附录Ⅸ M：
抗毒素、抗血清制品鉴别试验（酶联免疫试验）
本法系采用酶联免疫法检查抗毒素的蛋白成分。
试剂 （1）包被液（pH9.6 碳酸盐缓冲液） 称取碳酸钠 0.32g、碳酸氢钠 0.586g，加水溶解并稀释成200ml。
（2）磷酸盐缓冲液（pH7.4） 称取氯化钠 8.0g、氯化钾 0.20g、磷酸氢二钠（Na2HPO4） 1.44g、磷酸二氢钾 0.24g，加水溶解并稀释成1000ml，121℃灭菌15分钟。
（3）洗涤液（PBS-Tween20） 取聚山梨酯20 0.5ml，加磷酸盐缓冲液至1000ml。
（4）封闭液 称取牛血清白蛋白 2.0g，加洗涤液溶解，并稀释至100ml。
（5）稀释液 称取牛血清白蛋白 0.5g，加洗涤液溶解，并稀释至100ml。
（6）底物缓冲液（0.005mol/L醋酸钠-枸橼酸缓冲液） 称取醋酸钠 0.68g、枸橼酸（C6H8O7·H2O）1.05g，加水溶解并稀释至1000ml，调节pH值至3.6。
（7）底物液A 称取3, 3’,5, 5’-四甲基联苯胺0.08g，加二甲基亚砜 40ml溶解，加甲醇 60ml，混匀，加底物缓冲液100ml，避光搅拌 2小时至完全溶解，避光室温静置 4小时。
（8）底物液B 取 1.5%过氧化氢溶液 3.2ml，加底物缓冲液至 1000ml。
（9）底物液取底物液A、底物液B等体积混匀。（临用时现配）
（10）终止液 2mol/L硫酸溶液。
对照品溶液的制备 用马IgG作阳性对照，用人IgG、牛IgG、羊IgG、猪IgG作阴性对照，取对照品适量，用包被液稀释成5-10μg/ml。
供试品溶液的制备 取供试品适量，用包被液稀释成5-10μg/ml。
测定法 取供试品溶液及对照品溶液，分别以100μl/孔加至酶标板内，供试品溶液及对照品溶液均做双孔，用封口膜封好，2~8℃ 放置16~20小时；用洗涤液洗板3次；用封闭液以200μl/孔加至酶标板内，用封口膜封好，37℃放置1小时；将封闭好的酶标板用洗涤液洗板3次；用稀释液按1：2000稀释辣根过氧化物酶标记的兔抗马IgG抗体，以100μl/孔加至酶标板内，用封口膜封好，37℃放置1小时；用洗涤液洗板6次；以100μl/孔加入底物液，室温避光放置5~15分钟；以100μl/孔加入终止液终止反应。用酶标仪在450nm波长处测定吸光度A450。
结果判定 Cutoff值为最大阴性对照吸光度（平均值）的2.1倍，A450大于Cutoff值为阳性。
阳性对照的A450大于Cutoff值则试验成立，供试品A450大于Cutoff值时为阳性，表示供试品与马IgG同源。
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