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细胞培养板的选择.doc

细胞培养板的选择

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2018-09-10 0人阅读 0 0 0 暂无简介 举报

简介:本文档为《细胞培养板的选择doc》,可适用于医药卫生领域

细胞培养板的选择细胞培养板依底部形状的不同可分为平底和圆底(U型和V型)培养孔的孔数有、、、、、、孔等根据材质的不同有Terasaki板和普通细胞培养板。具体选择时根据培养细胞的类型、所需培养体积及不同的实验目的而定。(一)平底和圆底(U型和V型)培养板的区别和选择:贴壁细胞一般用平底培养板。悬浮型细胞的培养一般用V型。U型培养板亦多用于培养悬浮型细胞。V型培养板有时用做免疫学血凝集的实验。不同型狀的板子自然有不同用途。平底的什麼類型的細胞都可用﹐但當細胞數目較少﹐如做克隆時﹐就用孔平底板﹐另外﹐做MTT等實驗時﹐無論貼壁和懸浮細胞﹐一般均用平底板。至於U或V型板﹐一般在某些特殊要求時才使用。如在免疫學方面﹐當做兩種不同淋巴細胞混合培養時﹐需要二者相互接觸以刺激﹐因此﹐一般需要U型板﹐因細胞會由於重力的作用而聚集在一個很小的範圍內。V型板的用途更少﹐一般用于細胞殺傷實驗時﹐為了使效靶細胞緊密接觸﹐常使用V型板﹐但這種試驗也可用U型板替代(加入細胞後﹐低速離心)如果是養細胞的話通常是選用平底的另外要特別注意材質標示"TissueCulture(TC)Treated"就是養細胞用的。圓底的好像沒聽說過拿來養細胞。圓底的通常是拿來做分析化學反應或是保存樣品用的因為圓底比較好將液體吸得乾淨如果用平底的就不好吸了。不過如果你是要測吸光值的話一定要買平底的才行。大部分细胞培养都用平底培养板便于镜下观测、有明确的底面积、细胞培养液面高度相对一致还便于MTT检测。圆底培养板主要用于同位素掺入的实验需要用细胞收集仪收集细胞的培养如“混合淋巴细胞培养”等。(二)问题集锦问:我看到培养板有、、、、、孔几种规格但不知道到底什么实验用哪种规格请指教。答:要根据你具体的实验要求流式一般用孔MTT一般用孔细胞爬片一般用孔等!要具体根据你实验来定!问:请问哪位高手知道Terasaki板是什么培养板与普通细胞培养板有什么区别?谢谢!!答:Terasakiplate主要是用于晶体学研究产品设计便于对晶体的观察与结构分析。有两种sitting和handingdrop两种方法两种方法应用产品的外形结构也不同。材料上选择crystalclasspolymer特殊的材料有利观察晶体结构。细胞培养板主要是PS材料。材料是treatedsufface。便于细胞贴壁生长与伸展。当然还有浮游细胞的生长材料同时还有lowbindingsurface有关更多实验材料上的应用与对材料的选择。问:我想测吸光度用酶标仪用多孔细胞培养板行吗?请问酶标板多孔细胞培养板有什么区别?答:用多空细胞培养板测吸光度肯定可以拉我们经常用它来做样品的蛋白定量和MTT检测。区别:酶标板一般要比细胞培养板贵细胞板主要做细胞培养但也可以用来测蛋白浓度酶标板包括包被板和反应板一般不能用做细胞培养它主要做免疫酶联反应后的蛋白检测它需要更高的要求还需要特定的酶标工作液。如下是个用酶标板检测冠状病毒IgMIgG抗体例子:见网站常用不同培养板的孔底面积及推荐加液量:不同孔板所加培养液的液面都不宜太深一般在mm范围结合不同孔的底面积就可算出各培养孔的适宜加液量。若加液量过多会影响气体(氧气)交换而且在搬动过程中易溢出造成污染。具体所加细胞密度依实验的目的不同灵活掌握。培养器皿  面积(cm)培养液量(ml) 细胞量孔培养板    e孔培养板    ×e孔培养板    e孔培养板    ×ecm培养皿    ×ecm培养皿    ×ecm培养皿    ×ecm培养瓶    ×ecm培养瓶  ~  ×e(一)细胞培养板的密闭和污染问题:细胞培养板的加样和操作:细胞培养板在进行细胞操作时同样遵循严格无菌的原则各项操作要保证规范、科学不对细胞的生长造成额外的影响。这其中最常见的问题就是如何保证加样后细胞的均匀和尽量减少换液对细胞生长状态的影响。问:孔培养板或培养皿的盖子都很松这样是方便了透气但是细菌、霉菌等污染物会不会也随着溜进去呢?答:盖子很松属于半开放培养这样的目的是透气(实际上是为了使培养皿外的co能够与培养皿充分交换维持培养基的pH值)。凡事有利必有弊这样当然增加了污染的可能性。此外这样还会使培养皿内的液体蒸发这对于精确定量的药物来说就显得值得注意了。所以以下二条措施是必须的a培养箱内空气必须清洁(定期紫外线照酒精擦洗尽量少开关培养箱)b培养箱内的湿度必须始终保持为(培养箱内放置无菌蒸馏水的水槽)。就好像培养皿也是一个盖倒扣的容器也不会污染。主要是因为盖子“L”型边缘产生气流负压的缘故灰尘上面才附着有微生物而气流携带的灰尘是无法通过产生负压的盖边缘的。而透气作用只是通过空气的扩散不会产生气流所以只会透气不会透菌。我使用孔板在其中的某些孔中有操作(在超净台内)而其他孔中还有细胞要培养我很担心这样会污染不知道要注意什么大家不知道有什么好的建议。在超净台内如果操作规范的话应该可以的我想你可以充分利用培养版的盖子尽量只暴露要操作的孔将其他孔用盖子盖起来。这是我的一点粗浅的见解抛砖引玉吧!使用前综合考虑一下充分使用所以的孔如果只需要使用少数的孔可以只用一边的其余用盖子盖住我习惯于先用右侧的孔(右手加样方便)。其实自己感觉只要注意无菌操作一般是不会污染的。操作时用几块玻片把板子一侧垫高不要把盖子全打开一般没问题。(二)细胞分布不均及解决办法:问:我的细胞接种培养板细胞总是聚集在周边部分该如何处理啊?我看园子里有的战友的细胞却是聚集在中间是不是板子的质量问题啊?答:请问你的细胞是如何混匀的?是滴管吹打还是振荡培养板?如果是后者而且是转圈摇匀的话很有可能由于离心力的作用使细胞甩到周边部分导致细胞中间少四周多!自己可是试试!周边一般是相对会多一点但是中间的数量也不会很少啊~~铺板的时候我也没有特异去振荡培养板。大概是板子的质量问题吧或者是不是铺板时候的细胞密度太低了?我用的corning的板。一个好办法:在你培养种板之前把培养板放入培养箱里进行几个小时的饱和后再取出种入细胞时力量要轻可采取用滴头在培养板孔的侧面慢慢加入让细胞悬液流入板孔中培养的细胞基本是均匀生长。记住千万不要用振荡器振荡否则你的细胞就会想你说得那样聚积在一起。我今天把培养板放入培养箱里几个小时适当的把细胞密度加大了一下另外多加了一点培养液今晚看细胞铺的挺好的。我认为有两种可能解决你问题的办法:加入前吹打均匀从多孔板侧边或底边缓慢加入。我在做原代培养时也遇到过这种情况我一直以为培养皿铺胶不均匀会导致这种现象因为混匀的血管段加入到培养皿中时在相差显微镜下血管段均匀分布在培养皿中h后贴壁的血管段就是周边多中间相对少些。下次我要试试hkqu战友的方法看能否改变这种现象。谢谢指点!这种现象很正常呀不知你仔细观察过没有孔直径愈小这个现象越明显我试过、孔板这种现象不可避免因为液体的附壁使得孔内培养液不是成一个液平面而是周边高就像凹镜一样而使用这两种孔板由于需要加干预等原因而不能加足量培养液使得细胞随培养液一起出现“边集”现象如果为了使孔中央也有均匀细胞而增加接种细胞数量的话这要看你需要观察何种指标如果是MTT免疫组化的话会因为细胞成层而影响结果。赞成hkqu战友的建议个人认为消化细胞时要注意吹打均匀避免细胞成团而且孔内培养液量要足够我一般接种时加足量培养液加干预时换一次液干预液加培养液量等于接种时培养液量这样的话“边集”现象会有所改观不妨一试。我想我们做课题实验的目的是为了验证或探索某些理论而不是要所谓的“好看”“美”。还记得鲁迅先生的文章《藤野先生》一文吗?我们很多年以前学过的藤野先生对鲁迅先生说得话大家不防重温一下我想这正是我们要学习的地方。我做的是空斑形成实验最好是细胞铺成均匀的一层昨天接种病毒时大部分孔都还好个别的不太均匀。现在我细胞实验也做了一段时间了但在实验中平行组的差距还是比较大。有时候一组数据大多是差不多的偏偏会跳出一个相去甚远的数据。我想应该不是我细胞加入时的问题因为我的组间差距大是出现在加样的组中而对照组的数据却相当的稳定。另外我的样品是完全均匀的液体照理应该是不会出现上述问题的。我也出现了这样的问题。我加入细胞的时候是用吸管边吹打边用一毫升的枪加入孔板中的可是组内差异仍然很大想请教一下大家加细胞的时候都有什么方法呀?我觉得有几点:细胞消化后吹打成单细胞悬液很关键!保证分板时每个孔的细胞数目是一致的!当然还有你的处理因素各个孔之间的平行也很重要比如说加药时药物稀释后混匀保证每个孔的浓度是一致的!再者加细胞和药物时要试验组和对照组一块轮流加避免加样先后顺序导致细胞密度和药物浓度的差异!!吹打已经是均匀了但是铺板孔孔总有些不均匀的哦有点爱往中间集中。而且明明计数好了铺了长一两天各个孔密度就有点不一样对检测有影响能指教一下有良策吗?如果用巴氏吸管铺的话每次吸取的量不要太多因为吸管内的细胞会自动向下沉往往第一开始几个孔细胞数多经常均匀细胞悬液加液走S型路线。如果用移液器的话tips要处理下把尖端去掉避免损伤细胞这样每一次取液对应一个孔。用tip一对一孔加入比较准确。但也要注意混匀悬液。设立平行组n要足够大(可以计算一下)。铺板后不要摇因为摇动会导致细胞向中间聚集。最好铺板一次搞定。铺板后不要做圆周的晃动做十字晃动即上下左右晃动否则会使细胞旋到当中去。移液器的枪头沿着培养板壁加就不会集中到中间了。(三)孔板接种和换液:问:我的细胞传代很正常但一种到六孔板里(不管加药和对照)总有两三个孔(随机)细胞长得不好很小像破碎了。有人遇到过这种情况吗?到底是啥原因呢?请各位指点答:可能跟你加液的温度有关。如果你细胞刚刚拿出来换液加液培养基也是从度冰箱拿出来不久很容易细胞就会冻死了。建议你最好把培养基先在培养箱里边孵育min先。另外跟你细胞的生长状态也有关。加药之前的细胞可以用高点的血清浓度培养。保证细胞状态良好。或者放在度水浴锅里孵育也可以或者是培养板本身的问题你再换换其他培养板试试看。再有可能就是细胞状态问题了种板时的血清浓度调高试一下问:最近几天我用六孔培养板接种细胞培养小时后更换培养基在更换培养基之前显微镜观察到细胞贴壁状态非常的好更换了培养基后立即用显微镜观察发现每个孔中都近乎有一半的细胞表现出近乎死亡的状态。细胞变得非常小产生大量的碎片而另一半的细胞一切正常异常细胞与正常细胞之间存在一条分水岭上半个圆是好的下半个圆就不好这是怎么一回事?答:你可以看一下是不是培养板没放水平。有一回我也出现过这种情况。你的培养液如何如果培养液过期细胞就不会贴壁。换一点新配制的培养液试一试。我也经常碰到我想可能是板的问题换一个牌子的板或换用培养瓶就没问题了。不知楼主所需换液的培养板多不多换培养基的时候如果没有注意风机的影响特别是所需换液的培养板很多时容易使细胞因风吹失水而干缩破裂。如果如此换液时应该逐个培养板进行别怕浪费吸管注意操作的效率!(四)孔板接种:问:我把细胞消化接种到孔板之后已经四天了老是每孔的中间部分长不满每天换液时都用PBS清洗第二天换液时都出现同样的情况每孔的边缘长的很好中央大量死细胞我也不知道是什么原因请各位高手仁兄给把把脉先谢过!!!!!!!!答:是中央长不满还是中央有和边缘相同密度的细胞但是大部分都是死细胞?如果是前者也许不是技术问题而是物理问题了。我是选择孔内铺盖玻片在玻片上种植。每次换液都用PBS洗必要的步骤吗?另外也有可能和细胞种类有关或者和培养液有关?我想你的培养液可能加的太少了。由于表面张力的作用培养板的边缘液体会向上走造成培养液面呈现一个凹面(就像量筒的液体凹面一样)中央的细胞正好在凹面的最低处培养液少细胞的营养不够甚至干涸掉空气中的氧气也会造成损伤即使有增值过来的细胞也会死掉。估计你的培养液里可能有贵重的“银子”(因子)啊想少用点吧结果就……:)另外检查一下培养箱底部的水是否少了如果少了箱内的空气湿度不够会造成培养液挥发加快这样即使刚加的液体不少过一段时间由于蒸发液体量会减少造成中央干涸。并且这样会改变了培养液的成分浓度造成渗透压过高。个人经验认为这是物理问题:孔板小细胞接种进去后是很难摇均匀的结果导致细胞重贴壁后呈现四周密中间稀的状况至于中间较多死细胞如果是悬浮状的话也一样是物理问题。接种后比较粗暴的碰撞似乎对摇均匀细胞有一定效果 在为多孔板培养的细胞换液时一定要注意不要把培养基吸得太干如果完全吸取很容易造成细胞干涸这样的话细胞会很快死亡。我有一段时间总是遇到这个问题一个板子中总有一两个孔出现细胞大量死亡后来发现是上面的原因。现在我做的时候如果必须把液体吸干我会一个一个空来吸取最多一次不超过孔然后马上加入液体同时在作转染时我会在吸液和加液时将风机关掉这样基本上会避免细胞死亡。同时你所说的细胞周围密而中间稀疏大约有如下原因:培养液加得太少。主要是由于液体张力的问题。细胞接种后震荡太厉害了。由于离心力作用导致细胞分布到周围。我的细胞在接种在孔板上时孔的周围细胞密集中间细胞稀少我试了很多次均如此。请问怎样操作才能使细胞分布均匀?周围细胞密集中间细胞稀少这种情况一般是种板时培养液过少液面总是呈一凹面如果液面过低孔中间就基本上没什么细胞所以种板时一定不能吝啬培养液待贴壁后可以用比较少量的培养液处理周围细胞稀少中间细胞密集:这种情况一般是种板后过于晃动特别是旋转着晃动有人才用十字方向的晃动方法使细胞分散均匀但我个人认为将细胞加入孔后用枪或移液器充分吹打混匀后就不用也不能再晃动甚至拿着孔板走路带来的震动都会让细胞往中间集中当然无论是哪种情况首先都需要保证细胞在种板时时均匀分布的即种板时的细胞悬液一定要混匀细胞分布均匀与否有一点很关键即每种细胞是有个体差异的别人的细胞操作不一定适合于你所以要靠自己摸索且找出专属于自己细胞的一套规律就我个人而言有如下经验:所有待接种的细胞悬液在种板前一定要用吸管混匀。按资料记载孔板的液体量为ml个人也觉得ml的量足矣。接种时要慢慢加样且记得轻微旋转枪头这样做对细胞均匀分布有一定效果。接种后最好直接放入培养箱让细胞适应培养板这个新的环境个人认为没有必要在室温放置一段时间。根据细胞的特性细胞均喜欢聚集在边缘生长所以我考虑到你的问题还有可能是接种时的细胞密度不够导致周边密集中间稀疏的错觉。你的拌种密度是多少?另"要慢慢加样且记得轻微旋转枪头"的意思就是:加样不能太快避免细胞在一个加样处聚集且注意在不同的部位进行加样即边加边活动枪头人为使细胞趋于均匀分布我个人觉得有一定的效果不知这次我解释清楚没有。五)孔板细胞接种换液和收集细胞问:最近我用孔培养板培养肿瘤细胞结果细胞长得不是很理想不是长得不均匀就是每个孔细胞生长速度不一样。另外镜下观察细胞轮廓很不清晰怎么调焦距效果都不好。(板子是刚拆封的。)不知道怎么回事? 答:YoushouldmakesurethatyoutrituratethecellsverywellIfthecellstendtoformclumpsuseapasteurpipetandpassthecellsseveraltimesThencountthecellusingTrypanBluePlate*^perwelldependingonyourdesireddensityUsuallyonlythewellsinthemiddleshouldbeusedforplatingcellsWellsontheedgewillhaveadecreasedvolumeofmediasoyoushouldnotaddanycellsintherebutyoustillneedtoputmediaorHOinsidethosewells 首先你要尽可能把消化细胞消化成单个细胞(不要成团)反复吹打掌握好时间(不同的细胞要摸索的)种细胞时要均匀的吸取清清的吹打一遍再吸取细胞这样也许会解决您的问题。我以前也是出现这样问题。后来就很好了!!种到孔板的细胞一定要消化成单个细胞建议用EDTA和胰酶消化。加血清后反复吹打。细胞量尽量少一点。我一般在铺板时都是用八排枪加样的感觉效果还不错。首先如楼上所说要把细胞消化的恰到好处背着光看瓶底细胞都下来后再对着瓶壁吹打几次即可。然后将细胞悬液转移到加样槽中在加样过程中要不停的轻轻晃动加样槽且在每次吸样前都吹打几次以防细胞不是均匀的分散在培养基中造成加样不均。加样时使枪头贴着孔壁缓慢加入使液体自然流满即可。都加完后平稳拿到镜下观察铺的很漂亮的。听别人说铺完后在孔板的四个角轻轻磕几下但我试过这样效果反倒不好! 我觉得你的问题可能是消化的不好我的经验希望能有帮助:、对细胞的选择要注意要选择状态好的细胞密度要选分布瓶底%为宜、消化时不要忘了用PBS(或纯的不含血清的培养基)洗一遍加%的胰酶ml消化分钟(不同的细胞有差别你要摸索)还要不时的活动让胰酶分布到每个角落之后倾去胰酶加ml培养基(我认为加血清过于粘稠不宜吹打加培养基后稀释胰酶可不考虑对细胞的损伤)吹打成单个细胞、接种时要注意细胞密度多数细胞要求的的次幂这也要摸索一下(简单:就是你种一个密度如果在你测指标时细胞没过多影响结果就行)、周边的孔不要做指标检测孔你有没有发现周边的孔的细胞天后状态就明显不好了、接种细胞调整好浓度后要一边吹细胞悬液一边接种、还有你说看不清细胞你注意到没有当把培养板那出孵箱一会培养板盖就有一层雾会影响观察细胞你是不是这个问题??问:我在孔培养板上接种的细胞很均匀但换液时我用枪加ul的培养基加入每个孔内结果在显微镜下观察周边细胞全被冲到孔中央去了而中间的细胞层叠成致密的团块请问这样的细胞对实验有影响吗有其他的好办法吗是TL前脂肪细胞要进行诱导分化成成熟脂肪细胞。所以我每次换液总把握不好。请问有谁有这方面的经验吗答:我们实验室一般用机械吸引器吸引吸引器管前面套一个ul加样器的Tip头效果不错操作在无菌台内进行。Tip头剪去尖端后灭菌使用加液时液体呈滴状滴入就不会扰动孔底的细胞了。TL前脂肪细胞不是贴壁的吗?怎么会这么容易被冲到中间去?我只听说过第一次把细胞加到孔中的时候很容易让细胞长得不均匀TL前脂肪细胞要是贴壁了不容易被冲走了吧要不然就不要用胰酶消化了呵呵!!建议:加液的时候沿着边轻轻的加入动作柔和可以避免冲动细胞去液的时候直接甩板方便快捷。去液的时候不建议直接甩板容易污染。可以剪掉tip尖不能直接冲细胞沿孔壁轻轻加入液体提前在孵箱里预热分钟有时候液体凉也会使细胞掉下来。是换完液马上就卷了还是过一会儿才卷的?我觉得这个细胞状态不好的时候是容易卷的我诱导后换维持培养液时细胞卷的很厉害原来也以为是换液造成的后来观察了一下不是。你在仔细分析一下一定是换液造成的马?一般帖壁细胞换液时即使是冲也只是一小部分破掉不会大面积掉下来的我认为。换完液马上就卷了细胞好象是一大片全掉下来拉并在浮动然后我第二天在看时就发现细胞全堆在中间我也没在意继续换液但现在是我把细胞从培养箱里拿出来肉眼就能看到每个孔中间有一个小白点我以为是污染了拿到显微镜下看又不太像自己感觉是细胞叠在一起长的太密了因为能看到很致密的细胞团而周围的细胞轮廓很清晰但不是很多为这个实验我已经铺了块孔板了真不想再这样继续盲目下去我在孔板中诱导细胞换液一般采用半量换液这样细胞就不会被冲走了至于换液的间隔与细胞有关我诱导肝细胞是隔天半量换液。如果卷得特别厉害很可能是细胞的问题建议更新细胞株。问:我的细胞对胰酶和EDTA不管用.高浓度胰酶可以但细胞存活率不高.有没有小的细胞刮匙(或者自制刮匙的方法)可以用于96孔板?(我在建细胞系非得用96孔板).谢谢! 一般情况下细胞在一次性培养瓶或培养板中贴壁较紧都不太好消化如果建系的话最好不用刮的方法还是消化比较好!消化时以下几点注意了吗?消化前用DHanks冲洗了吗?可以冲洗遍。适当增加胰酶浓度提高胰酶PH值到减少消化时间应该对细胞影响不大。消化时放入度培养箱。如果细胞还是消化不下来可加适量胶原酶有的细胞对胶原酶敏感。市场上有买细胞刮刀但是我用过的型号不适用与孔。我在做孔单克隆时一般采用酶消化法。同意上楼的说法消化前将细胞用DHanks冲洗有助与消化另外胰酶的最佳消化条件是pH度最好如果效果还是不太好的话可以采用多次消化方法。问:DHanks和PBS冲洗效果有何不同?我在胰酶消化前一直用PBS冲洗。首先DHanks和PBS冲洗细胞都可以的我两种都用过不过严格来说我认为DHanks更好因为我们的胰酶是用DHanks溶的所以用DHanks不改变胰酶的消化环境。第二个问题完全可以不用wash加入带血清的培养基之后胰酶将完全没有作用我一般都是这样做的但是如果EDTA浓度太高的话就需要wash了! 培养板的包被及相关问题:为了适应不同的实验需要可对培养板用不同的物质进行包被后使用这其中有促进细胞黏附的也有用于一些特殊检测需要的。不同的实验目的可能具体的方案亦不同根据需要灵活掌握。(一)多聚赖氨酸包被:问:我要培养原代神经细胞培养要用多聚赖氨酸铺细胞培养板请问赖氨酸液怎么配怎样铺扳子答:配制的多聚赖氨酸:首先买来sigma公司的多聚赖氨酸如是mg就需要ml三蒸水用移液管将少量三蒸水加到多聚赖氨酸的小塑料瓶中然后将溶解的多聚赖氨酸加到ml左右三蒸水中(已置烧杯中)。最后加三蒸水达ml过滤除菌分装与小瓶中即可。保存于度近期用的话可放于度冰箱内保存。注意每一小瓶的量不要太满若ml的瓶子只装ml可若太满放于度有可能会将瓶子弄碎因冻后体积增加。(我就有这个教训)另外烧杯小瓶、移液管都要灭菌处理的泡酸高压什么的。我们用的是一种用注射器过滤的过滤器一次性的。一个能最多有效过滤ml。铺板的操作:首先要在消毒实验室包括超净台紫外消度分钟。消毒后分钟进入实验室。事先准备ml三蒸水经高压灭菌处理。具体细节就不多说了。首先打开板子用消毒好的试管将的多聚赖氨酸加入每一孔中大概每孔滴吧。将板子盖好放到培养箱中(度CO)分钟。取出板子用吸管将多聚赖氨酸吸出。换吸管加入三蒸水冲洗三次即将每孔内加入三蒸水没过底多点也行。再将水吸出来。反复三次。注意换吸管要无菌操作的。最后将铺好的板子放于培养箱待用。如果你做免疫组化需要放小的玻片到孔内就在加多聚赖氨酸之前用无菌的镊子将无菌的玻片夹到孔内即可。问:PLL的分子量有万万万几种应怎样选择??谢谢:)答:我们养神经细胞用的是分子量万到万的pll。以PBS配成mgml的母液-度保存。使用时用高纯度的蒸馏水稀释成mgml的使用浓度过滤除菌以微升每平方厘米的量均匀涂于培养底物的表面室温下静置min吸除多余液体股风吹干即可。问:多聚赖氨酸包被培养板后看上去应该是什么样的??要做原代培养为了促进细胞贴壁拟用PLL包被培养板。我买的是博士德分装Sigma的ml的那种可是院子里搜了一下有人说没有做过细胞培养试验不确定能否用于细胞培养!!这怎么办不能用么?我的方法是这样的取了。ml加入毫升灭菌去离子水后分成份ml孔板里放上玻片(准备以后做免疫组化直接取片子的)一个孔一份室温分钟后吸掉液体超净台内吹干过夜。第二天DHank's液洗遍晾干紫外线照一会儿再用。请问这样做有没有硬伤??包被好后的板底及玻片应该是什么样的呢??我发现板子干了以后上面有些白点点一开始以为是水滴后来发现不是。莫非是PLL那也是不是太夸张了??请问这种现象正常否??PDL有用于组化玻片包被的不能用于细胞培养你在用前需先确定是细胞培养级的细胞培养板用PDL包被完后是看不出什么的如果有颗粒是PDL在配制是未完全溶解可看一下说明书。我包被完用无菌水洗板子-次吹干后很干净以前用PBS洗吹干后也发现有白点考虑是PBS中的盐沉淀。(二)明胶包被:问:在细胞原代培养时在培养瓶里铺明胶国产的明胶也以可用吗?它是用什么配置呢?还有怎么消毒明胶呢?请多指教谢谢!答:国产明胶不太好用明胶可以用PBS溶液溶解一般在度煮分钟趁热分装分装后放在度不要冰冻。问:明胶消毒之后可以放置多长时间?还是现配现用呢?你说的分装是指直接铺在培养瓶吗?如果不是的话放在度冰箱不是已经固定了吗?固定之后有怎么铺在培养瓶呢?因为是没做过实验所以很不明白。 答:sigma有现成的终浓度是的明胶已消毒买来即可使用方便而且不贵仅多块钱。度时明胶是胶冻状室温下放置分钟就可变成液态说明书上建议使用的包被密度是ugcm。 国产明胶就可以的用去离子水配成即可。可以一次配ml或ml。使用时取你所需量高压灭菌即可。灭菌结束取出稍凉就可以铺在培养瓶中。问:明胶包板完毕后培养皿要干燥呢还是保持湿润?答:明胶包被培养板或培养瓶小时后将明胶倒掉用培养基冲洗就可以接种细胞了。问:在园里搜索了一下关于明胶在细胞培养中的使用问题还是有很多问题大家没有详细和标准的说明现有几个具体问题请教各位战友明胶溶液配置的问题:用无菌PBS配还是用去离子水配我们实验室有国产的明胶很大一瓶的那种能不能用于细胞培养难道一定要用GIBCOML即用型的明胶使用浓度的问题:有说和的我养的是内皮细胞应该用哪种浓度呢明胶消毒的问题:有人说可以高温高压灭菌有人说应该要过滤。。。还有人说要先高压再乘热过滤不会吧到底要怎样晕啊~~~明胶包被培养瓶的问题:有人说包被后置培养箱过夜用时在弃溶掉的加PBS和培养液冲洗。。也有人说包被后吹干minmin。再加培养液冲洗即可用到底怎么个做法啊明胶包被后的培养瓶使用期的问题:包被后的培养瓶能够用多久呢有文献说包被天干天后放度保存可以在两周内使用。答:Q明胶溶液配置的问题A:用去離子水來配即可。國產的行不行要去試驗保險的就是買進口的。其實通常是買Sigma的gelatin粉末來配就好了不用買配好現成的。配好的濃縮液可分裝放度長期保存即將要用的濃縮液可放度來備用。Q明胶使用浓度的问题A:是濃縮母液的濃度使用前才取適量稀釋成來包被。Q明胶消毒的问题:A:Gelatin是用高溫高壓殺菌的其他你所說的方法也不是不能用只是沒必要。Q明胶包被培养瓶的问题A:通常是包被小時就夠了然後吸乾不需要清洗。因為你配gelatin溶液中並沒有含其他有害的物質沖洗只是多了一道沒必要的工作。包被完要清洗是Collagen才需要的。Q明胶包被后的培养瓶使用期的问题A這個我不知道但基本上是越快使用越好。由於包被的過程很快所以我都是當天包被在等的過程中可以去做其他的事包被即將完成的前分鐘就開始處理細胞等細胞收下來包被也就做好了馬上就用。 的明胶适合大多数细胞培养时的包被在四度放置不会出现凝胶状。我参考的文献说内皮细胞用%的明胶包被也就是母液它在四度放置时会适度凝结。我的内皮细胞用%的明胶包被效果我觉得还不错。不管你用包被小时的方法还是包被小时的方法都最好从包被开始到使用的间隔不超过一天包被的容器放置时间越长越不好。(三)纤连蛋白((FibronectinFN)包被:因为课题需要我要养人外周血来源内皮细胞得先用humanfibronectin包被培养板。但是昨晚我看了个通宵把园子里关于FN包被培养板的帖子大致浏览了一遍反而越看越糊涂了几乎就是百家争鸣的局面:从稀释融解开始有人说不能用三蒸水要用制药用的纯水否则PH值不对会影响活力有人说用PBS有人说用加了尿素的PBS母液的浓度一般说是mgml但是买来的FN一般就是mg按这个浓度配置母液只能得到ml这么小的量如何分装啊?至于包被的浓度差异更是很大有人说各个公司的产品不一样还是以说明书上说的为准是不是这样啊?另外包被的方法有度过夜的有度过夜的有度至个小时的还有四度过夜或度至个小时的……我买的是ROCHE的mg装humanfibronectin用的是corning的孔板最后对各种方案进行了摸索结果见下面的帖子。刚刚又再看了一下浓度的问题大致归结为以下三种方案:园子里大部分战友用的还是微克毫升的浓度室温或度下放置至分钟。我请教了有的人用的是微克毫升度过夜。还有我见一篇文献《成人外周血内皮祖细胞分离和诱导分化》中南大学学报(医学版)JCentSouthUniv(MedSci) ()上面写的是微克毫升度过夜。至此产生一个疑问:是不是这几种方案都可行?浓度越高的需要的温度就越低时间就越短而最后达到的效果是一样的?如果真是这样那么以上个方案是一个比一个便宜啊那我干脆用第方案得了?第方案比第方案贵了五十倍啊!比第方案也贵了五倍。非得花那么多钱吗?FN不便宜啊!各位战友我摸索了好几次总共试验了以下方案:ugml度过夜ugml度过夜ugml室温下放置分钟至一小时ugml度过夜ugml度过夜。现在养到了第四天自我感觉贴壁效果最好的是方案而且该方案所用的FN还是方案用过一次的我把它回收了又重复利用已经经过了一次冻融按理说效果应该下降了不少了但是它的贴壁时间早细胞多而且形态比较接近长梭形还聚集形成了很多集落样的结构如下图:至于溶解分装我是用灭菌注射用水ml将其溶解为mgml然后分装为八支EP管负二十度保存。我要用人纤连蛋白包被培养板养细胞请问自己如何包被有无其他方法可替代?以μgμl的纤连蛋白(Fibronectin)于℃包被培养板过夜接种细胞就可以了。我用罗氏的Fibronectinmg瓶说明书推荐:配成ugml包被用量ug平方厘米。室温下包被分钟然后吸掉多余溶液注意培养板不能干掉包被后立即使用可用PBS冲洗但没必要。具体浓度可根据实际需要调整(~ugcm)(四)刀豆蛋白A包被:问:我现在进行胰腺细胞培养需要用刀豆蛋白A(ConcanavalinA)包被细胞培养板。却不知如何使用。想请教各位:ConA用什麽溶液溶解、多大浓度、包被需要多长时间。答:包被液:BufferA碳酸盐缓冲液(PHM)NaCOHOgNaHCO g二蒸HOml包被液:mlulNaNug抗原(ugml)每孔ul。(五)肝素化:问:如何肝素化培养皿或细胞培养板用于细胞与全血的共同培养?答:用uml的肝素湿润培养皿或板然后倾去既可。(六)病毒包被:问:我要做间接ELISA检测抗体。要先把病毒包培养板不知道怎么做!答:我也没做过但我觉得病毒事实上也是蛋白颗粒在物理性质上与普通蛋白无异因此我觉得就是一个普通蛋白的包板而已。用碳酸盐缓冲溶液。。度过夜就行。。。。。。首先将病毒用包被缓冲液稀释成最佳浓度包被四度冰箱过夜。次日用洗涤液洗涤次。再将一抗加入其中。最后加入酶标抗体。最重要的一点为防止病毒的扩散传播一般事先都灭活才包被。(七)antiCD单抗包被:问:solubleantiCD单抗包被培养板时用PH的碳酸盐缓冲液稀释请问PH的碳酸盐缓冲液的配方是什么。另外IL在培养体系中用Uml和ngml请问这如何换算。答:包被液(pH碳酸盐缓冲液):精密称取碳酸钠g碳酸氢钠g加水溶解定容至ml。Um是细胞因子的活性单位细胞因子作用于特定的靶细胞影响靶细胞的生物活性或细胞增殖动力学通过检测靶细胞的生物学活性或细胞增殖动力学变化可间接反应细胞因子水平所以生物学方法检测结果表示为相对单位或生物活性单位一般是通过与细胞因子标准品的所测结果进行对照得出生物活性单位。而ngml是一个浓度单位是通过免疫学检测方法得到的一个定量结果检测的是细胞因子以及与细胞因子有交叉抗原的细胞因子前体等常用ELISA法如多克隆抗体和单克隆抗体识别不同表位两种单抗的双抗体夹心法。由于结构和功能的不一致性以及其它因素干扰免疫学测定法和生物学测定法结果并不等同所以两种单位之间也是无法换算的。必要时可同时进行检测。一)培养板的清洗和消毒培养板一般为一次性使用尤其在接触了有毒、有害等物质后更应该处理后丢弃。但如果要反复使用则一定要进行正确的清洗和消毒以保证细胞培养的效果。问:只有紫外照射可以保证无菌吗可不可以从清洗方面做点工作答:看你什么用途了一般贴壁生长的细胞用重复利用的培养板效果不是很好因为培养板表层在生产时涂有一层促进细胞贴壁的物质在清洗后多半会失去。悬浮或是半悬浮生长的细胞还可以。我们一般是先泡酸过夜清洗干净三蒸水清洗再用无水酒精浸泡清洗再在工作台里用无菌水过一遍在盖上盖子在烘箱里烤干待烤干后打开在超净工作台里近紫外(距离紫外灯<20cm)照射半个小时以上效果很好没有污染过。其实不管老板有钱没钱我们做实验室尤其是预实验或是摸条件时我们一般都能省就省了留点钱还不如买点好试剂呢:)我们一般是先清洗干净泡酸过夜三蒸水清洗在盖上盖子在烘箱里烤干待烤干后有两种选择:、在超净台里近紫外灯(距离紫外灯<0cm)照射半个小时以上六孔板一般半个小时孔板一个小时孔板时间更长效果很好没有污染过、到放射科照Co照完了尽快用。我们这里肿瘤细胞耐性很好所以重复利用没什么问题如果原代培养比较娇贵的细胞最好用新板子也不是很贵。我们的经验是:清洗后用消毒液浸泡泡酸过夜自来水反复冲洗双蒸水冲洗三遍无尘环境晾干用之前紫外灯照射半小时以上效果很好。我们现在的穷同仁一直在应用。永久了也会变黄因此如果做mtt或比色时是不能用的在不熟悉细胞培养的时候可以先学学细胞记数熟练了用新的不过肿瘤细胞可以在旧板子上长得很好哟原代的细胞比较难养塑料的较好。紫外的穿透能力很弱板子紫外照射时是否将盖子翻过来一起照射那?还有细胞瓶紫外效果如何?板子泡酸后和瓶子一样的清洗方法清洗后度烤干然后放在工作台里(打开盖子)用紫外线照射半小时以上最好一小时或两小时盖子同时反过来照。瓶子照射没有效果要用其他方法同意楼上大家的意见。孔和孔板子在做完了后要先泡清洗计在用棉花搽洗每个孔这样有些贴壁细胞才不会有细胞碎片的残留在做mtt是很重要要不很不准的。后面就是冲洗泡酸蒸水洗紫外照射-分钟不要时间太长这样板子容易变色!但是如果是做MTT还是建议用新板子!旧板子做结果不准!泡酸时不要用刚配好的浓酸因为那样会把培养板表面促进细胞贴附的一层膜腐蚀掉细胞就无法贴壁了。用酸泡完后用自来水清洗再用蒸馏水清洗-次然后泡在%的酒精里(酒精用纯的无水乙醇)用前在紫外线下照射h。基本可保证%以上无菌用这些板做做预实验是没问题的。钴照射适合大量的板同时灭菌最好攒一箱再送去灭菌。紫外消毒适合少量的培养皿或培养板比如培养板将盖打开翻过来连同板一起在紫外下照射小时即可事先不用酒精泡。(二)方法讨论细胞培养板常用来进行不同的处理效应观察有些检测可能直接就在培养板中进行这里面有些什么样的经验或小窍门呢?.细胞培养与MTT问:做MTT时孔培养板细胞浓度该是多少?答:我觉得细胞的浓度并不需要那么精确关键是接种于每孔的细胞数就大致处于同一水平。比如我做MTT起初用的细胞浓度为ml每孔ul培养天观察发现细胞数太少各孔OD值反面难于比较。后来我换用ml结果就很好。当然细胞数也不能太多这其实取决于你细胞的生长速度生长快的细胞可接种浓度低点。这主要是使细胞增殖率不致受处理因素之外的其他因素影响比如接触抑制营养竞争。总之做MTT时细胞数应较低目的就是为了排除其他因素的影响以使每孔细胞生长情况尽可能地反映出处理因素的影响。细胞接种的浓度和你的实验目的、要求、细胞种类、处理因素的特殊要求都有关系。没有简单的每孔接种多少的一个标准。当然可以用楼上建议的浓度开始摸索。同时注意肿瘤细胞核正常细胞的生长数度也不一样前者生长快后者慢细胞数的量也有讲究。到底多少合适得根据你的实验具体要求来摸索。我做b转染时因为脂质体要求细胞融合度为曾经没孔接种过个细胞效果非常好问:我做的MTT为什么同一组的两孔差别那么大呢?做了两次都是这样!答:产生差别的原因有多种在加细胞时细胞沉淀下来导致两孔细胞数不同。我们通常用磁力转子对细胞缓慢搅拌时刻保持细胞处于悬浮状态。孔板在培养箱中由于湿度不够而培养箱由于具有一定的温度使得边缘的孔水分蒸发较快导致培养基中各种成分浓度变化增大导致细胞状态不同。对于这种现象要保证培养箱中的湿度减少开关培养箱的次数和时间。对于生长较快的细胞例如每小时到小时就传代一次的细胞应该起始浓度低一些我一般是孔板每孔加个细胞培养液每孔加ul。有些细胞生长较慢例如小时才传代一次或者是原代细胞起始浓度应高一些我一般是孔板每孔加X个细胞培养液每孔加ul。问:孔板培养板能否代替酶标板测吸光度?是可以拆成一条一条的那种好还是不可以拆的好?最好是用酶标板因为孔板的各孔透光性不一致拆成一条条的方便使用一些。MTT法计数细胞的相对数可以对孔板培养的细胞在用药物刺激后的直接计数也可以把细胞制备成细胞悬液加到孔板中然后加MTT孵育、计数。所以如果是前者必须用培养板如果是后者可以用酶标板。平底的酶标板好一些。问:我的干预因素是乳剂(白色)对结果可能会有影响吧如何才能减少这些干扰答:当然可以用如果你害怕干扰因素对实验产生影响那么建议你设定一空白调零孔如ul的培养基加上ul的药物测定的样品吸光度减去空白调零孔即可!测单一时间点的OD值直接在培养板里就是了。测不同时间点的需要在不同的培养板里。细胞在培养板里侧就是了。干扰因素可以测前离心一下。问:看到很多讨论说孔四周不做数据处理那么还是要加细胞或培养基吗?如果我把四周设为空白孔(不加细胞)作为阴性对照可以用来调零或计算抑制率不?答:可用只加培养基组作为正常对照组来计算细胞生存率=给药组MTT正常组MTT×余空可不加任何物质。  MTT不同与做ELISA需要设立空白对照、阴性对照和阳性对照这其中的空白对照一般用PBS目的是去除板底效应。实际上对于孔板的细胞培养可以采取一个方法来改变出现误差的情况就是将你的分组打乱不要让你同一组的细胞集中排在一个区域尽量打乱就可以了首先分析原因即必须知道在孔板四周做数据处理会有什么影响。因为孔板的密封性比较良好也就是说培养箱内空气中的O是透过板四周很小的空隙进入培养板的细胞代谢产生的CO也是通过四周空隙从板内排出来的。在板内外气体交换时度条件下板内的水汽也被大量带出板外。这样就会造成孔四周孔内的体积减少如果细心一点就会发现外外周孔内培养基的体积明显小于内部的体积。因此如果最外一周有细胞进行培养则会因培养基成分的浓度偏高而对细胞有影响同时也会因为体积变化在做加入药物干预实验时药物浓度偏高而对测定结果有影响。因此在具体操作时可以采用以下对策:知道原因我们可以跟据实验情况选择PBS或D-Hanks溶液因为外周加入这种成本低廉的溶液一方面可以减少内部各孔中细胞培养液中水份的损失另一方面可以做为分析染菌等突发事故的原因进行排查找到染菌源头。当然因为作MTT时你本身会做空白对照与阳性对照所以你可以完全不用管本底带来的误差了(建议你采用中间列个孔为空白对照组剩下共有组个孔正好可以做三个药每个药可设高、中、低三个浓度加细胞时你采用随机加细胞法反正孔细胞你加满就可以放心去培养了!)。.细胞培养板与ELISA问:请教各位做ELISA能否用培养板呢有什么差别呢?答:应该用ELISA试验专用板子。细胞培养板是不行的。ELISA专用板条是经过处理的要求每孔的均一性要好而细胞培养板同样经过处理但是是为了细胞更好地贴壁生长使用细胞培养板可能会造成孔与孔之间的显色没有可比性。所以细胞培养板可以做要求不严格的定性ELISA实验而其他情况应当使用正规ELISA板条。问:大家的ELisa板有没有重复利用啊我们这里重复利用但是没有洗板机就人工洗一下然后煮沸再烘干不知这样是否合理啊我感觉还是新板的效果好些还请高手指教!答:细胞培养板用于定性或要求不是很高还可以对于定量试剂最好用酶标板可以提高均一性减少差异而且强吸附酶标板还可以减少包被抗原或抗体的用量因此最好用酶标板。ELisa板一般不能重复利用。一是对板子均匀性的要求高重复使用难达到。二是不划算一块板子的试剂便宜的要几百元贵的要几千元而一块空板贵的也就几十元便宜的还不到元再将样本的价格和耗费的时间加上而得到不靠的结果你说应该如何办?洗板机不是清洗重复使用板子的而是在加样过程中为了提高自动化程度洗板子用的(洗涤是ELISA实验步骤之一)。.细胞培养板与免疫组化问:在塑料的细胞培养板上进行免疫组化应当怎样合适有没有这样的技巧?答:完全没有什么特别的只是在最后封片的时候有些不同。还有需要注意的是每一步加液体时应从培养孔的壁上轻轻加上。使液体慢慢到达孔底我第一次作时没注意到这一点到最后细胞所剩无几所以虽是细节问题但很重要。

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