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细胞培养经验谈.doc

细胞培养经验谈

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2018-09-10 0人阅读 举报 0 0 0 暂无简介

简介:本文档为《细胞培养经验谈doc》,可适用于医药卫生领域

细胞培养经验谈细胞生存所需营养和添加物·氨基酸合成蛋白质。·糖葡萄糖为主提供能量代谢。·激素很多激素具有促细胞生长作用·谷氨酰胺促进氨基酸进入细胞膜是核酸的成分。(注意:备用培基放置天后需要补充谷氨酰胺)·抗菌素青霉素单位毫升、链霉素微克毫升制霉菌素单位毫升。·微量元素·生物刺激源有些细胞须特殊刺激因子例ECGF、NGF、TGF、FGF、HGF、EGF等。·生长基质成分胶原、纤维连接蛋白、明胶、多聚赖氨酸。·细胞生长的密度依赖性单个细胞不易生长要加同种动物巨噬细胞补充密度一般用腹腔巨噬细胞ml。血清:·促细胞生长因子维生素,激素及营养物质其中的蛋白可解除脂肪酸、重金属离子、蛋白酶对细胞的毒性作用。·促进细胞贴壁。·小牛血清和胎牛血清应用最多有的血清对细胞有毒性要筛选。胎盘血清较成人血清好(胎盘血清含丰富的生长激素)·AB型血清无凝集素可广泛使用自身血清在自身细胞培养时应用较好。·马血清、鸡血清在某些细胞培养时应用。·应用:须无菌不溶血分装保存℃可用数年但不能反复冻融。应用前灭活℃min。毒性和支原体检查一般浓度无菌操作·无菌室每周用过氧乙酸加紫外线消毒一次·实验前将实验器材放入超净台同时启动风机紫外线照射分钟后消毒完毕使净化台内空气和台面构成无菌环境。·手指不能触及器材使用端若碰到要更换。减少手与器材的接触面积·一切操作都要在火焰周围进行避免手从瓶口或其他器材上方经过瓶口要经火焰消毒。·培养用液要专管专用勤换吸管防止扩大污染和交叉污染。·操作者动作要准确敏捷尽量避免空气流动。组织分离方法:·离心法:羊水胸腹水、骨髓等用细胞分离液进行密度梯度离心分离细胞。·组织切割法:无菌剥离脂肪及结缔组织用含抗菌素的培养液洗涤去血液用眼科剪剪成mm小块。·消化分离法:·a胰蛋白酶消化法:用不含Ca、Mg的PBS配成的浓度PH多用于贴附细胞传代。在做原代组织培养时可用胰酶松散组织但不得超过分钟。蛋白可吸附此酶因此被消化的细胞要先洗去培养液。·b胶原酶消化法:主要用于纤维间质多的组织、软骨组织的消化不受CaMg影响浓度-℃小时。·cEDTA消化应不含Ca、MgEDTA可与Ca、Mg结合使细胞松散。浓度%。细胞消化传代·消化液%胰蛋白酶或%胰酶含EDTA。·方法悬浮细胞采用离心法传代或直接传代法。贴壁细胞传代用酶消化法:即平衡盐溶液洗涤细胞二次加消化液以刚好覆盖细胞为宜。放入C培养箱片刻不要震摇在倒置显微镜下观察细胞消化变化大部分细胞回缩变圆间隙增大用完全培基终止消化。用湾头吸管有序的吹下瓶壁细胞。将细胞悬液混匀使成单个细胞分瓶加培养液继续培养。细胞冻存与复苏为了长期保存细胞、须冻存可存数年。·冻存液:培养液份血清份二甲基亚砜(DMSO)份。·冻存方法:冻存细胞的前一天换培养液贴壁细胞经常规消化洗涤调整细胞浓度约ml,用弹指法将细胞打散逐滴加入冷的冻存液迅速加入冻存管中ml管。做好标记℃小时℃过夜入液氮冻存。·复苏方法:备℃水一杯从液氮罐中取出所需细胞迅速放入温水中解冻待冰全部融化后加入冷完全培养液中离心洗涤两次转入培养瓶培养。天换液、传代。 细胞运输·长距离运输选择生长良好的单层细胞加培养液至瓶颈保留微量空气拧紧瓶盖用胶带封好包裹棉花放在贴身口袋即可。到达目的地吸出多于培养液(此液可继续使用)按常规培养。·短距离运输(几小时)仅留少量培养液防止细胞干燥将细胞面朝上带回。培养中细胞生长情况的识别·细胞生长贴壁细胞增殖向周围扩张互相融合连成片可见细胞隆起饱满。悬浮细胞呈圆形具有折光性大小不一细胞壁光滑透明无颗粒细胞增殖旺盛时培养液易变酸。应及时更换培养液。· 细胞死亡表现:贴壁细胞开始回缩变圆或成细丝状细胞间隙增大胞壁增厚胞内颗粒增加粗糙脱落崩溃解体。悬浮细胞无光泽胞内颗粒呈棕黑色最后液化消失。原因:污染PH不适谷氨酰胺过期血清质量不佳培养液过期和未及时换培养液胶塞烧燃产生毒物支原体污染培养器皿不干净水不纯等复杂原因。商用细胞库美国典型培养物保藏中心(AmericanTypeCultureCollection,ATCC)。地址:AmericanTypeCultureCollectionRockville,maryland,USA。ATCC网址:httpwwwatccorg中国典型培养物保藏中心(ChinaCenterTypeCultureCollectionCCTCC)地址:武汉大学生命科学院中国典型培养物保藏中心(邮政编码)联系电话:-中科院细胞库网址httpwwwcellaccncellbank。地址:上海岳阳路号中国科学院上海细胞所细胞库(邮政编码:)。联系电话:--细胞培养用品的消毒和处理·玻璃用品清洗:(新玻璃用品用盐酸浸泡)清水冲洗→洗涤剂刷→清水→干→清洁液(重铬酸钾克加水ml溶解加入HSOml)→清水→蒸馏水·塑料用品回收性清洗:清水冲洗→洗涤剂刷→清水→干→清洁液(重铬酸钾克加水ml溶解加入HSOml)小时→清水→酒精(分析纯)浸泡过夜→蒸馏水洗→℃烘干→紫外线(小时)或环氧已烷消毒。个别塑料(硬质)可磅分钟高压(放在保护性容器内)。·滤器:生物制剂均应过滤除菌。一次性滤器不能回收有大小不等规格。·橡皮塞:肥皂煮→清水洗不要用腐蚀性液体浸泡不宜高压微波煮min除菌。空气消毒:紫外线乳酸蒸气。

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