实验药理学电子版实验药理学-第四篇

PAGE 44 第四篇 药物体内过程研究 亩 第四篇 药物体内过程研究 第二十章 药物体内过程研究 方法 快递客服问题件处理详细方法山木方法pdf计算方法pdf华与华方法下载八字理论方法下载 许多体外研究认为很有前途的候选化合物，因在体内活性很低甚至无体内活性或体内具有较大毒性而夭折，造成极大的人力和财力浪费。缺乏体内活性可能是由于其药动学性质不理想：如首过效应较强或不易通过肠粘膜被吸收，生物利用度太低；或代谢太快，半衰期太短；或不易通过生物膜而进入靶器官。体内的毒性则可能是由于其在体内形成的毒性代谢物所致。据文献报道进入临床试验后约有40%的候选化合物是由于药动学方面的原因而被淘汰的，这足以说明了解药物体内过程在创新药开发研究中的作用。一个候选化合物不仅要有较高的体外活性，还应具有理想的药动学性质，即较高的生物利用度和理想的半衰期。因此，在新药开发的早期阶段，可利用各种体内和体外模型对候选化合物药动学进行初筛，以便在研究开发早期就确定该候选化合物是否有继续开发的价值，并可根据筛选结果对先导化合物进行结构改造或修饰，以获得具有良好药动学特性的新候选化合物。最优的候选化合物是从一次次的优化循环中诞生的，每一次的优化循环都通过药理学、毒理学和药动学筛选结果反馈来指导下一步合成或结构改造。这样循环往复最终产生具有良好的药理学、毒理学和药动学特性的最佳候选化合物，进入下一步的临床研究。 第一节 药物体内吸收特征预测研究 现代药物研发成功与否，与药物的体内过程密切相关。目前，人工合成和筛选有限数量的化合物已被大规模的化合物合成和高通量筛选所取代。无论是开发新药还是开发新的给药途径，化合物在体内的吸收特性都非常重要。以往传统的体内药代吸收筛选模型，由于所需药物量大、难以批量化、耗时长以及费用高等弊端，已经无法满足现代新药的研发要求，因而开发新的快速、准确以及需药量少的药物吸收筛选模型已成为新药研发的必然趋势。目前，被广泛采用的三种筛选方法是：大鼠原位单次灌注法、大鼠外翻肠囊法以及体外人结肠腺癌（Caco-2）细胞系法。其中，Caco-2细胞模型已经成为一种预测药物人体小肠吸收以及研究药物转运机制的标准体外筛选工具。 一、Caco-2细胞跨膜吸收转运模型 （一）Caco-2细胞结构、功能特征 Caco-2细胞模型最初是由Borchardt和Workem在1989年提出的。 1．与小肠有相似的酶表达：该细胞系源于人体结肠癌细胞，其结构和生化作用都类似于人小肠上皮细胞，含有与刷状缘上皮细胞相关的酶系，如γ-谷氨酰胺转肽酶、碱性磷酸酶、谷肽甘肽-S-转移酶、磺基转移酶、细胞色素P-450酶系。与小肠主动转运相关的12种转运系统（如糖、氨基酸、二肽、胆酸、维生素B12）也都在Caco-2细胞内表达。 2．与小肠有相似的细胞结构特征：其来源于人的直肠癌，结构和功能类似于人小肠上皮细胞，并含有与小肠刷状缘上皮相关的酶系。在细胞培养条件下，生长在多孔的可渗透聚碳酸酯膜上的细胞可融合并分化为肠上皮细胞，形成连续的单层，这与正常的成熟小肠上皮细胞在体外培育过程中出现反分化的情况不同。细胞亚显微结构研究表明，Caco-2细胞与人小肠上皮细胞在形态学上相似，具有相同的细胞极性和紧密连接。胞饮功能的检测也表明，Caco-2细胞与人小肠上皮细胞类似，这些性质可以恒定维持约20天。由于Caco-2细胞性质类似小肠上皮细胞，因此可以在这段时间进行药物的跨膜转运实验。 （二）用途 1．研究药物小肠吸收的标准工具 利用人小肠上皮Caco-2细胞单层来进行药物小肠吸收的细胞水平实验，现在已经成为一种预测药物在人体小肠吸收以及研究药物转运机制的标准筛选工具。 评价 LEC评价法下载LEC评价法下载评价量规免费下载学院评价表文档下载学院评价表文档下载 新药的吸收，如新药为水溶性很差的化合物，则药物性质决定其不能制作成注射剂。为了改善其口服吸收生物利用度，国外研究人员使用了一些吸收增强剂，用Caco-2细胞来评价其吸收程度取得较好的结果。还有研究者使用Caco-2细胞模型评价了系列难溶性药物磷酸酯前药与其母药的吸收度，这些药物包括可的松、苯妥英等。结果发现，苯妥英等药物磷酯化后吸收大为增加，而可的松磷酯化后吸收程度有显著改变，这些结果在其他模型上也类似。在研究药物赋形剂对药物吸收的影响时，同时使用了Caco-2细胞模型和大鼠离体肠道进行评价，两模型的结果一致。这些都表明Caco-2细胞模型在新药吸收评价方面的重要价值。 2．预测吸收过程中的药物相互作用 Caco-2细胞中存在有与小肠上皮相同的各种转运系统、代谢酶，因此可以用来作为研究与吸收相关的药物相互作用的体外模型。小肠上皮的代谢、受体介导的转运、P-gp对药物分子的泵出，是一个饱和过程。联合用药时，因为有可能存在药物竞争酶、载体或P-gp泵的作用，所以会与单独给药时的生物利用度存在差异。这种药物吸收过程中存在的相互作用可以应用Caco-2细胞模型进行研究。此外，与药物吸收有关的相互作用还可来源于代谢酶、载体、P-gp泵被特定药物重复给药引起的诱导。当药物经细胞转运途径被吸收时，P-gp泵成为药物吸收的一个重要生化屏障，它把进入细胞内的药物泵出，从而减少了药物的吸收，因此成为口服药物生物利用度低、波动大的一个重要影响因素。具有这种P-gp泵出性质的药物分子在与P-gp泵抑制剂共同口服给药时，其透过细胞膜吸收的程度增强。 3．研究吸收机制 Caco-2细胞除了在吸收评价方面的大量应用外，也比较适合用于吸收机制的研究。有研究者分别利用Caco-2细胞作为钠和铁吸收的模型细胞，结果发现，脂筏(lipidraft)在决定PI3K/AKT2信号转导过程中起到重要作用，包括增加了肠道的Na吸收。 4．药物小肠代谢研究 人体小肠中存在着丰富的细胞色素P450同工酶，其中P4503A4占到该组织中所有细胞色素P450同工酶的约50%，而其在Caco-2细胞单层中的表达已见报道。与人体小肠甚至空肠微粒体相比，Caco-2细胞中的细胞色素P450同工酶为低水平表达，这是限制其作为口服给药化合物的小肠一相代谢研究模型的一个因素。为了克服这一局限，国外研究人员等利用1α，25-二羟基维生素D3处理过的Caco-2细胞单层作为研究小肠代谢动力学首过作用的体外模型。当将该系统应用于研究细胞色素P4503A4底物咪唑安定的代谢动力学时，显示出与体内研究相似的结果。 尽管细胞色素P450同工酶在Caco-2细胞中的表达水平较低，但其他许多药物代谢酶的表达水平不经诱导就可以用于药物小肠代谢的研究。比如，像羧酸酯酶、葡萄糖醛酸转移酶、谷胱甘肽-S-转移酶、磺基转移酶和儿茶酚-O-甲基转移酶等在Caco-2细胞中仍保持其功能特点。在这些酶中，二相磺基转移酶和葡萄糖醛酸转移酶对于口服给药化合物的生物利用度尤其重要，因为具有药理活性的化合物与它们发生结合反应后通常会导致活性降低或消失。例如，人们已经发现在Caco-2细胞中，类黄酮物质5，7-二羟黄酮产生硫酸盐和葡(萄)糖苷酸的变化，5，7-二羟黄酮硫酸盐的产生速度是其葡(萄)糖苷酸化的两倍。类似研究也表明，Caco-2细胞模型中酶的表达可以使其应用于药物的小肠代谢研究。 （三）研究方法 对Caco-2进行药物吸收研究采用transwell培养板，含有两个小池，在里面的小池底部有一层多孔渗水的半透膜，Caco-2细胞培养在半透膜上生长成单层汇合细胞。实验时，将化合物加入上面的小池内，然后定时检测下面小池内药物浓度。从而得出表现渗透参数。单细胞层的完整性可以通过测定跨细胞层电阻，或测定低渗透参照化合物如PEG4000的转运率来衡量。在P-gp抑制剂异搏定存在和缺乏时，通过测定P-gp的底物罗丹明123（Rhodamine123）123的转运率可以确定P-gp的表达水平。 （四）注意事项 但在应用这一模型时应注意，对于高通透性（即吸收良好）的候选化合物而言，其体内外的吸收往往具有良好的相关性，而对于中、低高通透性的候选化合物而言，其体内外的吸收的相关性不如前者。因为有些低分子量且水溶性好的候选化合物在体外表现出较低的通透性，而在体内却吸收良好，这是由于这类化合物可能存在细胞旁通道或某种主动转运机制。Caco-2细胞模型虽已被广泛用于体外吸收研究，但相对于高通量筛选的要求而言，其仍显得很费时，因此近年来一直在对其不断地加以改进，并建立了一些新的细胞模型，期望能够提高其筛选效率，以便其更适合于高通量筛选。如采用3天的Caco-2细胞模型，3天的MDCK细胞模型、HT29细胞模型。 （五）存在的问题 细胞培养时间过长（21天）：该模型本身为纯细胞系，缺乏在小肠上皮细胞中的黏液层；缺少细胞培养标准以及试验操作标准，使结果有时缺乏可比性；由于Caco-2细胞来源于人结肠，因而该细胞的转运特性、酶的表达以及跨膜电阻相对更能反映结肠细胞而非小肠细胞。 二、基于P-gp药物吸收体外转运载体模型 在肠上皮细胞上还存在一种特殊的转运分子P-gp，它定位于胃肠道细胞的膜表面。凡是能被P-gp识别作为底物的药物在通过其他途径进入细胞后，还会被P-gp通过一个耗能的过程挤压出细胞。因此，转运载体（如P-gp）在药物的吸收转运中扮演了重要的角色。由于分子生物学技术的迅速发展，使可以在体外进行转运载体分子的异种表达并在体外用于药物的转运的研究。目前已经建立的Caco-2和L-MDR1模型可以在体外表达P-gp，这些模型适合于体外转运的高通量筛选，如用于由P-gp导致的口服生物利用度降低或改变的药物高通量鉴别。此外，可采用稳定的细胞株在体外表达高水平的摄取转运载体，如有机阴离子转运蛋白（OATP），现已经可以使用克隆和细胞转染技术在体外表达制备并用于有机阴离子转运研究。膜囊泡和分离的肝实质细胞技术也可用于高通量筛选。 第2节 药物体内分布特征预测研究 药物被吸收进入血液循环后，会与血浆蛋白结合，而非结合的游离型则通过生物膜移行至各组织，而后与药物作用部位发生反应，显示其药效。药物与血浆蛋白和不同组织蛋白的结合能力以及各个组织细胞膜对药物的转运能力都影响分布过程。药物在某个组织中的富集可以被用来靶向给药，也可能会导致组织中毒。 一、药物与血清蛋白结合模型 药物在血流中转运时，一部分是以游离溶解于血液中，另一部分则与血液的多种成分（如血浆蛋白和血细胞）相结合。决定血浆中结合药物与非结合药物比率的主要因素是药物分子和蛋白质分子间的可逆性相互作用。多种血浆蛋白能与药物相结合，如白蛋白、α1-酸性糖蛋白和脂蛋白是重要的蛋白质。酸性药物易与白蛋白结合，而碱性蛋白则易与α1-酸性糖蛋白和脂蛋白结合。目前用于药物与血清蛋白研究的体外方法主要有：平衡透析、超滤、凝胶过滤、光谱法和光学生物传感器。平衡透析、超滤和凝胶过滤的特点是，将与蛋白结合的药物与未结合的药物分开，从而便于衡量药物与蛋白的结合率。通常药物是小分子，而蛋白是大分子，平衡透析法采用半透膜将药物和蛋白分在两个小室内，只有小分子可以透膜，达到平衡后测量两室内药物的浓度；超滤法采用超滤膜，将离心管隔开，药物与蛋白混合液加在上室内开始离心，蛋白分子不能透膜，与蛋白结合的药物分子也不会被离心到下室，只有游离的药物分子能进入下室；凝胶过滤是通过凝胶渗透层析将蛋白与小分子药物分离开。光谱法是通过蛋白与药物结合后的光吸收改变来测定与蛋白结合的药物的量，这种方法只在特殊的情况下才能使用。光学生物传感器使用表面等离子体共振技术，主要用于探测生物分子间的相互作用，因而可用于药物开发的许多过程中。该技术可筛选针对某一靶位点的先导化合物，也可检测药物与蛋白包括酶的结合能力。 二、药物向各组织分布的模型 目前在这方面没有有效的体外模型，比较类似的是考虑各组织的生物膜组分不同，建立相应的人造生物膜，用于分析药物在血液与人造生物膜的分布系数，从而衡量药物向组织分布的能力。但由于生物膜上的蛋白受体不可能很好的模拟，这样的结果可信度并不高。这主要用于建立数据分析药物的理化性质参数与分布之间的关系。 三、透血-脑脊液屏障模型 在所有组织中，脑组织比较特殊，脑循环毛细血管内皮细胞相互接触紧密，并有重叠，而且毛细血管还被神经胶质细胞所包裹，构成血-脑脊液屏障。药物要透过血-脑脊液屏障才能进入脑组织。模拟血-脑脊液屏障的模型，主要是采用脑血管内皮细胞和神经胶质细胞的共培养物。目前有采用来自于不同动物的细胞以及不同建系方法建立的多种共培养物。神经胶质细胞可以诱导血管内皮细胞维持体内的紧密连接。仍可采用transwell培养板的方法，先在下层小池底部接种神经胶质细胞，培养2~3天后，再在上层小池底部的膜上接种血管内皮细胞，经培养可形成紧密连接的单层细胞。也可将神细胶质细胞接种于上层小池的膜底部。研究药物的穿透能力也是在上层小池内加入药物，过一段时间再测外面大池内药物浓度。血管内皮细胞培养物的接触紧密性可通过跨膜电阻及参照化合物的转运率来确定。细胞共培养物可通过荧光和电镜的方法加以细胞形态鉴定，也可通过免疫检测，观察血管内皮细胞上表达的特有标记蛋白CD51、CD62P和CD71。通过比较可发现采用该模型得出的参数与体内实验结果有较大相关性，可以用于研究药物透过血-脑脊液屏障能力，对设计作用靶点位于脑部的药物提供帮助。目前该法已被一些制药公司使用。 第三节 药物代谢特征预测研究 一、药物代谢预测意义 大部分药物进入体内后会被代谢，然后以代谢物的形式排出体外，不经代谢直接以原药形式排出体外的很少。药物在体内的代谢主要有两步，第一步为I相反应，其间药物被氧化、还原或水解为极性更大的代谢物，催化I相反应的关键酶即为P450酶；第二步为II相反应，在此反应中，药物及其代谢物与内源性物质结合。催化II相反应的酶较多，重要的有葡萄糖醛酸转移酶、谷胱甘肽-S-转移酶，N-乙酰基转移酶等。由P450酶所催化的I相反应是药物在体内代谢的关键一步，因为这一步反应常常是药物从体内消除的限速步骤，可影响药物的生物利用度；而药物在体内的药动学个体差异往往是由于参与代谢的P450酶活性存在较大个体差异所致。 药物代谢与否决定了药物的代谢稳定性、药物的相互作用以及药物的毒性等。代谢过快则血药浓度难以维持在有效水平上，代谢偏慢会导致半衰期增加而容易达到中毒剂量。同时服用不同的药物会引起药物间的相互干扰，使代谢产物增多或减少，也可能使毒性增大或减弱。 一个候选化合物是否存在肝脏或肠道的首过效应是影响其口服生物利用度的一个非常重要的因素，尤其是I相代谢反应中P450酶所介导的氧化代谢反应。许多候选化合物在体外具有很高的活性，但由于其具有非常明显的首过消除，在体内疗效较差甚至无效。因此在创新药物开发研究的早期阶段就必须了解候选化合物是否存在肝脏或肠道的首过消除。 二、药物代谢研究常用方法 肝脏是药物的主要代谢器官。在体外研究中，肝细胞及微粒体、细胞质部分、S9部分、肝碎片和分离的肝实质细胞均可用于药物代谢研究。微粒体（microsomes）含有光滑内质网，包含了大部分I相氧化酶，但不含胞溶酶。II相反应的酶除尿苷二磷酸葡糖苷酸基转移酶（UGT）外大都是胞溶的。在用肝微粒体进行研究时，需加入相应的辅助因子或底物，如研究I相反应要加入NADPH，研究UGT则需加入底物尿苷二磷酸葡萄糖醛酸（UDPGA）。 目前可用于首过消除研究的体外代谢模型主要有：肝切片、培养的肝细胞、亚细胞部分如S9及肝微粒体，其中肝微粒体模型最为简便易行，也最适合于高通量筛选的体外代谢研究。目前带有自动装置的96孔微板技术，在体外代谢的高通量筛选中发挥了重要作用，这一技术利用氧生物传感荧光系统来测定肝微粒体中P450酶催化代谢反应时的耗氧速率，进而了解代谢情况。此外，还可用重组人肝P450酶进行体外代谢的高通量筛选。 对于代谢产物的分离鉴定可使用超滤结合LC-MS系统，将肝微粒体温孵液经超滤后，直接采用LC-MS进行分析鉴定，采用这一系统每小时最多可以处理60个样品。肝微粒体模型在体外代谢筛选中发挥了重要的作用，同时也应注意到其存的缺陷，如缺乏某些酶，特别是一些II相代谢酶；酶的含量和活性常常会受到制备技术、肝脏来源及酶失活的影响，而出现较大差异。新鲜分离的肝细胞可以克服上述的问题，但由于其制备技术复杂且人肝来源也限制了其在高通量筛选中的应用。 三、常见研究模型 （一）药酶抑制模型 药物间的抑制性相互作用有时可能导致严重的后果，有些药物甚至因此被撤出市场。因此研究药物间的抑制性相互作用已经成为新药药动学研究中的一个重要部分。许多酶促代谢反应均可被抑制，其中P450酶（CYP）介导的代谢相互作用最为重要，因为它是参与药物代谢的主要酶系。目前常用的药酶抑制模型主要有肝微粒体、重组人肝P450酶和肝细胞悬液。CYP抑制实验通常采用人或动物的肝微粒体进行，并运用HPLC法测定样品。肝微粒体模型较为适合于体外高通量筛选。采用这一方法可以同时研究P450酶系中的5个重要的P450酶：CYP1A2，CYP2C9，CYP2C19，CYP2D6和CYP3A4的活性，还可同时研究一系列结构相异的候选化合物与上述5种P450酶间的相互作用，进而对候选化合物是否对上述5种P450酶存在潜在的抑制作用作出初步评价，但需进一步使用CYP同工酶的特异性抑制剂加以证实。 （二）药酶诱导模型 由于肝药酶具有可诱导性，因此肝药酶常常会被一些外源性的化学异物（包括许多临床常用药物）所诱导，从而产生药物间相互作用。虽然有许多药酶可以被诱导，但对P450酶的诱导更为重要，其原因是，P450酶是参与药物代谢的主要的酶系；某些P450酶在致癌物的产生中发挥了重要作用。传统的诱导实验是重复给予动物某种化合物来观察其是否具有肝药酶诱导作用，由于P450酶存在明显的种属差异，因而无法预测其在人体内的诱导情况。目前已经建立了许多体外模型来研究肝药酶诱导，常用的肝药酶诱导模型有原代培养肝细胞、HepG2细胞和肝切片模型。这其中人肝的原代培养肝细胞模型最为适合于常规筛选，同时可以直接反映出人肝药酶的诱导情况，因而更具有实际意义。目前这一模型远未达到高通量筛选的水平。近年来已建立了可用于肝药酶诱导筛选的新方法，它是一种基于细胞基因表达的方法，它采用TaqmanRT PCR技术，检测培养的肝细胞中某种P450酶的mRNA表达，从而了解肝药酶的诱导情况，该法可用于肝药酶诱导的高通量筛选。 （三）代谢稳定性研究 将微粒体或肝细胞与供试药物共同孵育，然后用LC-MS对药物进行定量分析，可得出药物的代谢率，还可对一系列结构相关的化合物进行测量，对代谢中间物进行研究。由于微粒体中缺乏很多胞溶酶，其数据可能偏向于I相氧化反应。而完整的肝实质细胞包含有参与药物代谢过程的所有成分，并有合适的浓度、环境及细胞器，故用完整细胞进行研究更接近于体内状况。用新鲜制备的肝实质细胞研究肝清除率和体内代谢路径被认为是标准方法。目前还发展了很多方法进行肝细胞的低温贮藏，经低温贮藏的肝细胞仍保持了大部分药物代谢能力，仍可用于代谢稳定性的研究和确定药物的代谢途径及速度。 （四）基于药物代谢的药物相互作用模型 进入人体内的药物有自身的代谢，也会影响其他药物的体内代谢。药物可能抑制代谢酶的活性，也可能诱导某些代谢酶的表达。酶诱导后会导致毒性代谢物的剧增，或使药物的消除加快而降低药效。例如，抗肺结核药利福平会诱导CYP3A4而降低一些口服避孕药的药效。很多中草药甚至食物都包含可与代谢酶相互作用的化学成分。这种诱导作用具有种属间的差异性，如地塞米松在兔子体内可诱导CYP3A1的表达，但在人体内基本不诱导。肝细胞悬液可用于研究药物对代谢酶的影响。了解一个药物对协同治疗药物的潜在代谢影响是必要的。可以在96孔板上进行肝细胞长期单层培养，研究药物对肝基因表达的影响，当代谢酶表达稳定后，加入药物然后检测代谢酶的量，就可用mRNA定量方法来衡量基因表达变化，也可通过测酶的活性来衡量。mRNA的量基本可以反映出诱导与否，因为许多诱导都是通过与特定的上游感应元件相互作用提高转录水平的。定量实时PCR (QRT-PCR)可在100ng的总RNA（50000个细胞）中检验出10个拷贝，还可实时测定mRNA。确定一个孔细胞多基因表达，使得同时研究一个药物对所有CYPs酶的影响成为可能。药物治疗同时也会导致其他酶，如醇醛脱氢酶、谷胱甘肽-S-转移酶等的表达发生变化，使用QRT-PCR也可确定这些酶和催化I相和II相反应的酶及其他参与ADME的酶的变化。 四、研究方法学进展 用完整的肝器官研究生物转化，如肝灌流，可获得较完整的生物转化信息；具有因辅助因子补给较充足，有关酶系仍保持天然的定位关系等优点。但肝灌流等实验技术不适合高通量研究。经典肝切片和游离肝细胞具有部分上述优点，但酶活力保存时间较短，不适合酶诱导研究。 （一）组织水平 手工肝切片，若厚度不均匀会影响结果的可比性。近年发展了“精密肝切片技术”，可制备大量厚度适中（200~250μm）的均匀肝切片，并结合动态培养系统，组织标本可存活11h。利用患者手术切除的肝组织，可了解候选化合物在人组织内的生转过程。 （二）细胞水平 原代培养的肝细胞不适用于高通量筛选，因来源有限，变异较大，培养生命期较短。如用动物肝细胞，还存在对人体的种属差异。C3A细胞株来源于人肝胚细胞瘤，不存在动物种属差异；重现性较好，不存在个体差异；不受组织来源的限制，细胞株能在任何细胞培养基形式中获得，培养基含或不含血清，还可按实验要求定制供应。 （三）亚细胞水平 cDNA表达的酶蛋白载体和免疫抑制性抗体，市场已有产品，近年在交互反应，检测底物和抑制剂的专一性等研究中已较多采用。cDNA编码的CYP，一般用菌苗或杆状病毒媒介动物构建。例如：用HepG2细胞，经重组病毒感染后，可用来表达人CYP1A2，2B6，2C8，2C9，2E1和3A4。又如：用Sf9昆虫细胞，经重组杆状病毒感染后，可用来表达人CYP2A6和2D6。 第四节 药物代谢研究在新药开发中的作用 新药研究的过程一般可分为药物设计和新药开发两个阶段。药物设计包括：（1）针对某一特定治疗靶点设计先导化合物，（2）根据先导化合物的药理、毒理及代谢等特性进行结构改造以获得新的候选物；在药物开发阶段主要对候选物进行药效及毒性评估。药物代谢研究在这两个阶段都发挥着重要作用。在新药设计阶段，可针对先导化合物代谢过快或生成毒性代谢物的特性进行结构改造以获得安全稳定的候选物，使之有更大的开发价值，也可合成有效代谢物或模拟有效代谢物的结构以获得新的候选物；而在新药开发阶段，利用各种体外模型对候选物的代谢特性（如药酶诱导、抑制，参与代谢的药酶种类，活性代谢物的生成等）可进行高通量筛选，以便在研究开发早期确定药物是否有继续开发的价值，并可用实验动物进行体内代谢研究，以推断药物在人体内的生物转化模式。美国最近一项报告指出，药物研究过程中只有10%的新药候选物可进入市场，而大约40%的药物是由于无体内活性或药代动力学参数不佳而遭淘汰。因此，在药物设计及新药开发早期进行药物代谢研究将有助于获得安全、有效的治疗药物，降低候选药物的淘汰率。 药物代谢过程是药物在体内产生药效及毒性的主要过程，因此，为更好地设计新药，保证临床用药的安全性及有效性，降低药物研究过程中的高淘汰率，需要加强药物代谢酶及代谢过程的基础研究。目前，关于药物代谢酶仍有一些问题尚未完全解决，如一些药物代谢酶的三维结构仍不完全清楚；P450酶系统如何产生活性中间体，其结构如何，怎样氧化底物等；此外，如何通过临床前的实验结果预测新药候选物是否对P450酶系统有诱导作用，如何预测活性代谢物介导的毒性，某些P450酶系统家族的定位及功能等问题仍未完全解决。这些问题的解决将对药物研究将具有指导性作用。在药物设计上，对酶分子结构的深入研究将指导新药的开发过程。如Szklarz等人在最近的研究中采用定点突变的方法对CYP3A4和CYP2B1底物特异性的分子机制进行了研究，将有助于了解酶诱导及抑制的分子机制，进而可指导靶向药物的分子结构设计。同时由于对化合物的生物学活性进行快速评估的高通量筛选方法的出现，使得大量候选药物进入开发阶段。 一、药物代谢研究与新药设计 合理的药物设计应考虑到药物代谢途径及相关代谢特征，找出先导化合物的代谢“hot-spot”,对其结构进行改造，降低毒性或增加代谢稳定性。 （一）对先导药物进行化学改造，改善药理作用，降低毒性 通过对先导化合物进行结构改造，可使获得的新候选物按照已知的代谢途径失活或不代谢而由原形排出体外，提高药物的安全性，也可防止药物失活，增加药效。 1．在体内不代谢或仅经水解酶代谢的药物设计 对先导药物进行结构改造可得到在体内不代谢或仅经水解酶代谢的候选物。由于这类药物可不经P450酶系统进行生物转化，避免了活性代谢物的产生而降低了药物毒性。如目前临床使用的骨吸收抑制剂双磷酸盐(Bisphosphonates)是由焦磷酸盐经结构改造获得的。焦磷酸盐在体外可与磷酸钙牢固结合，抑制磷酸钙晶体的生成和溶解，但由于焦磷酸在体内到达病变位置前已被水解，因此体内无抑制骨吸收作用。对焦磷酸进行结构改造时发现当以P-C-P键代替焦磷酸的P-O-P键时可得到双磷酸盐，它与焦磷酸有相似的活性，但在动物或人体内都不经代谢，唯一的消除途径是肾排泄。又如Remifentanil(商品名Ultiva),一个新开发的短效μ-阿片受体激动剂，其结构是一种甲基酯。约90%以上的药物在体内经酯酶水解代谢为无活性的酸性代谢物经尿液排出。通常，这类药物都非常安全，无显著的系统毒性，在新药设计中很受欢迎。 2．对药物分子进行结构修饰，防止其失活 大部分药物进入体内经转化后活力减弱甚至消失。若对药物分子进行化学修饰防止其快速失活，则可增加药物的作用。如临床常用的6-巯基嘌呤（6-mercaptopurine）在体内易被氧化脱硫而失去药效，经结构改造保护巯基后，可得到巯唑嘌呤（Azathioprin）。 （二）合成有效代谢物或模拟有效代谢物结构，以获得新的候选物 某些药物通过生物转化形成的代谢物仍有药理活性，由于这些代谢物通常与II相酶结合排出体外，与原型药物相比可能安全性更高，因此可作为候选药物的一个来源。如扑热息痛（Paracetamol）是非那西丁（Phenacetin）的O-脱乙基代谢物，但扑热息痛较非那西丁镇痛作用更强，且不导致高铁血红蛋白血症及溶血性贫血。扑热息痛在体内主要发生葡糖醛酸化和硫酸化，在临床规定的用量范围内是很安全的。除I相酶的氧化-还原反应外，通过II相酶的共价结合反应也可产生有生物活性的代谢物。如吗啡-6-葡糖醛酸（Morphine 6-glucuronide）是比吗啡（Morphine）本身强的μ-阿片受体激动剂。此外米诺地尔（Minoxidil）也是通过硫酸结合物在体内产生治疗作用。 由于需要进行代谢研究的新药一般都是已明确有一定生物活性的化合物，因此通过代谢研究发现的新药大多不是完全新类型的化合物，而多是通过对先导化合物进行结构改造以增加疗效或改善克服不良反应，这在新药开发工作中是一个不可忽视的途径。有时新药存在的某些缺点能否克服是决定该药是否有实用价值的重要因素。 二、药物代谢的临床前研究 新药开发阶段首先用各种体外模型对候选物的代谢特性进行筛选以确定药物是否有继续开发的价值，随后进行动物的体内代谢研究以及人体的体外代谢研究，以推断药物在人体内可能的代谢途径及是否安全有效。 （一）药物代谢的体外研究 在新药开发各阶段，体外模型由于简单可行而得到越来越广泛的应用。通过体外实验可以推断药物代谢途径及参与代谢的相关酶系，同时可以判断药物是否由于竞争P450酶系统而发生相互反应。 1．药物的体外高通量代谢筛选 二十世纪90年代以来，基因组 计划 项目进度计划表范例计划下载计划下载计划下载课程教学计划下载 及组合化学技术越来越广泛用于药物的设计过程，为得到大量化合物提供新的途径，同时高通量筛选方法的出现加快了对化合物生物学活性评估的速度。因此，大量化合物作为候选物进入药物开发领域。为了加快新药开发的速度，药物的高通量代谢研究也日趋成熟。临床前药物代谢研究的体外模型见表20-4-1。 表20-4-1.临床前药物代谢研究的体外模型 可发现的代谢特征 可用模型 对药酶的诱导 肝细胞原代培养 HepG2细胞 肝切片 代谢不稳定 肝细胞悬液 肝切片 亚细胞结构(如微粒体) c-DNA表达的代谢酶 对药酶的抑制 亚细胞结构(如微粒体) c-DNA表达的代谢酶 肝细胞悬液 药物吸收差 Caco-2细胞 HT29-18-C1细胞 是否由具有多态性的酶代谢 c-DNA表达的代谢酶 亚细胞结构(如微粒体) 活性代谢物的生成 亚细胞结构(如微粒体) c-DNA表达的代谢酶 肝切片 肝细胞悬液/分离培养肝细胞 2．确定药物代谢途径及相关酶 在药物代谢过程中，一种酶可催化药物的多种代谢反应，而多种同工酶或不同酶系统可能催化同一代谢反应。如抗组胺药特非那定(Terfenadine)在人体内的N-脱烷基化和C-羟化反应都由CYP3A4催化，而米帕明（Mipramine）在人肝微粒体中的脱甲基化反应则由CYP1A2和CYP3A4两种同工酶共同完成。药物代谢反应的这种复杂性是由药物代谢酶系统的多样性造成的。同样，多数手性药物的代谢有立体选择性，这也可能是由于不同的同工酶参与了不同对映体的代谢。如大鼠中R和S-美芬妥英（Mephenytoin）的4-羟基化反应是立体选择性的，S-和R-美芬妥英的4-羟基化分别由CYP2C11和CYP3A1/2催化。 药物由体外模型得到的代谢特征通常可一定程度地反映体内的代谢特性，因此，可在新药开发的早期阶段用人体体外实验进行药物代谢的有关研究以确定药物在人体内可能的代谢特征。如体外实验常用肝切片系统，既保留了生理状态下药物进行生物转化时I相和II相反应所需的酶和辅助因子，而且与体内的代谢环境较为相似。除肝切片外，分离培养的肝细胞及高表达的代谢酶也经常用来进行体外药物代谢研究。 3．确定药物间相互反应 生物转化过程是许多药物消除的主要途径，因此当两种或多种药物经同一代谢酶代谢时，药物间则可能由于对药酶的竞争而发生相互作用。如当奥美拉唑(Omeprazole)与地西泮(Diazepam)合用时，由于二药皆由CYP2C19代谢且与酶的亲和力不同，因此在高代谢(Extensive Metabolizers, EM)人群中可见地西泮的血药浓度显著增加，导致严重的不良反应。近年来由于分子生物学技术的进步，药物代谢的体外研究在技术上已取得巨大进步，如今可利用体外系统协助进行药物间相互作用的研究。 （二）动物的体内试验 在临床前研究过程中，不仅要对药物的体外代谢、药效及机制等方面进行研究，同时要选定合适的动物种类进行体内实验。在新药报批时，药政管理机构需要生产厂家提供在动物体药物及代谢物的药理、毒理及代谢等研究数据，并要确定人体应用的安全范围。因此，体内实验一定要选择与人有相似代谢特征的动物。 1．体内代谢产物的收集 代谢产物的收集与研究是药物代谢研究中最经典、同时也是十分有效的方法之一。由于药物最终会通过与母核相关的一种或多种代谢物排出体外，因此，分离鉴定代谢产物可在一定程度上了解药物的代谢途径。近年来，HPLC及GC-MS-MS,LC-MS-MS,LC-NMR及LC-MS-NMR等高速、高效、高灵敏度的分析方法已用于代谢产物的分析，可在检测出极微量代谢产物的同时鉴定代谢产物的结构。 2．体内生化研究 近年来在分子水平对药物代谢酶进行了越来越深入的研究，促使药物的体内代谢研究不仅局限于对代谢产物的分离鉴定，也涉及参与药物代谢的酶学特征及相关基因分子生物学特征。在体内药物代谢研究的过程中可观察到，同一药物在不同种属、个体或性别动物体内其代谢、药效及毒性可能存在很大差别，这是由于其药物代谢酶水平和组成的差异所致。以P450酶系统为例，目前，在哺乳动物中已鉴别出14个批P450基因家族。除P450酶系统外，尿苷二磷酸葡糖醛酸转移酶(UDPGTs)和羧酸酯酶也都是由不同的同工酶构成的大家族，各同工酶的代谢活性有明显的种属差异。 同工酶学说可解释药物代谢过程中的种属差异及立体选择性代谢等现象。如洛沙坦(losartan)在大鼠和猴子体内分别经氧化及葡糖醛酸化反应进行代谢，而在人体内则产生几乎相等的氧化和葡糖醛酸化代谢物。同样，多数手性药物的立体选择性代谢也属此例。如口服抗凝药华法林(Warfarin)，临床以消旋体用药，但其代谢是立体选择性的。S-华法林在体内主要由CYP2C9催化代谢为S-7-OH华法林及一小部分S-6-OH华法林；而R-华法林在体内则由CYP1A2和CYP2C19催化，主要代谢为R-6-OH华法林及一小部分R-7-OH华法林。药物代谢过程中的性别多态性现象也可由同工酶学说来解释。 三、预测人体内的代谢特征 在进入临床实验前，根据药物代谢的体外及动物体内特性可初步推断出药物在人体的代谢途径，并可定量(或半定量)估计药物各代谢途径的清除率。这时还应注意由于种族及环境等因素,不同人群中药物代谢酶的基因构成可能有很大差异，即药物代谢酶的基因多态性。当药物主要由这类酶代谢时，不同患者对同一药物的代谢速率可能有显著差异。 关于人药物代谢酶的基因多态性研究较为广泛的两个酶是CYP2D6和CYP2C19。按照CYP2D6的基因多态性可将人群分为超快代谢型(Ultra-rapid Metabolizers,UM)、高代谢型(Extensive Mmetabolizers,EM)和低代谢型(Poor Metabolizers,PM) 3个表现型。在高加索人群中，约有5%～10%的人为PM表现型，而在亚洲人群中，只有1%～2%的人为PM表现型。迄今已发现包括抗抑郁药、抗精神病药以及心血管系统药物等至少50种药物主要是通过CYP2D6代谢的。同样，按照CYP2C19的基因多态性也可将人群分为EM和PM两个表现型。在高加索人群中，大约有2%～6%的人为PM表现型，而在亚洲人群中，约有14%～22%的人为PM表现型。 四、为临床研究提供指导 新药准备进入临床研究前一定要了解药物的代谢图谱，只有这样才能确定药物在人体内不会产生未知物，避免人体由于暴露于未知化合物而可能产生的毒性；通常适当的人体体外实验可以避免这种意外的发生。可是如果进入临床后在人体内发现有大量未知代谢物的生成，通常要暂停开发，直到合成出该未知代谢物并通过动物实验确定无毒后才能继续。此外，清楚药物的代谢途径还可以确定药物是否通过P450酶系统介导的氧化-结合反应进行消除，如否，则可简化药物间相互作用的研究。 通过一系列研究，在临床药理研究的最后阶段，关于药物的代谢途径、活性代谢物的存在、代谢的种属差异以及药物对代谢酶的诱导及抑制等特征都已清楚，这些数据在临床针对不同情况、不同特异质及特殊人群的用药有很重要的理论意义和实用价值。 五、药物代谢与药物不良反应 为保证药物临床应用的安全性，在开发过程中一定要对新药进行全面细致的安全评价，并要充分预测在人体内可能产生的毒性。药物代谢过程中的氧化结合反应、对药酶的诱导和抑制以及药物的立体选择性代谢、参与药物代谢酶的基因多态性等都与药物毒性的产生相关。虽然药物代谢有种属特异性，药物诱导产生的毒性也有种属依赖性，但一般仍可用动物实验预测药物的安全性。 （一）氧化和结合反应与药物毒性 　　药物通过氧化反应产生的活性代谢物可能是药物产生毒性的重要因素，如临床常用的扑热息痛大剂量时产生的肝毒性即是由于被P450酶系统氧化生成大量的N-乙酰-对-苯醌亚胺(NAPQI)致肝内GSH被耗竭，而后NAPQI与肝细胞蛋白质进行共价结合所导致。除氧化反应外，葡糖醛酸化、硫酸化及GSH结合等II相反应也与药物产生的毒性有关，如某些杂环芳胺类化合物可在肝脏中转化为N-羟基-N-葡糖醛酸代谢物，随胆汁进入肠道后在细菌β-葡糖醛酸酶的作用下释放出致癌的羟胺类化合物而导致结肠癌的发生。 （二）药酶的诱导和抑制与药物毒性 　　对药酶的诱导与抑制除了改变药物解毒的速率外，对活性代谢物的生成亦有重要影响。对药酶的诱导可通过加速活性代谢物的生成而增加药物的毒性，如CYP1A可催化苯并芘生成具有强致癌性的中间物，而有CYP1A诱导作用的药物可加速这种活性代谢物的生成。由于药酶的抑制引发的药物间相互作用也可导致非常严重的不良反应。如特非那定(terfenadine)主要由CYP3A代谢，而酮康唑(ketoconazole)是CYP3A的强抑制剂，因此当特非那定和酮康唑同时应用时，可导致特非那定的血药浓度升高，引起严重的心脏毒性，甚至危及生命。 （三）立体选择性毒性 从药效学的角度分析，药物产生药效及毒性多是由药物分子与特殊的酶或受体的相互作用决定的，因此手性药物的对映体之间在药效及毒性上可能有很大差别。如在世界范围内引起巨大反响的镇静催眠药反应停(Thalidomide)在60年代是以消旋体的形式上市的。后来的研究者在对大鼠及小鼠的研究中发现，反应停的S-对映体有致畸性，而R-对映体则无致畸性。而当S-和R-反应停分别给予兔时，却都有致畸性，而且消旋体似有更大的致畸性。很明显，反应停的毒性有立体选择性,且这种立体选择性毒性是有种属特异性的。如果在反应停进入临床前仔细对其种属特异的立体选择性毒性进行实验，则反应停造成的悲剧就可能避免。 （四）药物代谢酶的基因多态性与药物毒性 某些药物代谢酶具有基因多态性并可依此将人群分为EM及PM等表现型，对于主要由这类酶代谢且治疗范围比较窄的药物来说，在不同表现型人群中产生的药理作用可能有很大差别，因而更易产生毒性的差别。临床已证实经CYP2D6代谢的药物在PM表现型的患者身上更易产生不良反应。如普罗帕酮(propafenone)是主要由CYP2D6代谢的药物，Siddoway等人在28位慢性室性心律不齐病人（22EM和6PM）中的研究表明，普罗帕酮在PM病人体内的血浆稳态血药浓度要高于EM病人。这使PMs发生中枢神经系统副作用的比率（67%）要明显高于EMs病人（14%）。 参考文献 1．（瑞士）特斯塔. 药物的吸收、分布、代谢、排泄及毒性的研究方法。北京：科学出版社，2007 2．高坤，孙进，何仲贵. Caco-2细胞模型在口服药物吸收研究中的应用。沈阳药科大学学报，2005；22(6):469-474 （胡霞敏） 第二十一章 药代动力学与新药研究 药代动力学是研究药物在体内处置的药理学分支学科，重点是研究药物的吸收、分布、代谢、排泄四个主要环节。临床前药代动力学研究的目的，是揭示新药在动物体内的动态变化规律，阐明药物的吸收、分布、代谢和排泄的过程和特点，并根据数学模型提供重要的药代动力学参数。 临床前药代动力学研究在新药研发和评价过程中起着重要的桥梁作用，为药效学和毒理学评价提供了药物或活性代谢物浓度，是决定或阐明药效或毒性大小的物质基础，是提供药效或毒性靶器官的依据，也是药物制剂学研究的主要依据和工具，并为设计和优化临床研究给药方案提供依据。 尽管目前已经建立了许多研究选化合物吸收、分布和代谢的体外筛选模型，但体内的药动学研究仍占据重要的地位。因为候选化合物在体内的过程极为复杂，受到诸多因素的影响。如很多原因都可能造成候选化合物口服生物利用度低，这其中包括候选化合物难以通过肠粘膜而被吸收、存在肝脏或肠道的首过效应、存在P-糖蛋白（P-gp）参与外排机制或可通过胆汗迅速排泄，因此很难用一个体外筛选模型来分析其生物利用度低的原因。此外，可以通过口服或注射给药后的体内药动学研究获得一些非常重要的药动学参数如生物利用度、半衰期、清除率、分布容积等。药动学的体内研究和体外筛选是相辅相成的，有时运用体外模型预测体内参数不理想时，就必须借助于体内研究。 第一节 新药临床前药代动力学研究 一、临床前药代动力学研究的基本原则 进行临床前药代动力学研究，要遵循以下基本原则：①试验目的明确；②分析方法可靠；③试验设计合理（包括试验药品、试验动物的选择、试验方案、给药途径和给药剂量等）；④所得参数全面，满足评价要求；⑤对试验结果进行综合分析与评价；⑥具体问题具体分析。 二、试验设计 （一）总体要求 1．试验药品 应提供受试药物的名称、批号、来源、纯度、保存条件及配制方法。使用的受试药物应与药效学或毒理学研究使用的一致。 2．试验动物：一般采用成年和健康的动物。常用动物有小鼠、大鼠、兔、豚鼠、犬和猴等。一般来说，小动物如小鼠、大鼠、兔应≥5只，大动物如狗、猴应≥3只。选择动物的原则如下: （1）首选动物：尽可能与药效学和毒理学研究一致。 （2）尽量在清醒状态下实验，动力学研究最好从同一动物多次采样。 （3）创新药应选用两种或两种以上的动物，其中一种为啮齿类动物；另一种为非啮齿类动物。其他类型的药物，可选用一种动物（建议首选非啮齿类动物，如犬或猴等）。 （4）口服用药不宜选用兔等食草类动物。 3．剂量选择 动物体内药代动力学研究应设置至少三个剂量组，其高剂量最好接近最大耐受剂量，中、小剂量根据动物有效剂量的上下限范围选取。主要是要考察药物在体内的动力学过程是否属于线性，同时所得结果更有利于解释药效学和毒理学研究中的发现。 4．给药途径 所用的给药途径和方式，应尽可能与临床用药一致。 （二）生物样本的药物测定方法 生物样品的药物测定方法包括色谱法、放射性核素标记法、免疫学和微生物学方法。应根据待测药物的性质，选择特异性好、灵敏度高的测定方法。色谱法包括高效液相色谱法（HPLC），气相色谱法（GC）和色谱-质谱联用法（如LC-MS，LC-MS/MS，GC-MS，GC-MS/MS方法）。在需要同时测定生物样品中多种化合物的情况下，LC-MS/MS和GC-MS/MS联用法在特异性、灵敏度和分析速度方面有更多的优势。 对于代谢型药物或有活性代谢产物（有药效学或毒理学作用）的药物，建立方法时必须考虑是否能同时测定原型药和代谢物，在这方面，放射性核素标记法和色谱-质谱联用法具有明显优势。 应用放射性核素标记法测定血药浓度应配合色谱法，以保证良好的检测特异性。如某些药物难于用上述的检测方法，可选用免疫学或生物学方法，但要保证其可靠性。 放射免疫法和酶标免疫法具有一定特异性，灵敏度高，但原药与其代谢产物或内源性物质常有交叉反应，需提供证据，说明其特异性。生物学方法（如微生物法）常能反映药效学本质，但一般特异性较差，应尽可能用特异性高的方法（如色谱法）进行平行检查。 生物样品测定的关键是方法学的确证。方法学确证是整个药代动力学研究的基础。这是药代动力学研究有别于其它药理毒理研究的特殊之处。所有药代动力学研究结果，都依赖于生物样品的测定，只有可靠的方法才能得出可靠的结果。在通过特异性、灵敏度、精密度、准确度、稳定性等研究建立了检测方法学，得到了标准曲线后，在检测过程中还应进行方法学质控，制备随行标准曲线并对质控样品进行测定，以确保检测方法的可靠性。生物样品分析方法的一般性标准（见本章附录），研究时可根据分析方法的具体类型进行调整。 （三）具体研究项目 1．血药浓度-时间曲线 （1）受试动物数：以药时曲线的每个时间点有不少于5个数据为限计算所需动物数。最好从同一动物多次取样，尽量避免用多只动物合并样本。多只动物合并样本应相应增加动物数，以减少个体差异对试验结果的影响。建议受试动物采用雌雄各半，如发现药动学存在明显的性别差异，应增加动物数以便了解药物在雌雄动物体内的药动学的差异情况。对于单一性别用药，可选择与临床用药一致的性别。 （2）采样点的确定：采样点的确定对药代动力学研究结果有重大影响，若取样点过少或选择不当，得到的血药浓度-时间曲线可能与药物在体内的真实情况产生较大差异，由此计算的药代动力学参数也就失去了意义。给药前采血作为空白样品，给药后的一个完整的血药浓度-时间曲线应包括药物的吸收相、分布相和消除相，采样点的设计应兼顾到这三个时相。一般在吸收分布相至少需要2个采样点，分布相至少需要3个采样点，消除相至少需要6个点。整个采样时间至少应持续到3～5个半衰期，或持续到血药浓度为Cmax的1/10～1/20。为保证最佳采样点，建议在正式试验前，选择2～3只动物进行预试验，然后根据预试验的结果，审核并修正原设计的采样点。 （3）口服给药，一般在给药前应禁食12小时以上，以排除食物对药物吸收的影响。 （4）药代动力学参数的估算：将试验中测得的各受试动物的血药浓度-时间数据分别进行药代动力学参数的估算，求得受试物的主要药代动力学参数。静脉注射给药，应提供t1/2（消除半衰期）、Vd（表观分布容积）、AUC（血药浓度-时间曲线下面积）、Cl（清除率）等参数值；血管外给药， 除提供上述药代参数外, 尚应提供Cmax, Tmax和Ka药代参数,以反应药物吸收的规律。如用电子计算机程序处理数据应指明所用程序的名称和版本。 （5）该试验应提供的数据包括： 单次给药：①各个（和各组）受试动物的血药浓度-时间数据及曲线图和其平均数据及曲线图；②各个（和各组）受试动物的主要药代动力学参数和其平均数据；③对受试物单次给药临床前药代动力学的规律和特点进行讨论和评价。 多次给药：①试验设计：多次给药试验时,一般选用一种剂量(有效剂量)。根据单次给药代试验结果求得的消除半衰期(t1/2)及参考药效学数据, 确定药物剂量, 给药间歇和给药天数；②多次给药所需药代参数：各个（和各组）受试动物首次给药后的血药浓度-时间数据及曲线图和药代动力学参数；各个（和各组）受试动物的三次谷浓度数据；各个（和各组）受试动物最后一次给药后的稳态血药浓度-时间的数据和曲线图，及其平均数据和曲线图。比较首次与末次给药的药时曲线的动力学参数；各个（和各组） 平均稳态血药浓度、波动系数及其平均值。 2．药物的吸收 对于经口给药的创新性药物，应进行整体动物，以及在体或离体肠道吸收试验以阐述药物吸收特性。有条件的可采用体外吸收模型（如Caco-2细胞模型）研究药物吸收机理及影响吸收的因素。对于血管外给药的水溶性药物，应提供其绝对生物利用度。 3．药物的分布 选用大鼠或小鼠做组织分布试验较为方便。选择一个剂量（一般以有效剂量为宜）给药后，至少测定药物在心、肝、脾、肺、肾、胃肠道、生殖腺、脑、体脂、骨骼肌等组织的浓度，以了解药物在体内的主要分布组织。特别注意药物浓度高、蓄积时间长的组织和器官，以及在药效或毒性靶器官的分布（如对造血系统有影响的药物，应考察在骨髓的分布）。以药时曲线作参考，选3个时间点分别代表分布相（或吸收相）、平衡相和消除相的药物分布。若某组织的药物浓度较高，应增加观测点，进一步研究消除的情况。每个时间点，至少应有5个动物的数据。做分布实验，必须注意取样的代表性如取1/2或1/4个肾脏应注意对称取样。同位素标记物的组织分布试验，应提供标记药物的放化纯度、标记率（比活性）、标记位置、给药剂量等参数；应提供放射性分析所采用的详细方法，如分析仪器、本底计数、计数效率、校正因子、样品制备过程等；提供采用放射性示踪生物学试验的详细过程以及对生物样品测定时对放射性衰变所进行的校正方程等。尽可能提供给药后不同时相的整体放射自显影图像。 4．药物的排泄 （1）尿和粪的药物排泄：一般采用小鼠或大鼠，要将动物放入代谢笼内，选定一个有效剂量给药后，按一定的时间间隔分段收集尿或粪的全部样品。记录尿体积，混匀，取一部分样品，测定药物浓度。粪样品凉干后（不同动物粪便干湿不同）称重，按一定比例制成匀浆，记录总体积，取部分样品进行药物含量测定。计算药物经此途径排泄的速率及排泄量，直至收集到药物排尽为止。每个时间点至少有5只动物的试验数据。应采取给药前尿及粪样，并参考预试验的结果，设计给药后收集样品的时间点，包括药物从尿或粪中开始排泄、排泄高峰及排泄基本结束的全过程。 （2）胆汁排泄：一般用大鼠在乙醚麻醉下作胆管插管引流，待动物清醒后，以各种途径给药，并以合适的时间间隔分段收集胆汁，进行药物测定。 （3）要记录药物自粪、尿、胆汁排出的速度及总排出量（占总给药量的百分比）。 5．药物与血浆蛋白的结合 研究药物与血浆蛋白结合的方法很多，如平衡透析法、超过滤法、分配平衡法、凝胶过滤法、光谱法等。根据药物的理化性质及实验室条件，可选择使用一种方法进行三个浓度（包括有效浓度）的血浆蛋白结合试验，每个浓度至少重复试验三次，以了解药物的血浆蛋白结合率是否有浓度依赖性。只有游离型药物才能通过脂膜向组织扩散、被肾小管滤过或被肝脏代谢，因此药物与蛋白结合会明显影响药物分布与消除的动力学过程和降低药物在靶部位的作用强度。因此建议进行动物与人血浆蛋白结合率比较试验，以预测和解释动物与人在药效学和毒性反应方面的相关性。对高于90%以上蛋白结合率的药物，建议开展体外药物竞争给合试验，即选择临床上有可能合并使用的高蛋白结合率药物考察对所研究药物蛋白结合率的影响。 6．代谢转化试验 对于创新药，尚需了解在体内的代谢转化情况，确定主要代谢转化途径。对作为前药的新药, 除对其代谢途径和主要活性代谢物结构确证外, 尚应对原药和活性代谢物进行系统药代动力学的研究。而对主要在体内以代谢消除为主的药物(原形药排泄<50%)的代谢转化研究则可分为两个阶段：临床前可先采用色谱方法或放射性核素标记方法分析和分离可能存在的代谢产物，并用色谱-质谱联用等方法初步推测其结构。如果II期临床研究提示其在有效性和安全性方面有开发前景，应进一步进行研究，在申报生产前阐明主要代谢产物的可能代谢途径及其结构。但当多种迹象提示可能存在较强活性代谢物时，应尽早开展活性代谢产物的研究，以确定开展代谢产物动力学试验的必要性。 7．对药物代谢酶活性的影响 对于创新药，应观察药物对细胞色素P450同工酶的诱导或抑制作用。在临床前阶段可以用底物法观察对动物和人肝微粒体P450酶的抑制作用，比较种属差异。药物对酶的诱导作用可观察整体动物多次给药后的肝P450酶或在药物反复作用后的肝细胞（最好是人肝细胞）P450酶活性的变化。这可以帮助我们了解该药物是否存在潜在的代谢相互作用。 三、数据处理与分析 应提供各项实测具体数据，说明数据处理的统计方法。如用计算机处理数据，应指出所用程序的名称。 四、结果与评价 对所获取的数据进行科学和全面的分析。应对药物在动物体内的药代动力学特点进行综合性论述：包括吸收、分布和消除的特点；经尿、粪和胆汁的排泄情况；与血浆蛋白结合的程度；并提供药物在体内蓄积的程度及主要蓄积的器官或组织；如为创新药，还应阐明其在体内的代谢、消除过程及物质平衡情况。 在评价的过程中注意进行综合评价，即把药代动力学特点与药物的制剂选择、有效性和安全性进行横向联系，找出其中的相关性，以为药物的整体评价和临床研究提供更多有价值的信息。 第三节 新药临床药代动力学研究 一、新药临床药动学评价的目的与内容 新药的临床研究分为四期，即I期、II期、III期和IV期。其中I期即新药在临床前研究工作结束后，首次在人体上进行药物试验的阶段，目的是观察药物在人体内的药效学和药动学评价。前者是研究药物对人体的作用，即人体的耐受程度试验；后者即新药的临床药动学，由此可见新药的临床药动学研究在整个新药临床研究中占有十分重要的地位。 临床药动学的研究内容主要评价药物在少量正常健康志愿者体内的吸收速率和程度、在体内重要器官（如肝、肾、心血管、胃肠道、内分泌系统）的分布和维持情况、代谢、排泄的速率和程度等。其目的是评估药物到达具有疗效的血药浓度范围的时间和持续时限及其与效应间的对应关系，拟定合理的给药方案，为后续的新药临床试验和应用提供重要的依据。 临床药动学研究作为临床试验的内容之一，在我国必须遵守《中华人民共和国药品管理法》、《新药审批办法》和《中国药物临床试验管理 规范 编程规范下载gsp规范下载钢格栅规范下载警徽规范下载建设厅规范下载 》（即中国的GCP）。其中GCP着重强调了对受试者的权益保护，如必须有专业人员和非专业人员组成的伦理委员会对试验方案进行审阅和批复，保证试验参加人员、试验方案、受试者的选用及报酬/补偿的合理性；受试者在试验前必须签订知情同意书等。 二、新药临床药动学评价的基本方法 临床药动学研究应由有经验的临床药理研究人员和有经验的医师根据临床前研究结果进行设计和试验。 （一）受试者 以正常成年人进行试验，试验前后进行体格检查，受试者最好是男女相等；例数一般为10~30例。也有直接在患者身上进行的，例如治疗艾滋病或癌症的化疗药物，药物本身含有一定毒性或严重副反应，施于正常健康志愿者身上有违医疗道德。治疗癌症的化疗药物I期研究的原则是征集最少数量患者进行。 （二）受试剂量的确定 由于整个试验是从小剂量到大剂量进行的，所以选择初试剂量必须十分慎重。首先以保证安全为 准则 租赁准则应用指南下载租赁准则应用指南下载租赁准则应用指南下载租赁准则应用指南下载租赁准则应用指南下载 ，应参考动物的试验剂量如ED50、LD50、长毒剂量和药动学参数，拟定一个预测剂量和最大剂量（一般等于临床应用该类药物的最大剂量），然后以这个预测剂量的分数剂量（<1/10预测剂量）作为初始剂量，从初始剂量到最大剂量间分几个剂量级别。若达到了最大剂量仍无毒性反应出现即可终止试验。如在剂量递增过程中出现了某种不良反应，虽未达到规定的最大剂量也应终止试验。同一受试者只能接受一个剂量试验，不得参加剂量递增和累积试验。 （三）给药途径 因根据新药的药动学、药效学性质和用药目的选择给药途径，如静脉注射或口服给药等。静脉、肌内注射剂需进行静脉注射、肌内注射两种给药途径研究。单供肌内注射或口服的制剂，除进行国产样品试验外，最好与同品种的国外样品进行比较研究，以便求出相对生物利用度。无论选择何种给药途径均须准备好抢救措施。 1．分组：每种给药途径设一组。根据需要设计开放试验或盲法试验。 2．取药时间：应包括药物的吸收相、分布相、消除相等，可参考动物的药动学试验结果，也可根据与试验数据进行设计。 3．血药浓度测定：血药浓度测定方法的建立和考核可参考生物药物分析等专著或临床药动学专著。 4．数据处理：对血药浓度测定数据选择适当的方法进行处理，应得出以下几方面的结论。 （1）药物的消除动力学性质，即属线性动力学或是非线性动力学，一般以药物的消除特征及AUC与剂量的关系进行判断。 （2）模型判别，即判断药物体内过程属于何种房室模型。 （3）药物的消除途径，可通过尿药排泄量，得出尿排泄分数和肾清除率。若药物主要经过肝和肾消除，也可得出肝清除率。 （4）主要药动学参数，包括半衰期、Cmax，Tmax，Ka，K，V等。 5．I期试验药动学研究结束后，还应提供以下资料： （1）详细说明研究方法和计算公式。 （2）受试者各项检查观察记录表。 （3）II期临床试验给药方案提出建议。 第四节 药代动力学研究中常见问题与处理思路 一、药代动力学与制剂研究 药代动力学主要研究药物在体内的动态过程。药物的理化性质与上述过程密切相关，同时剂型特征、具体制剂所使用的辅料、制备工艺等也是重要的影响因素。因此在研究相应制剂时，必须结合药代动力学研究结果，利用或避开药物的某些性质。一般来说影响吸收过程的因素包括药物/制剂因素，生理因素等。前者主要包括药物的理化性质（解离常数与脂溶性、药物的溶解性质、粒度、晶型和药物在胃肠道中的稳定性等）；剂型因素（相同给药途径的不同剂型，不同给药途径等）；具体制剂的制备工艺等。如氯霉素棕榈酸盐有三种晶型和无定型，其中B晶型和无定型有效，而A、C二种晶型无效。 上述各因素同样影响药物的体内分布和代谢过程。如一些脂溶性较高的药物，容易透过血脑屏障和胎盘屏障产生不良作用；体内半衰期较长的药物，不适宜制成缓控释制剂；药物分子量大小，极性强弱影响其胆汁排泄等。另外为改变药物的体内分布情况，以满足用药需要，新的给药系统不断发展，如前体药物、脂质体、纳米给药系统、透皮给药系统、局部定位给药系统、脉冲给药系统等。 二、关于多次给药 对于半衰期长（给药间期短于4个半衰期）、有蓄积倾向且临床需长期给药的药物，应考虑进行多次给药的药代动力学研究。以下情况应考虑进行重复给药的组织分布研究： 1．受试物/代谢物在组织中的表观半衰期明显超过其血浆消除相的表观半衰期，并超过毒性研究给药间隔的两倍； 2．在重复给药的药代动力学或毒代动力学研究中，循环中的受试物/代谢物的稳态水平明显高于单次给药药代动力学预期的水平； 3．在短期毒性研究、单次给药的组织分布研究和药理学研究中观察到未预料的，而且对安全性评价有重要意义的组织病理学改变； 4．开发作为定位靶向释放的药物。 三、关于体外药代动力学研究 随着新药研发水平的不断提高，一些新的体外药代动力学研究手段也逐渐成熟起来，如：体外吸收模型（Caco-2细胞模型）、体外肝系统等。在进行药代动力学研究时，除了体内研究外，还可配合体外研究，观察动物和人肝等组织匀浆、细胞悬液、微粒体或灌流器官对药物的代谢作用。体外研究代谢途径和动力学特点比较方便，节省动物，可以获得更多的信息，例如分析代谢模式、代谢酶对药物作用的动力学参数、药物及其代谢物与蛋白、DNA等靶分子的亲和力等。这些信息对于补充说明体内研究结果，进一步阐明药理和毒理作用机制是有价值的。 四、动物选择 由于临床前药代动力学研究是联系动物研究与人体研究的重要桥梁，因此动物选择的恰当与否是该研究价值大小的关键，应尽量选择相关动物来进行研究，如口服给药的药物不宜选择食草类动物或与人胃肠道情况差异较大的动物，以免由于吸收的差异造成试验结果不能充分提示临床。对于创新药，可利用体外药代动力学手段预先对动物种属进行筛选，以选择出对药物的代谢与人体最接近的动物，提高试验结果的临床提示意义。由此，也可为毒性试验选择合适的动物种属，并对毒性试验与人体的相关性做出判断。 五、改变酸根、晶型药物 根据药物的特点、改变的具体情况和立题依据，考虑是否应进行与改变前药物比较药代动力学研究，考察其生物利用度的变化。 六、手性药物 对映异构体具有几乎相同的物理性质（旋光性除外）和化学性质（在手性环境中除外），通常需要特殊的手性技术对它们进行鉴定、表征、分离和测定，但生物系统常常很容易区分它们，并可能导致有不同的药代动力学性质（吸收、分布、代谢、排泄），以及药理学、毒理学效应的量或质的区别。 为评价单一对映体或对映体混合物的药代动力学，申报者应在药物开发前期，建立适用于体内样品对映体选择性分析的定量方法，估计对映体之间相互转化的可能性以及各自的吸收、分布、代谢和排泄。如果药品是外消旋体，且两种对映体的药代动力学性质不同，则申报者应分别监测单一对映体，获得剂量线性关系、代谢或排泄性质改变以及药物-药物相互作用对各个对映体的影响。如果证明两种对映体的药代动力学曲线相同，或对映体血浆浓度保持恒定的比值，则非手性分析或监测其中一个对映体可以满足评价的要求。 如果外消旋体已经上市，申报者希望开发单一对映体，则应测定该对映体转化为另一对映体的程度是否显著，以及该对映体单独用药是否与其作为外消旋体组分时的药代动力学性质一致。为监测对映异构体在体内的相互转化和处置，应获得单一对映体在动物体内的药物动力学曲线，并与其后在临床I期试验中获得的药物动力学曲线相比较。 七、复方药物 毒性研究提示组方后毒性较单药明显增加时，应通过复方与单药的药代动力学比较研究进一步考察其相互影响的原因。 八、药代动力学与毒代动力学 毒代动力学研究通常结合毒性研究进行，将获得的药代动力学资料作为毒性研究的组成部分，以评价全身暴露毒性。药代动力学和毒代动力学研究的目的不同，但两者又是相互联系的，其试验原理和方法是相同的，技术可以共享或相互借鉴。已获取的药代动力学参数可以为毒代和毒性试验给药方案的设计提供参考。三个剂量的药代动力学试验中，最高剂量采用接近动物最大耐受量所得到的动力学参数，对毒代动力学试验设计更有直接的参考价值。药物与血浆蛋白结合试验的结果也是估算血药浓度与毒性反应关系的依据。因为毒性反应与血中游离药物-时间曲线下面积的相关性高于总的药-时曲线下面积。代谢转化研究所提供的代谢产物资料有助于判断可能引起毒性反应的成分和毒代动力学研究应检测的成分。 参考文献 1. 秦伯益主编.新药评价概论.北京：人民卫生出版社（第二版），1998 2. 魏树礼主编.生物药剂学和药物动力学.北京：北京医科大学出版社第一版），2001 3. SFDA.药品注册管理办法（试行），2002 （邱银生） 第二十二章 生物利用度与生物等效性研究 第一节 基本概念及研究方法 药物制剂要产生最佳疗效，其药物活性成分应当在预期时间段内释放吸收并被转运到作用部位达到预期的有效浓度。大多数药物是进入血液循环后产生全身治疗效果的，作用部位的药物浓度和血液中药物浓度存在一定的比例关系，因此可以通过测定血液循环中的药物浓度来获得反映药物体内吸收程度和速度的主要药代动力学参数，间接预测药物制剂的临床治疗效果，以评价制剂的质量。 生物利用度和生物等效性研究可作为一个验证制剂质量的方法学手段。受试制剂能否达到预期的生物利用度，受试制剂是否能达到与原创制剂或其他已经过临床试验证明了安全与有效药物的生物等效，都应该从最开始的处方筛选、生产工艺条件以及质量研究等方面着手，尽可能分析原创制剂或参比制剂的有关文献，以实现研究目的。 一、生物利用度与生物等效性基本概念及应用 （一）生物利用度（Bioavailability BA） 是指药物活性成分从制剂释放吸收进入全身循环的程度和速度。一般分为绝对生物利用度和相对生物利用度。绝对生物利用度是以静脉制剂（通常认为静脉制剂生物利用度为100%）为参比制剂获得的药物活性成分吸收进入体内循环的相对量；相对生物利用度则是以其他非静脉途径给药的制剂（如片剂和口服溶液）为参比制剂获得的药物活性成分吸收进入体循环的相对量。 （二）生物等效性（Bioequivalence BE） 是指药学等效制剂或可替换药物在相同试验条件下，服用相同剂量，其活性成分吸收程度和速度的差异无统计学意义。通常意义的BE研究是指用BA研究方法，以药代动力学参数为终点指标，根据预先确定的等效标准和限度进行的比较研究。在药代动力学方法确实不可行时,也可以考虑以临床综合疗效、药效学指标或体外试验指标等进行比较性研究，但需充分证实所采用的方法具有科学性和可行性。 （三）原创药（Innovator Product） 是指已经过全面的药学、药理学和毒理学研究以及临床研究数据证实其安全有效性并首次被批准上市的药品。 （四）药学等效性(Pharmaceutical equivalence) 如果两制剂含等量的相同活性成分，具有相同的剂型，符合同样的或可比较的质量标准，则可以认为他们是药学等效的。药学等效不一定意味着生物等效，因为辅料的不同或生产工艺差异等可能会导致药物溶出或吸收行为的改变。 （五）治疗等效性(Therapeutic equivalence) 如果两制剂含有相同活性成分，并且临床上显示具有相同的安全性和有效性，可以认为两制剂具有治疗等效性。如果两制剂中所用辅料本身并不会导致有效性和安全性问题，生物等效性研究是证实两制剂治疗等效性最合适的办法。如果药物吸收速度与临床疗效无关,吸收程度相同但吸收速度不同的药物也可能达到治疗等效。而含有相同的活性成分只是活性成分化学形式不同（如某一化合物的盐、酯等）或剂型不同（如片剂和胶囊剂）的药物制剂也可能治疗等效。 （六）基本相似药物（Essentially similar product） 如果两个制剂具有等量且符合同一质量标准的药物活性成分，具有相同剂型，并且经过证明具有生物等效性,则两个制剂可以认为是基本相似药物。从广义上讲，这一概念也应适用于含同一活性成分的不同的剂型，如片剂和胶囊剂。与原创药基本相似药物是可以替换原创药使用的。 （七）BA和BE研究中常见名词 1．介质效应：由于样品中存在干扰物质,对响应造成的直接或间接的影响。 2. 标准样品(Standard Sample)：在生物介质中加入已知量分析物配制的样品，用于建立标准曲线，计算质控样品和未知样品中分析物浓度。 3．质控样品（Quality Control Sample）：质控样品系将已知量的待测药物加入到生物介质中配制的样品，用于监测生物分析方法的效能和评价每一分析批中未知样品分析结果的完整性和正确性。一般配制高、中、低三个浓度的质控样品。 4．分析批（Analytical Run/Batch）：包括待测样品、适当数目的标准样品和质控样品的完整系列。由于仪器性能的改善和自动进样器的使用，一天内可以完成几个分析批，一个分析批也可以持续几天完成，但连续测量不宜超过3天。 5．高溶解度（Highly Soluble）：若药物的最大剂量能溶解在250ml或更少的pH 1～7.5的水溶液中，此药物可被认为是高溶解度的药物。250ml的量来源于标准的生物等效性研究中受试者用于服药的一杯水的量。 6．高渗透性（Highly Permeable）：渗透性的分类标准以药物在人体内的吸收程度（吸收剂量的分数，而不是系统生物利用度）为间接依据，以测定通透人体肠壁膜的量为直接依据。也可以选用能充分描述人体内的吸收程度（如体外上皮组织细胞培养法）的非人体系统。若没有资料证明药物在胃肠道内是不稳定的，以质量平衡测定法为依据，同静脉注射给药相比较为依据，当药物的吸收程度达到90%时，此药物可被认为是高渗透性的。快速溶出（Rapidly Dissolving）：利用规定的第一法装置100rpm(或二法装置50rpm)，使用900ml或少于900ml的下列每种介质测定溶出度：①0.1mol/L HCl或符合药典规定的无酶人工胃液；②pH4.5的缓冲液；③pH6.8的缓冲液或符合药典规定的无酶人工肠液。 在上述条件下，若一个口服制剂在30分钟内其标示量的85%以上完全溶出，则此药物被认为是快速溶出的。 7. 高变异性药物（Highly Variable Drug）：当某一药物的个体内变异系数（以AUC或Cmax计算的个体内变异系数）大于或等于30%时，称之为高变异药物。这种变异的增加使得对样本例数可能要求增加。 二、BA和BE在药品研发中的作用 BA和BE均是评价制剂质量的重要指标，BA强调反映药物活性成分到达体内循环的相对量和速度，是新药研究过程中选择合适给药途径和确定用药方案(如给药剂量和给药间隔)的重要依据之一。BE则重点在于以预先确定的等效标准和限度进行的比较，是保证含同一药物活性成分的不同制剂体内行为一致性的依据，是判断后研发产品是否可替换已上市药品使用的依据。 在新药研究阶段，为了确定新药处方、工艺合理性，通常需要比较改变上述因素后制剂是否能达到预期的生物利用度；开发了新剂型，要对拟上市剂型进行生物利用度研究以确定剂型的合理性，通过与原剂型比较的BA研究来确定新剂型的给药剂量，也可通过BE研究来证实新剂型与原剂型是否等效；在临床试验过程中，可通过BE研究来验证同一药物的不同时期产品的前后一致性，如：早期和晚期的临床试验用药品，临床试验用药品（尤其是用于确定剂量的试验药）和拟上市药品等。 在仿制生产已有国家标准药品时，可通过BE研究来证明仿制产品与原创药是否具有生物等效性，是否可与原创药替换使用。 药品批准上市后，如处方组成成分、比例以及工艺等出现一定程度的变更时，研究者需要根据产品变化的程度来确定是否进行BE研究，以考察变更后和变更前产品是否具有生物等效性。以提高生物利用度为目的研发的新制剂，需要进行BA研究，了解变更前后生物利用度的变化。 三、研究方法 目前推荐的生物等效性研究方法包括体内和体外的方法。按方法的优先考虑程度从高到低排列：药代动力学研究方法、药效动力学研究方法、临床比较试验方法、体外研究方法。 （一）药代动力学研究 即采用人体生物利用度比较研究的方法。通过测量不同时间点的生物样本（如全血、血浆、血清或尿液）中药物浓度，获得药物浓度-时间曲线（Concentration-Time Curve,C-T）来反映药物从制剂中释放吸收到体循环中的动态过程。并经过适当的数据，得出与吸收程度和速度有关的药代动力学参数如曲线下面积（AUC）、达峰浓度（Cmax）、达峰时间（Tmax）等，通过统计学比较以上参数，判断两制剂是否生物等效。 （二）药效动力学研究 在无可行的药代动力学研究方法建立生物等效性研究时（如无灵敏的血药浓度检测方法、浓度和效应之间不存在线性相关），可以考虑用明确的可分级定量的人体药效学指标通过效应-时间曲线（Effect-Time Curve）与参比制剂比较来确定生物等效性。 （三）临床比较试验 当无适宜的药物浓度检测方法，也缺乏明确的药效学指标时，也可以通过以参比制剂为对照的临床比较试验，以综合的疗效终点指标来验证两制剂的等效性。然而，作为生物等效研究方法，对照的临床试验可能因为样本量不足或检测指标不灵敏而缺乏足够的把握度去检验差异，故建议尽量采用药代动力学研究方法。通过增加样本量或严格的临床研究实施在一定程度上可以克服以上局限。 （四）体外研究 一般不提倡用体外的方法来确定生物等效性，因为体外并不能完全代替体内行为，但在某些情况下，如能提供充分依据，也可以采用体外的方法来证实生物等效性。根据生物药剂学分类证明属于高溶解度，高渗透性，快速溶出的口服制剂可以采用体外溶出度比较研究的方法验证生物等效，因为该类药物的溶出、吸收已经不是药物进入体内的限速步骤。对于难溶性但高渗透性的药物，如已建立良好的体内外相关关系，也可用体外溶出的研究来替代体内研究。 第二节 生物利用度与生物等效性研究技术指导原则 以药代动力学参数为终点指标的研究方法是目前普遍采用的生物等效性研究方法。一个完整的生物利用度或生物等效性研究包括生物样本分析、实验设计、统计分析、结果评价四个方面内容。 一、生物样本分析方法的建立和确证 生物样品一般来自全血、血清、血浆、尿液或其他组织，具有取样量少、药物浓度低、干扰物质多以及个体的差异大等特点，因此必须根据待测物的结构、生物介质和预期的浓度范围，建立适宜的生物样品定量分析方法，并对方法进行确证。 （一）常用分析方法 1．色谱法：气相色谱法(GC)、高效液相色谱法(HPLC)、色谱－质谱联用法（LC－MS、LC-MS-MS、GC-MS、GC-MS-MS）等，可用于大多数药物的检测。 2．免疫学方法：放射免疫分析法、酶免疫分析法、荧光免疫分析法等，多用于蛋白质多肽类物质检测。 3．微生物学方法，可用于抗生素药物的测定。生物样本分析方法的选择宜尽量选择可行的灵敏度高的方法。 （二）方法学确证（Method Validation） 建立可靠的和可重现的定量分析方法是进行生物等效性研究的关键之一。为了保证分析方法可靠，必须进行充分的方法确证，一般应进行以下几方面的考察： 1．特异性(Specificity)：特异性是指样品中存在干扰成分的情况下，分析方法能够准确、专一地测定分析物的能力。必须提供证明所测定物质是受试药品的原形药物或特定活性代谢物，生物样品所含内源性物质和相应代谢物、降解产物不得干扰对样品的测定，如果有几个分析物，应保证每一个分析物都不被干扰。应确定保证分析方法特异性的最佳检测条件。对于色谱法至少要考察6个来自不同个体的空白生物样品色谱图、空白生物样品外加对照物质色谱图（注明浓度）及用药后的生物样品色谱图反映分析方法的特异性。对于以软电离质谱为基础的检测法（LC－MS、LC-MS-MS）应注意考察分析过程中的介质效应，如离子抑制等。 2．标准曲线和定量范围（Calibration Curve）：标准曲线反映了所测定物质浓度与仪器响应值之间的关系，一般用回归分析方法（如用加权最小二乘法）所得的回归方程来评价。应提供标准曲线的线性方程和相关系数，说明其线性相关程度。标准曲线高低浓度范围为定量范围，在定量范围内浓度测定结果应达到试验要求的精密度和准确度。 配制标准样品应使用与待测样品相同生物介质，不同生物样品应制备各自的标准曲线，用于建立标准曲线的标准浓度个数取决于分析物可能的浓度范围和分析物/响应值关系的性质。必须至少用6个浓度建立标准曲线，对于非线性相关可能需要更多浓度点。定量范围要能覆盖全部待测的生物样品浓度范围，不得用定量范围外推的方法求算未知样品的浓度。建立标准曲线时应随行空白生物样品，但计算时不包括该点，仅用于评价干扰。 标准曲线各浓度点的实测值与标示值之间的偏差在可接受的范围之内时，可判定标准曲线合格。可接受范围一般规定为最低浓度点的偏差在±20%以内，其余浓度点的偏差在±15%以内。只有合格的标准曲线才能对临床待测样品进行定量计算。当线性范围较宽的时候，推荐采用加权的方法对标准曲线进行计算，以使低浓度点计算得比较准确。 3．定量下限（Lower Limit of Quantitation，LLOQ）：量下限是标准曲线上的最低浓度点，表示测定样品中符合准确度和精密度要求的最低药物浓度。LLOQ应能满足测定3～5个消除半衰期时样品中的药物浓度或能检测出Cmax的1/10～1/20时的药物浓度。其准确度应在真实浓度的80%～120%范围内，相对标准差(RSD)应小于20%。应至少由5个标准样品测试结果证明。 4．精密度与准确度(Precision and Accuracy)：精密度是指在确定的分析条件下，相同介质中相同浓度样品的一系列测量值的分散程度。通常用质控样品的批内和批间RSD 来考察方法的精确度。一般RSD应小于15%，在LLOQ附近RSD 应小于20%。 准确度是指在确定的分析条件下，测得的生物样品浓度与真实浓度的接近程度(即质控样品的实测浓度与真实浓度的偏差)，重复测定已知浓度分析物样品可获得准确度。一般应85%～115%范围内，在LLOQ附近应在80%～120%范围内。 一般要求选择高、中、低3个浓度的质控样品同时进行方法的精密度：偏差=（实测值－标示值）/标示值×100%和准确度考察。低浓度选择在LLOQ的3倍以内，高浓度接近于标准曲线的上限，中间选一个浓度。在测定批内精密度时，每一浓度至少制备并测定5个样品。为获得批间精密度应至少在不同天连续制备并测定3个合格的分析批(Analytical Run/Analytical Batch)，至少45个样品。 5．样品稳定性(Stability)：根据具体情况，对含药生物样品在室温、冰冻或冻融条件下以及不同存放时间进行稳定性考察，以确定生物样品的存放条件和时间。还应注意考察储备液的稳定性以及样品处理后的溶液中分析物的稳定性，以保证检测结果的准确性和重现性。 6．提取回收率：从生物样本基质中回收得到分析物质的响应值除以纯标准品产生的响应值即为分析物的提取回收。也可以说是将供试生物样品中分析物提取出来供分析的比例。应考察高、中、低3个浓度的提取回收率，其结果应当精密和可重现。 7．微生物学和免疫学方法确证：上述分析方法确证主要针对色谱法，很多参数和原则也适用于微生物学或免疫学分析，但在方法确中应考虑到它们的一些特殊之处。微生物学或免疫学分析的标准曲线本质上是非线性的，所以应尽可能采用比化学分析更多的浓度点来建立标准曲线。结果的准确度是关键的因素，如果重复测定能够改善准确度，则应在方法确证和未知样品测定中采用同样的步骤。 （三）方法学质控 只有在生物样本分析方法确证完成之后才能开始测定未知样品。在测定生物样品中的药物浓度时应进行质量控制，以保证所建立的方法在实际应用中的可靠性。推荐由独立的人员配制不同浓度的质控样品对分析方法进行考核。 每个未知样品一般测定一次，必要时可进行复测。生物等效性试验中，来自同一个体的生物样品最好在同一批中测定。每个分析批生物样品测定时应建立新的标准曲线，并随行测定高、中、低三个浓度的质控样品。每个浓度至少双样本，并应均匀分布在未知样品测试顺序中。当一个分析批中未知样品数目较多时，应增加各浓度质控样品数，使质控样品数大于未知样品总数的5%。质控样品测定结果的偏差一般应小于15%，低浓度点偏差一般应小于20%，最多允许1/3的质控样品结果超过上述限度，但不能出现在同一浓度质控样品中。如质控样品测定结果不符合上述要求，则该分析批样品测试结果作废。 浓度高于定量上限的样品，应采用相应的空白介质稀释后重新测定。对于浓度低于定量下限的样品，在进行药代动力学分析时，在达到Cmax以前取样的样品应以零值计算，在达到Cmax 以后取样的样品应以无法定量（Not Detectable, ND）计算，以减小零值对AUC 计算的影响。 （四）分析数据的记录与保存 分析方法的有效性应通过实验证明。在临床报告中，应提供完成这些实验工作的相关的详细资料。建立一般性和特殊性标准操作规程、保存完整的实验记录是分析方法有效性的基本要素。生物分析方法建立中产生的数据和质控样品测试结果应全部记录并妥善保存，并提供足够的可供评价的方法学建立和样品分析的数据。至少应当提供的数据包括： 1．方法建立的数据：分析方法的详细描述；仪器设备、分析条件；该方法所用对照品（被测药物、代谢物、内标物）的纯度和来源；描述测定特异性、准确度、精密度、回收率、定量限、标准曲线的实验并给出获得的主要数据列表；列出批内批间精密度和准确度的详细结果；描述稳定性考察及相关数据；根据具体情况提供代表性的色谱图或质谱图并加以说明。 2．样品分析的数据：样品处理和保存的情况；分析样品时标准曲线列表；用于计算结果的回归方程；各分析批质控样品测定结果综合列表并计算批内和批间精密度、准确度；各分析批包括的未知样品浓度计算结果。提供20%受试者样品测试的色谱图复印件，包括相应分析批的标准曲线和质控样品的色谱图复印件。注明缺失样品的原因，重复测试的结果。对舍弃任何分析数据和选择所报告的数据说明理由。 3．其他相关信息：项目编号、分析方法编号、分析方法类型、分析方法确证进行简化的理由、以及相应的项目计划编号、标题等。 二、实验设计 （一）单剂给药的人体生物等效性试验 1．受试者的选择： （1）受试者入选条件：受试者的选择应当尽量使个体间差异减到最小，以便能检测出制剂间的差异。试验方案中应明确入选和剔除条件。一般情况应选择男性健康受试者。特殊作用的药品，则应根据具体情况选择适当受试者。选择健康女性受试者应避免怀孕的可能性。如待测药物存在已知的不良反应，可能带来安全性担忧，也可考虑选择患者作为受试者。 年龄:一般18～40周岁，同一批受试者年龄不宜相差10岁以上。 体重：正常受试者的体重一般不应低于50kg。按体质指数(Body Mass Index ,BMI)＝体重（kg）除以身高（m）的平方（kg/m2）计算，一般应在标准体重范围内。 同一批受试者体重（kg）不宜悬殊过大，因为受试者服用的药物剂量是相同的。受试者应经过全面体检，身体健康，无心、肝、肾、消化道、神经系统、精神异常及代谢异常等病史；体格检查示血压、心率、心电图、呼吸状况、肝、肾功能和血象无异常，避免药物体内过程受到疾病干扰。根据药物类别和安全性情况，还应在试验前、试验期间、试验后进行特殊项目检查，如降糖药应检查血糖水平。 为避免其他药物干扰，试验前两周内及试验期间禁服任何其他药物。实验期间禁烟、酒及含咖啡因的饮料，或某些可能影响代谢的果汁等，以免干扰药物体内代谢。受试者应无烟、酒嗜好。如有吸烟史，在讨论结果时应考虑可能的影响。 如已知药物存在遗传多态性导致代谢差异，应考虑受试者由于慢代谢可能出现的安全性等问题。 （2）受试者例数：受试者例数应当符合统计学要求，对于目前的统计方法,18～24例可满足大多数药物对样本量的要求，但对某些变异性大的药物可能需要适当增加例数。但是。最好应在预试验的基础上根据变异系数（CV%）与把握度算得所需例数。从实际情况出发，还应招募一定数目的额外受试者，以防中途有对象退出试验造成结果分析的困难。 （3）受试者分组：必须采用随机方法分组，各组间应具有可比性。 2．随机交叉试验（双交叉试验设计）：为了消除个体差异，人体生物等效性必须采取随机交叉试验或双交叉试验设计，即标准的双处理、双周期序列的交叉设计。生物等效性研究中最常见的设计错误是没有随机交叉的自身历史对照设计和平行对照设计试验。 交叉设计是目前应用最多最广的方法，因为多数药物吸收和清除在个体之间均存在很大变异，个体间的变异系数远远大于个体内变异系数，因此生物等效性研究一般要求按自身交叉对照的方法设计。把受试对象随机分为几组，按一定顺序处理，一组受试者先服用受试制剂，后服用参比制剂；另一组受试者先服用参比制剂，后服用受试制剂。两顺序间应有足够长的间隔时间，为清洗期（Wash-out Period）。这样，对每位受试者都连续接受两次或更多次的处理，相当于自身对照，可以将制剂因素对药物吸收的影响与其他因素区分开来，减少了不同试验周期和个体间差异对试验结果的影响。根据试验制剂数量不同一般采用2×2交叉、3×3交叉等设计。如果是两种制剂比较，双处理、双周期，两序列的交叉设计是较好的选择。如试验包括3个制剂（受试制剂2个和参比制剂1个）时，宜采用3制剂3周期二重3×3拉丁方试验设计。各周期间也应有足够的清洗期。设定清洗期是为了消除两制剂的互相干扰，避免上个周期内的处理影响到随后一周期的处理中。清洗期一般不应短于7个消除半衰期。但有些药物或其活性代谢物半衰期很长时则难以按此方法设计实施，在此情况下可能需要考虑按平行组设计进行，但样本量可能要增加。而对于某些高变异性药物（Highly Variable Drug），根据具体情况，除采用增加例数的办法外，可采用重复交叉设计,对同一受试者两次接受同一制剂时可能存在的个体内差异进行测定。 3．应在空腹状态下给予待测试品和标准品制剂：原则上应隔夜空腹10小时，加上服药后禁食2小时。在某些特殊情况下，只要有充分的科学依据，亦可同意不禁食的生物利用度试验。 4．受试制剂和参比制剂(Test Product and Reference Product ,T and R) 参比制剂的质量直接影响生物等效性试验结果的可靠性，一般应选择国内已经批准上市相同剂型药物中的原创药。在无法获得原创药时，可考虑选用上市主导产品作为参比制剂，但须提供相关质量证明（如含量、溶出度等检查结果）及选择理由。若为完成特定研究目的，可选用相同药物的其它药剂学性质相近的上市剂型作为参比制剂，这类参比制剂亦应该是已上市的且质量合格的产品。参比制剂和受试制剂含量差别不能超过5%。对于受试制剂，应为符合临床应用质量标准的中试/生产规模的产品。应提供该制剂的体外溶出度、稳定性、含量或效价测定、批间一致性报告等，供试验单位参考。个别药物尚需提供多晶型及光学异构体的资料。 参比制剂和受试制剂均应注明研制单位、批号、规格、保存条件、有效期。试验结束后受试制剂和参比制剂应保留足够长时间直到产品批准上市以备查。 5．给药剂量 进行药物制剂生物利用度和生物等效性研究时，给药剂量一般应与临床单次用药剂量一致，不得超过临床推荐的单次最大剂量或已经证明的安全剂量。受试制剂和参比制剂一般应服用相等剂量，需要使用不相等剂量时，应说明理由并提供所用剂量范围内的线性药代动力学特征依据，结果可以剂量校正方式计算生物利用度。 一般情况下普通制剂仅进行单剂量给药研究即可,但在某些情况下可能需要考虑进行多次给药研究，如：①受试药单次服用后原形药或活性代谢物浓度很低，难以用相应分析方法精密测定血药浓度时；②受试药的生物利用度有较大个体差异；③药物吸收程度相差不大，但吸收速度有较大差异；④缓控释制剂：进行多次给药研究应按临床推荐的给药方案给药，至少连续3次测定谷浓度确定血药浓度达稳态后选择一个给药间隔取样进行测定，并据此计算生物利用度。 5．取样 取样点的设计对保证试验结果可靠性及药代动力学参数计算的合理性，均有十分重要的意义。通常应有预试验或参考国内外的药代文献，为合理设计采样点提供依据。应用血药浓度测定法时，一般应兼顾到吸收相、平衡相（峰浓度）和消除相。在药物浓度—时间曲线各时相及预计达峰时间前后应有足够采样点，使浓度—时间曲线能全面反应药物在体内处置的全过程。服药前应先取空白血样。一般在吸收相部分取2～3个点，峰浓度附近至少需要3个点，消除相取3～5个点。尽量避免第一个点即为Cmax，预试验将有助于避免这个问题。采样持续到受试药原形或其活性代谢物3～5个半衰期时，或至血药浓度为Cmax的1/10～1/20,AUC0-t/AUC0-∞通常应当大于80%。对于长半衰期药物，应尽可能取样持续到足够比较完整的吸收过程，因为末端消除项对该类制剂吸收过程的评价影响不大。多次给药研究中，对于一些已知生物利用度受昼夜节律影响的药物，则应该连续24h取样。 当受试药不能用血药浓度测定方法进行生物利用度检测时，若该药原形或活性代谢物主要由尿排泄（大于给药剂量的70%），可以考虑尿药法测定，以尿样中药物的累积排泄量来反映药物摄入量。试验药品和试验方案应当符合生物利用度测定要求。尿样的收集采用分段收集法,其采集频度、间隔时间应满足估算受试药原形药或活性代谢物经尿的排泄程度。但该方法不能反映药物吸收速度，误差因素较多，一般不提倡采用。某些药物在体内迅速代谢无法测定生物样品中原形药物，也可采用测定生物样品中主要代谢物浓度的方法，进行生物利用度和生物等效性试验。 6．血样采取的频度：采样频度的基本要求是能足够清楚地显示血药浓度-时间曲线的上升相和下降相，要能据此估算血药峰值浓度，要能据此计算时间段为3～5个消除半衰期的药时曲线下面积。整个试验期内一般取样10～15次，可安排在吸收相及分布相采样2～3次，在消除相采样4～10次。 7．如果应用尿药排泄来观察生物等效性，取尿样的频度必须足以估算活性药物或其代谢产物的尿中排泄速率和程度。 8．两次给药或两个研究周期之间的间隔，即“洗净”时间，必须至少为活性药物或代谢产物消除半衰期的5倍以上。 （二）多次给药的生物利用度试验 在下列情况下应考虑采用对次给药以评价两种制剂的生物利用度： 1．两种制剂的吸收程度没有显著差异，但吸收速率有较大不同。 2．单次给药的结果表明该药的生物利用度有极显著的个体差异。 3．单次给药后血中活性药物及代谢产物的浓度太低，以致不能被精确地分析定量。 4．所试制剂或药品为控释制剂。 5．具有非线性动力学特性的药物。 如采用多次给药方案，应在达到稳态后进行测定。根据稳态过程中任何一个给药间隔内，药时曲线下面积相等的原理，可以据此计算F值并比较两种制剂的生物等效性。由于稳态是整个用药间隔中的血药浓度较高，对分析方法的灵敏度、准确度的要求较易达到，故较易于进行。 上述随机交叉试验的基本原则被扩展用于比较多种制剂的生物利用度，即若干种待测品同时与一种参比标准品作生物等效性试验。 （三）研究过程标准化 整个研究过程应当标准化，以使得除制剂因素外，其他各种因素导致体内药物释放吸收差异减少到最小，包括受试者的饮食、活动都应控制。试验工作应在I期临床试验观察室进行。受试者应得到医护人员的监护。受试期间发生的任何不良反应，均应及时处理和记录，必要时停止试验。 三、数据处理及统计分析 （一）数据表达 BA和BE研究必须提供所有受试者各个时间点受试制剂和参比制剂的药物浓度测定数据、每一时间点的平均浓度（Mean）及其标准差（SD）和相对标准差（RSD），提供每个受试者的浓度—时间曲线（C-T曲线）和平均C-T曲线以及C-T曲线各个时间点的标准差。不能随意剔除任何数据。脱落者的数据一般不可用其他数据替代。 （二）药代动力学参数 一般用非房室数学模型分析方法来估算药代动力学参数。用房室模型方法估算药代参数时，采用不同的方法或软件其值可能有较大差异。研究者可根据具体情况选择使用，但所用软件必须经确证并应在研究报告中注明所用软件。在生物等效性研究中，其主要测量参数Cmax和Tmax均以实测值表示。AUC0→t以梯形法计算，故受数据处理程序影响不大。 1．单次给药的BA和BE研究，提供所有受试者服用受试制剂和参比制剂的AUC0→t，AUC0→∞、Cmax、Tmax、t1/2、CL、Vd、F等参数及其平均值和标准差。Cmax和Tmax均以实测值表示。AUC0→t以梯形法计算；AUC0→∞按公式计算：AUC0→∞＝AUC0→t＋Ct/λz（t为最后一次可实测血药浓度的采样时间；Ct为末次可测定样本药物浓度；λz 系对数浓度-时间曲线末端直线部份求得的末端消除速率常数，可用对数浓度-时间曲线末端直线部分的斜率求得；t1/2 用公式t1/2＝0.693／λz计算。 以各个受试者受试制剂（T）和参比制剂（R）的AUC0→t按下式分别计算其相对生物利用度（F）值： 当受试制剂和参比制剂剂量相同时：F＝AUCT/AUCR×100% 受试制剂和参比制剂剂量不同时，若受试药物具备线性药代动力学特征，可按下式以剂量予以校正：F＝(AUCT×DR/AUCR×DT)×100%（AUCT、AUCR分别为T和R的AUC；DR、DT分别为T和R的剂量）。 2．多次给药的BA和BE研究 提供受试制剂和参比制剂的三次谷浓度数据（Cmin），达稳态后的AUCss Css-max、Css-min、Tss-max、t1/2、F、DF等参数。当受试制剂与参比制剂剂量相等时，F值按下式计算：F＝AUCssT/AUCss R×100%（式中AUCss T 和AUCss R 分别为T和R稳态条件下的AUC）。 （三）统计分析 1．对数转换 评价BE的药代动力学参数AUC0→t和Cmax在进行等效性检验前必须作对数转换。当数据有偏倚时经对数转换可校正其对称性。此外,统计中数据对比宜用比值法而不用差值法,通过对数转换,可实现将均值之比置信区间转换为对数形式的均值之差的计算。 2．等效判断标准 当前普遍采用主要药代参数经对数转换后以多因素方差分析（ANOVA）进行显著性检验，然后用双单侧t检验和计算90％置信区间的统计分析方法来评价和判断药物间的生物等效性。方差检验是显著性检验，设定的无效假设是两药无差异，检验方式为是与否，在P<0.05时认为两者差异有统计意义，但不一定不等效；P>0.05时认为两药差异无统计意义，但P>0.05并不能认为两者相等或相近。在生物利用度试验中，采用多因素方差分析（ANOVA）进行统计分析，以判断药物制剂间、个体间、周期间和服药顺序间的差异。在生物等效性实验中，方差分析可提示误差来源，为双单侧t检验计算提供了误差值（MSE）。双单侧t检验及（1－2α）%置信区间法是目前生物等效检验的唯一标准。双向单侧t 检验是等效性检验，设定的无效假设是两药不等效，受试制剂在参比制剂一定范围之外，在P<0.05 时说明受试制剂没有超过规定的参比制剂的高限和低限，拒绝无效假设，可认为两药等效。（1－2α）%置信区间是双单侧t 检验另一种表达方式。其基本原理是在高、低2个方向对受试制剂的参数均值与高低界值之间的差异分别作单侧t检验，若受试制剂均数在高方向没有大于等于参比制剂均数的125%（P＜0.05），且在低方向也没有小于等于参比制剂均数的80%（P＜0.05），即在两个方向的单侧t检验，都能以95%的置信区间确认没有超出规定范围，则可认为受试制剂与参比制剂生物等效。 等效判断标准，一般规定，经对数转换后的受试制剂的AUC0→t在参比制剂的80%-125%范围，受试制剂的Cmax在参比制剂的70%～143%范围。根据双单侧检验的统计量，同时求得（1－2α）%置信区间，如在规定范围内，即可有1－2α的概率判断两药生物等效。如有必要时，应对Tmax经非参数法检验，如无差异，可以认定受试制剂与参比制剂生物等效。 四、结果评价 生物等效性是指一种药物的不同制剂在相同的实验条件下，给予相同剂量，其吸收程度和吸收速度没有明显差异。故对受试制剂与参比制剂的生物等效性评价，应从药物吸收程度和吸收速度两方面进行，评价反映这两方面的3个药代动力学参数即AUC0→t、Cmax和Tmax是否符合前述等效标准。 目前比较肯定AUC 对药物吸收程度的衡量作用，而Cmax、Tmax依赖取样时间的安排，用它们衡量吸收速率有时是不够准确的，不适合用于具有多峰现象的制剂及个体变异大的实验。故在评价时，若出现某些不等效特殊情况，需具体问题加以具体分析。对于AUC，一般要求90%可信区间在80%～125%范围内。对于治疗窗窄的药物，这个范围可能应适当缩小，而在极少数情况下，如果经临床证实合理的情况下，也可以适当放宽范围。对Cmax也是如此。而对于Tmax，一般在释放快慢与临床疗效和安全性密切相关时需要统计评价，其等效范围可根据临床要求来确定。 对于出现受试制剂生物利用度高于参比制剂的情况，即所谓超生物利用度Suprabioavailability），可以考虑两种情况：①参比制剂是否本身生物利用度低的产品，因而受试制剂表现出生物利用度相对较高；②参比制剂质量符合要求，受试制剂确实超生物利用度。 结果的评价应结合研究目的出发，进行生物等效性评价的目的提供两制剂可替换使用的依据；进行生物利用度研究，则主要分析获得的相对生物利用度数值进一步指导确定新剂型的临床使用剂量。 五、群体生物等效性和个体生物等效性 目前均采用平均生物等效性（Average Bioequivalence,ABE）评价方法，药物生物等效性的统计推断是以受试制剂和参比制剂生物利用度参数平均值为考察指标的,从他们的样本均数推断总体均数是否等效。由于平均生物等效性只考虑参数平均值,未考虑变异及分布,不能保证个体间生物利用度相近,对低变异和高变异药物设置的生物等效性标准一样。因此也有提出群体等效性（Population Bioequivalence, PBE）和个体生物等效性（Individual Bioequivalence, IBE）的概念。 PBE评价的目的是为了获得某仿制药应用于人群的效果，不但要对被比较制剂均值的差别进行检验，还要比较被比较制剂的群体变异。IBE评价除了比较均值的差别，还要比较个体内变异、个体和制剂间的交互作用，从而判断患者换用其它药物后是否合适。 因为目前对PBE和IBE评价方法经验有限，而且目前大多数药物运用ABE 评价方法可以满足要求，因此暂不对此提出要求。建议结合申报品种考虑，参照相关文献选择适宜的评价方法。 六、临床生物利用度研究报告内容 为了满足评价的需求，一份生物等效性研究临床报告内容至少应包括以下内容： 1．实验目的。 2．生物样本分析方法的建立和考察的数据，提供必要的图谱。 3．详细的实验设计和操作方法，包括全部受试者的资料、样本例数、参比制剂、给药剂量、服药方法和采样时间安排。 4．原始测定未知样品浓度全部数据，每个受试者药代参数和药时曲线。 5．采用的数据处理程序和统计分析方法以及详细统计过程和结果。 6．服药后的临床不良反应观察结果，受试者中途退出和脱落记录及原因。 7．生物利用度或生物等效性结果分析以及讨论。 8．参考文献。正文前应有简短摘要。 9．正文末，应注明实验单位、研究负责人、参加实验人员，并签名盖章，以示对研究结果负责。 第三节 特殊制剂生物利用度研究 一、口服缓（控）释制剂 缓（控）释制剂因为采用了新技术改变了其体内释放吸收过程，因此必须进行生物利用度比较研究以证实其缓（控）释特征，但在实验设计和评价时与普通制剂都有不同。一般要求应在单次给药和多次给药达稳态两种条件下进行。由于缓（控）释制剂释放时间长，可能受食物影响大，因此必要时还应考虑食物对吸收的影响。 （一）单次给药试验 旨在比较受试者于空腹状态下服用缓（控）释受试制剂与参比制剂的吸收速度和吸收程度的生物等效性，确认受试制剂的缓（控）释药代动力学特征。实验设计基本同普通制剂，给药方式应与临床推荐用法用量一致。 1．参比制剂：若国内已有相同产品上市，应选用该缓（控）释制剂相同的国内上市的原创药或主导产品作为参比制剂；若系创新的缓（控）释制剂，则以该药物已上市同类普通制剂的原创药或主导产品作为参比制剂。 2．应提供药物代谢动力学参数：同样应提供①各受试者受试制剂与参比制剂的不同时间点生物样品药物浓度，以列表和曲线图表示；②计算各受试者的药代动力学参数并计算均值与标准差：AUC0→t、AUC0→∞、Cmax、Tmax、F值，并尽可能提供其它参数如平均滞留时间（MRT）等体现缓（控）释特征的指标。 3．结果评价：缓（控）释受试制剂单次给药的相对生物利用度估算同普通制剂。如缓（控）释受试制剂与缓（控）释参比制剂比较，如AUC、Cmax、Tmax均符合生物等效性统计学要求，可认定两制剂于单次给药条件下生物等效；若缓（控）释受试制剂与普通制剂比较，一般要求AUC不低于普通制剂80%，而Cmax明显降低，Tmax明显延迟，即显示该制剂具缓释或控释动力学特征。 （二）多次给药试验 旨在比较受试制剂与参比制剂多次连续用药达稳态时，药物的吸收程度、稳态血药浓度和波动情况。 1．给药方法：按临床推荐的给药方案连续服药的时间达7个消除半衰期后，通过连续测定至少3次谷浓度（谷浓度采样时间应安排在不同日的同一时间内），以证实受试者血药浓度已达稳态。达稳态后参照单次给药采样时间点设计，测定末次给药完整血药浓度--时间曲线。 以普通制剂为参比时，普通制剂与缓（控）释制剂应分别按推荐临床用药方法给药（例如普通制剂每日2次，缓（控）释制剂每日1次），达到稳态后，缓（控）释制剂选末次给药，参照单次给药采样时间点设计，然后计算各参数，而普通制剂仍按临床用法给药，按2次给药的药时曲线确定采样时间点，测得AUC是实际2次给药后的总和，稳态峰浓度、达峰时间及谷浓度可用2次给药的平均值。如用剂量调整公式计算AUC（如以1次给药AUC的2倍计），将会使测得的AUC值不能准确反映实际AUC值。 2．应提供的药代动力学参数与数据：①各受试者缓（控）释受试制剂与参比制剂不同时间点的血药浓度数据以及均数和标准差；②各受试者末次给药前至少连续3次测定的谷浓度（Cmin））；③各受试者在血药浓度达稳态后末次给药的血药浓度-时间曲线。稳态峰浓度（Css-max）、达峰时间（Tmax）及谷浓度（Css-min）的实测值。并计算末次剂量服药前与达τ时间点实测Css-min的平均值；④各受试者的稳态药时曲线下面积（AUCss）、平均稳态血药浓度（Cav）。Cav＝AUCss／τ，式中AUCss系稳态条件下用药间隔期0－τ时间的AUC，τ是用药间隔时间；⑤各受试者血药浓度波动度（DFss）。DF＝（Cmax-Cmin）/Cav×100％。 3．结果评价：一般同缓（控）释制剂的单次给药试验的统计。当缓释制剂与普通制剂比较时，对于波动系数的评价，应结合缓释制剂本身的特点具体分析。另外，对于不同的缓（控）释剂型，如结肠定位片、延迟释放片等，还应当考虑剂型的特殊性来设计试验，增加相应考察指标以体现剂型特点。 二、特殊活性成分制剂 如活性成分为蛋白质多肽、激素、维生素、电解质等，因为存在内源性物质干扰问题以及体内降解问题，所以生物样本分析方法的确定是其重点。同样建议参照国内外相关文献针对自身品种考虑。 三、复方制剂 对复方化学药品制剂生物等效性研究，一般情况下某一成分的体内行为不能说明其它成分的体内行为，故原则上应证实每一个有效成分的生物等效性。试验设计时应尽量兼顾各个成分的特点。 参考文献 1.SFDA.化学药品制剂人体生物利用度和生物等效性研究指导原则（试行），2002. 2.中国药典2005版二部.药物人体生物利用度和生物等效性试验指导原则，附录193-197. 3.中华人民共和国药品管理法，2002 (向明、齐正)