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第七章蛋白质分离提纯.ppt

第七章蛋白质分离提纯

艾尔小茜茜
2018-09-15 0人阅读 举报 0 0 0 暂无简介

简介:本文档为《第七章蛋白质分离提纯ppt》,可适用于工程科技领域

第七章蛋白质分离纯化和表征王顺昌第一节蛋白质的酸碱性质两性电解质能与酸碱反应可解离基团主要来自侧链基团解离。PsidechainandpKa蛋白质的等电点:与氨基酸比较大小与所含酸性与碱性氨基酸数目有关。蛋白质的等离子点:在没有其它盐类干扰时蛋白质质子供体解离出来的质子数目与质子受体结合的质子数相等时的pHisoionicpoint第二节蛋白质的分子形状和大小MW一、最低分子量:按化学组成测定:微量元素法最低aa组成推断法。二、利用渗透压测定分子量利用半透膜进行测定p三、蛋白质的扩散和扩散系数扩散:由高浓度向低浓度迁移的现象谓之扩散扩散的速率可以用扩散系数来描述。扩散系数定义:当浓度梯度为一个单位时在s内通过cm面积所扩散的溶质量。关系:D与蛋白质分子的大小、形状、溶剂的粘度有关。可以用来测定蛋白质分子量四蛋白质的沉降分析概念:在超速离心场作用下蛋白质分子密度大于溶剂密度时产生沉降沉降速率与蛋白质分子大小、密度(包装)溶液的密度、粘度有关。利用超速离心机可以测定蛋白质的分子量常用方法两种:沉降速率法和沉降平衡法。沉降速率法使用超速离心机(w)蛋白质在离心场中沿旋转中心向外移动其移动速率代表蛋白质分子的沉降速率。在离心场中受到三种力即离心力浮力和摩擦力。当蛋白质以恒定速率沉降时Ff=FcFb沉降系数:在单位离心场内蛋白质的沉降速率是一个定值谓之沉降系数sedimentationcoefficient,expressedass沉降系数单位s表示蛋白质、核酸的沉降系数为xxs范围把谓之一个Svedbergunit,SHb为x即S在度下溶剂为水时的S谓之标准的沉降系数记为sw偏微分比容蛋白质cmg其中v为蛋白质偏微分比容定义为当加入g干物质于无限大体积溶液时体积增加量cacmg沉降平衡法在一定的离心力作用下蛋白质在离心管内形成浓度梯度通过测定一定梯度内蛋白质的浓度计算出分子量。式中cc代表离旋转中心x,x的蛋白质浓度。其余同Svedberg方程。五、凝胶过滤法测定分子量六、SDSPAGE七、蛋白质分子的形状:利用摩擦比即蛋白质在溶液内的摩擦系数f和理想化的非溶剂化的刚性球体的摩擦系数fG之比可以描述蛋白质分子形状ffG>,则蛋白质为不对称分子或水化分子第三节蛋白质的胶体性质、蛋白质沉淀一、蛋白质的胶体性质:蛋白质分子从尺度上看是胶体溶液。由于蛋白质分子表面亲水基团可以与水分子产生水化作用故可在表面形成水化层表面带电基团可以与水形成稳定的双电层从而使溶液保持稳定。具有胶体的丁达尔现象布朗运动、不能透过半透膜等性质。二、蛋白质的沉淀方法如下:盐析脱去水化层导致沉淀不变性中性盐有机溶剂沉淀极性有机溶剂乙醇、丙酮等脱去水化层降低介电常数导致沉淀重金属盐当pH大于pI时蛋白质带负电与重金属结合形成不溶解的盐沉淀生物碱及某些酸类沉淀单宁酸、苦味酸、三氯乙酸等蛋白质在pH<pI时带正电与酸或生物碱的带负电基团作用。加热:变性沉淀等电点沉淀在等电点时溶解度最低因为缺乏了稳定的双电层同时分子间作用力丧失。第四节蛋白质分离纯化一般原则总目标提高纯度保持活性把分离提纯过程分为前处理粗分级分离细分级分离一、前处理:破碎和抽提并把抽提液和细胞碎片分离开。二、粗分级分离:将目标蛋白与细胞其它成分及其它蛋白分离盐析等电点沉淀有机溶剂分级分离还可以使用超滤、冷冻干燥等方法进行。三、细分离:使用凝胶过滤、离子交换层析、吸附层析、亲和层析等还可以采用各种电泳的方法进行分离。结晶是非常好的方法但非常困难。就分离纯化方法而言主要根据蛋白质的分子大小、溶解度、电荷、吸附性质、与配体分子的生物学亲和力的大小等第五节蛋白质分离纯化方法一、根据分子量大小DialysisandultrafiltrationDialysis:thismethodcanseparateasolutionofproteinfromabathingsolutionbyasemipermeablemembrane,inwhichsmallmoleculesandionscanpassthroughthemembranetoequilibratebetweentheproteinsolutionandthebathingsolution与无机盐、单糖等小分子物质分开不能将不同蛋白质分开。Ultrafiltration:isanimproveddialysisprotocol,whereparticularsizerangeofmoleculescanpassthroughsizedporemembraneunderpressure密度梯度离心:在一个离心管内先使用梯度混合器形成蔗糖密度梯度加入蛋白质在离心时一定分子量的蛋白质停留在特定的密度梯度内可以分步收集。p凝胶过滤:OthernamesincludegelfiltrationchromatographyormolecularsievechromatographyFine,porousbeadscomposedofdextanpolymerssuchasSephadex,agarosesuchasSepharose,orpolyacrylamidesuchasSephacrylorBioGelP,arepackedintoachromatographycolumnTheporesizesofthebeadsapproximatethedimensionsofthemacromoleculespThetotalbedvolumeisVt,thevolumeoutsidetheporousbeadsisVo,andthevolumeinsidethebeadsisVi,thevolumeactuallyoccupiedbythebeadsmaterialisVg(typicallylessthanofVt,andthuscanbeignored,then:Vt=VoViVg=VoViWhenproteinmixturespassthroughthecolumn,theproteinmoleculespassivelydistributebetweenVoandVi,dependingtheirsizesThesizesofthemoleculeslargerthantheporessizesofthebeadswillnotenterthebeadsandthuswashedfirst(elute)TheelutionvolumeVeisequaltoVoIfaparticularmoleculecanentertheporesofthebeads,itsdistributionisgivenbythedistributioncoefficient,KD:KD=(VeVo)Vi,whereVeisspecificforaparticularmoleculeinparticularsolutionsystem二、利用溶解度、等电点沉淀:pH=pI不带电分之间静电排斥力没有倾向于彼此聚集。由于不同蛋白质具有不同的等电点故可以分离蛋白质p,Figure、盐析和盐溶在一定的浓度范围内中性盐可以增加蛋白质溶解度的现象谓之盐溶(saltingin)Figure,随着离子强度升高到一定数值时蛋白质开始下降并逐渐从溶液中沉淀出来的现象谓之盐析。饱和或半饱和硫酸铵、有机溶剂分离、温度对蛋白质溶解度的影响:多数蛋白在°C时溶解度与温度成正比但Hb在°C溶解度随温度升高而降低。°C蛋白质变得不稳定。三、根据电荷不同分离电泳:在外电场作用下蛋白质分子向与其电性相反方向移动的现象。thistechniqueisbasedonthemovementofionsinanelectricalfieldInsolution,thevelocityofthechargedmoleculeisproportionaltoitschargeqandthevoltageE,butinverselyproportionaltotheviscosityofthemediumyandd,thedistancebetweentheelectrodes最简单的是区带电泳根据支持物不同分为纸电泳和薄膜电泳粉末如淀粉、硅胶电泳细丝电泳和聚丙烯酰胺凝胶电泳。电泳装置:电源电泳槽TheelectrophoresisisperformedinaporoussupportmatrixsuchaspolyacrylamideoragroseThemainmethodsincludeSDSPAGE,isoelectricfocusingandtwodimensionalgelelectrophoresis()PAGE使用聚丙烯酰胺凝胶作为支持物圆盘、平板三个效应:浓缩效应(浓缩胶)、分子筛效应、电荷效应。蛋白质显色:氨基黑考马斯亮蓝等()SDSPAGE:SDSissodiumdodecylsulfate,ithasahydropoobictailthatstronglyreactwithpolypeptidechainsThenumberofSDSmoleculesboundbyapolypeptideisproportionaltothelengthofthepolypeptideAboutmoleculeSDSbindsAAresiduesThenegativechargesofeachSDSmoleculeoverwhelmtheintrinsicchargetheproteinmighthave,andthusdisruptsthetertiarystructureofaproteinUndersuchconditions,themobilityofaproteinisinverselyproportionaltothelogarithmoftheprotein’sMW,andcanbeusedtodeterminetheMWofaproteinMasschargeratioofdifferentproteinarealmostthesame,sothemobilityisonlydeterminedbyitMW,ie,thesmallerMW,thefasterthevelocity()Isoelectricfocusing:TheampholytesisfirstelectrophoseredthroughageltoformapHgradientinthetube,theproteinmixtureisappliedtothegelandresumeelectrophoresisTheproteinswillmigrateandstoptothepositioncorrespondingtoitsrepectivepIs()DgelelectrophoresisTheproteinmixturesubjectingtoisoelectricfocusingfirst,andthenthegelisremovedandlaidalongthetopofanSDSPAGEslab,theproteinsareelectrophoresedintotheSDSPAGE,wheretheyseparatedaccordingtosizeTheindividualproteincanbestainedandidentified离子交换层析:根据蛋白质所带电荷的不同与离子交换柱的吸附能力也不同通过改变洗脱液的pH和离子强度从而影响蛋白质和交换柱结合程度结合程度小的先被洗脱。离子交换剂:cationexchangmedianegativechargedAnionexchangemediapositivedcharged洗脱方式:溶液不变改变洗脱液的盐度和离子强度:其一采用梯度分段式改变的分段洗脱(stepwise)其二采用渐进式连续改变盐度或pH,谓之gradientelution可以采用专门的梯度混合器。Positivechargedproteinsadded四、选择性吸附利用一些吸附剂进行吸附其主要作用力是范德华力和氢键如使用羟基磷灰石活性炭、氧化铝等。通常选择的洗脱液的极性与混合物中极性最大的组分相当。羟基磷灰石:为结晶磷酸钙蛋白质中负电基团与吸附剂中钙结合对双链DNA亲和力大洗脱液往往是磷酸缓冲液增加缓冲液浓度可以把不同的蛋白组分分开也可以用于单双链DNA的分离。、疏水作用层析:吸附剂上的疏水基团与蛋白质表面疏水基团作用从而达到吸附的目的。一般把pH调节在pI附近并且在硫酸铵存在下暴露表面疏水基团通常使用降低离子强度增加pH并且使用tritonX,脂肪醇等置换剂。五、亲和层析利用蛋白质分子对配体的特有结合能力将目标蛋白从复杂的蛋白质混合物中分离出来。纯度高目前广泛用于核酸核苷酸IG受体酶等纯化。配体:把配体与琼脂糖凝胶共价连接通常在配体和凝胶之间加一个e氨基己酸当蛋白质通过层析柱时目标蛋白与配体结合被吸附其它非特异性吸附的蛋白通过洗脱液洗去再使用含相应的特异性配体的洗脱液洗脱目标蛋白。如凝集素亲和层析免疫亲和层析和金属螯合亲和层析等。第六节蛋白质含量测定和纯度分析一、含量测定凯氏定氮法双缩脲法Folin酚法(Lowry法)紫外吸收法染料结合法(Bradford)二、纯度鉴定电泳、沉降、HPLC等还可以使用N末端分析等。

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