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DNA与基因芯片.ppt

DNA与基因芯片

烟雨梦兮
2018-10-01 0人阅读 举报 0 0 暂无简介

简介:本文档为《DNA与基因芯片ppt》,可适用于医药卫生领域

目录第二十一章基因诊断与基因治疗GeneticDiagnosisandGeneTherapy南方医科大学基因工程研究所郭秋野目录基因变异致病类型内源基因的变异:基因结构突变基因表达异常外源基因的入侵:基因诊断和基因治疗遗传性疾病肿瘤、心脑血管病等(生殖细胞)(体细胞)病毒感染性疾病:HIV、SARS、HCV、HPV目录第一节基因诊断GeneticDiagnosis目录特点:针对性强:病因学检测特异性强:分子杂交技术灵敏度高:PCR、分子杂交放大效应样品量少适应性强:内源、外源基因早期快速诊断:一、基因诊断的概念和特点定义:利用现代分子生物学和分子遗传学的技术和方法直接检测基因结构及其表达水平是否正常从而对疾病作出诊断的方法。目录二、基因诊断常用技术方法(一)核酸分子杂交技术(二)聚合酶链反应(PCR)(三)基因测序(四)基因芯片目录二、基因诊断常用技术方法限制性内切酶谱分析法DNA限制性长度多态性(restrictionfragmentlengthpolymorphism,RLFP)间接分析(一)核酸分子杂交技术目录核酸分子杂交技术原理:目录核酸分子杂交的流程示意图待测核酸制备滤膜上核酸固化杂交去除未参与杂交的探针检测杂交信号制备探针核酸片段探针标记加入标记核酸探针目录×MstⅡ酶切位点(GCTNAGG)´´正常基因突变基因kbkb镰状红细胞贫血患者基因组的限制性酶切分析kb正常珠蛋白基因:’-CCTGAGG-’镰刀型贫血:’-CCTGTGG-’目录kbkbkb正常人突变携带着患者镰状红细胞贫血患者基因组的限制性酶切分析目录DNA限制性长度多态性分析DNA多态性:中性突变导致个体间核苷酸序列的差异限制性长度多态性分析:突变发生在酶切位点上酶切DNA片段不同长度RFLP:孟德尔方式遗传家族中与某一疾病紧密连锁作为遗传标志判定家族成员是否携带致病基因应用:甲型血友病、囊性纤维病变、苯丙酮尿症目录RLFP分析法目录单基因病苯丙酮尿症I型病因:肝脏合成的苯丙氨酸羟化酶(PhenylalaninaHydrozylase,PAH)缺乏。主征:智力低下尿有霉味治疗:新生儿诊断明确后即用低苯丙氨酸饮食控制血中苯丙氨酸浓度改善脑子的发育而“危险期”一过病婴后来就基本正常。PAH仅存在于肝脏细胞中在绒毛、羊水细胞和胎儿血中均不表达故不能通过测定酶活力及代谢产物来进行PKU的产前诊断只能依赖于家系分析找出与PKU致病基因相连锁的RFLP进行基因分析做出产前诊断目录(二)聚合酶链反应(polymerasechainreactionPCR)PCR定义:指由一对引物介导的基因或克隆的特定DNA序列的酶促扩增的反应过程是DNA的体外扩增技术本质是DNA的体外复制。应用PCR技术可以使特定的基因或DNA片段在短短的-小时扩增至百万倍。目录(二)聚合酶链反应KaryMullisresearchscientistinthesataCaliforniabiotechnologycompanycalledCetuscowinnerofNobelPrize目录PCR技术的基本原理①模板DNA的变性:℃热变性使DNA双链解离成为单链以便它与引物结合为下轮反应作准备②模板DNA与引物的退火(复性):℃左右引物与模板DNA单链的互补序列配对结合③引物的延伸:DNA模板引物结合物在TaqDNA聚合酶的作用下以dNTP为反应原料靶序列为模板按碱基配对与半保留复制原理合成一条新的与模板DNA链互补的半保留复制链目录PCR产物以指数形式增加即Y=n(n为循环次数)目录组织中总RNA的提取↓利用反转录酶合成cDNA↓PCR反应:反应缓冲液模板(上述合成的cDNA)底物(dATP,dGTP,dCTP,dTTP)引物(爱滋病病毒特异性引物)TaqDNA聚合酶μl循环:℃sec(变性)↓℃min(退火)循环↓℃min(延伸)以爱滋病的临床检测为例简要说明一下PCR在病毒感染的基因诊断中的应用。目录(三)基因测序技术他们给DNA的测序带来了一场革命分享了年的诺贝尔化学奖。后来Sanger法发展为自动化测序法并为人类基因组测序做出了卓越贡献。FredSanger发明的末端合成终止法(sanger法)WalterGilbert发明的化学裂解法MaxamGillbert法目录末端合成终止法(sanger法)原理‘,’双脱氧核苷三磷酸(ddNTP)与普通dNTP不同之处在于其脱氧核糖的‘位置少一个羟基可在DNA聚合酶作用下通过其'三磷酸基团掺入到正在增长的DNA链中但ddNTP因缺乏‘羟基而不能同后续的dNTP形成磷酸二酯键因此当正在增长的DNA链末端碱基为ddNTP时则链延伸反应终止不可能继续延伸。这样在DNA合成反应混合物的种普通dNTP中加入少量的一种ddNTP后链延伸将与偶然发生却十分特异的链终止展开竞争反应产物是一系列的核苷酸链其长度取决于从用以起始DNA合成引物末端到出现过早链终止的位置之间的距离结果将产生类寡核苷酸它们分别终止于模板链的每一个A、C、G或T的位置上。目录双脱氧链终止法的测序基础是以双脱氧核苷三磷酸为循环测序反应的链终止剂。目录POHdNTPddNTPPOHOHPPPPOH末端合成终止法(sanger法)原理目录’’’’引物模板DNAdNTPDNA聚合酶ddATPddTTPddGTPddCTP末端合成终止法(sanger法)原理目录末端合成终止法(sanger法)原理目录目录DNA自动测序结果目录(四)基因芯片技术快速、高通量、平行化、自动化指在固相支持物上原位合成寡核苷酸或者直接将大量基因探针以显微打印的方式有序地固化于支持物表面然后与标记的样品杂交通过对杂交信号的检测分析得出样品的遗传信息(基因序列及表达的信息)目录(四)基因芯片技术目录芯片的制备Geneprobes(cDNA、DNA)Readytousemicroarrayor目录SamplecellsExtractRNAorDNA)RTorPCRamplification)FluorescentlabelingReferencecellsSamplereadycombineLabeledRNAorDNA(Sample)LabeledRNAorDNA(Reference)))))))基因表达谱双色标记目录分子杂交)hybridizeApplysample)rinse目录检测分析LaserLaser芯片的扫描目录图像处理DetectorDetectorFalsecolordifferentialimage目录图像分析目录基因诊断方法经典基因诊断限制性内切酶法RFLP分析法寡核苷酸分析法优点缺点特异基因诊断未知基因诊断直接过程简单过程繁杂准确性低过程繁条件严格基因诊断进展PCR方法PCR序列分析法DNA芯片技术简单、经济、敏感操作直接、准确集成度高、快速、并行假阳性高价格高尚无成熟产品问世目录三、基因诊断的应用遗传疾病肿瘤感染性疾病传染性流行病判断个体疾病易感性器官移植组织配型法医学中个体识别、亲子鉴定目录小结基因诊断的定义基因诊断的特点基因诊断的常用技术目录第二节基因治疗GeneTherapy目录定义早期是指用正常的基因整合入细胞基因组以校正和置换致病基因的一种治疗方法。目前广义上来讲是指将某种遗传物质转移到患者细胞内使其在体内发挥作用以达到治疗疾病目的的方法。一、基因治疗的概念目录基因治疗的基本方法基因矫正(genecorrection)基因置换(genereplacement)基因增补(geneaugmentation)基因失活(geneinactivation)目录几种常见的基因失活技术反义核酸技术核酶技术三链技术干扰RNA技术基因治疗的其他方法:如“自杀基因”的应用基因疫苗等目录二、基因治疗的基本程序治疗性基因的选择基因载体的选择靶细胞的选择基因转移外源基因表达的筛选利用在体中的标记基因回输体内病毒载体非病毒载体体细胞生殖细胞间接体内疗法直接体内疗法目录目录三、基因治疗的应用与展望应用展望遗传性疾病、心血管疾病、肿瘤、感染性疾病、神经系统疾病进一步寻找切实有效的基因精密调控外源基因在人体内的表达体细胞移植和重建的生物学研究减少外源基因对机体的不利影响

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