法测定从回归方程计算供试品溶液中的蛋白质浓度并乘以稀释倍数即得。适用范围:本法灵敏度较高测定范围为μg~μg。本法测定的样品中不能有还原剂和铜螯合物否则影响测定。第五法考马斯亮蓝法(Bradford法)本法系依据在酸性溶液中考马斯亮蓝G与蛋白质分子中的碱性氨基酸(精氨酸)和芳香族氨基酸结合形成蓝色复合物在一定范围内其颜色深浅与蛋白质浓度呈正比以蛋白质对照品溶液作标准曲线采用比色法测定供试品中蛋白质的含量。试剂酸性染色液取考马斯亮蓝Gg加乙醇ml溶解后加磷酸ml加水稀释至ml混匀。滤过取滤液即得。本试剂应置棕色瓶内如有沉淀产生使用前再滤过。对照品溶液的制备除另有规定外取牛血清白蛋白对照品加水制成每ml中含mg的溶液。供试品溶液的制备照各品种项下规定的方法制备。测定法精密量取对照品溶液ml、ml、ml、ml、ml、ml、ml分别置具塞试管中各加水至ml再分别加入酸性染色液ml立即混匀照紫外-可见分光光度法(附录IVA)立即在nm的波长处测定吸光度同时以号管作为空白。以对照品溶液浓度与其相对应的吸光度计算回归方程。另精密量取供试品溶液ml照标准曲线的制备方法自“加入酸性染色液”起依法测定从回归方程计算供试品溶液中的蛋白质浓度并乘以稀释倍数即得。附注:本法测定时不可使用石英比色皿(因石英中的二氧化硅会与染色物结合)建议使用塑料或玻璃比色皿。适用范围:本法灵敏度高可测定~μg的蛋白量。本法主要的干扰物质有去污剂、TritonX、十二烷基硫酸钠(SDS)等样品缓冲液呈强碱性时也会影响显色。第六法紫外分光光度法本法系依据蛋白质分子中含有共轭双键的酪氨酸、色氨酸等芳香族氨基酸其在nm波长处具最大吸光度在一定范围内其吸光度大小与蛋白质浓度呈正比。本法干扰因素多常用于纯化蛋白质的微量测定。对照品溶液与供试品溶液的制备照各品种项下规定的方法制备。测定法()取供试品溶液照紫外-可见分光光度法(附录IVA)在nm的波长处测定吸光度以吸收系数法或对照品比较法计算供试品中蛋白质的含量。()取供试品溶液照紫外-可见分光光度法(附录IVA)在nm与nm的波长处测定吸光度按下式计算供试品中蛋白质的含量。蛋白质浓度(mgml)=×A×A适用范围:、本法操作简便快速适用于纯化蛋白质的微量检测一般样品浓度为~mgml。本法准确度较差干扰物质多。、测定法()适用于供试品溶液中存在核酸时的蛋白质测定。

用户评价(0)

关闭

新课改视野下建构高中语文教学实验成果报告(32KB)

抱歉,积分不足下载失败,请稍后再试!

提示

试读已结束,如需要继续阅读或者下载,敬请购买!

评分:

/4

意见
反馈

立即扫码关注

爱问共享资料微信公众号

返回
顶部

举报
资料