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细胞培养注意事项.doc

细胞培养注意事项

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2018-09-10 0人阅读 0 0 0 暂无简介 举报

简介:本文档为《细胞培养注意事项doc》,可适用于医药卫生领域

细胞培养注意事项实验进行前无菌室及无菌操作台(laminarflow)以紫外灯照射分钟灭菌以ethanol擦拭无菌操作抬面并开启无菌操作台风扇运转分钟后才开始实验操作。每次操作只处理一株细胞株且即使培养基相同亦不共享培养基以避免失误混淆或细胞间污染。实验完毕后将实验物品带出工作台以ethanol擦拭无菌操作抬面。操作间隔应让无菌操作台运转分钟以上后再进行下一个细胞株之操作。无菌操作工作区域应保持清洁及宽敞必要物品例如试管架、吸管吸取器或吸管盒等可以暂时放置其它实验用品用完即应移出以利于气流之流通。实验用品以ethanol擦拭后才带入无菌操作台内。实验操作应在抬面之中央无菌区域勿在边缘之非无菌区域操作。小心取用无菌之实验物品避免造成污染。勿碰触吸管尖头部或是容器瓶口亦不要在打开之容器正上方操作实验。容器打开后以手夹住瓶盖并握住瓶身倾斜约°角取用尽量勿将瓶盖盖口朝上放置桌面。工作人员应注意自身之安全须穿戴实验衣及手套后才进行实验。对于来自人类或是病毒感染之细胞株应特别小心操作并选择适当等级之无菌操作台(至少ClassII)。操作过程中应避免引起aerosol之产生小心毒性药品例如DMSO及TPA等并避免尖锐针头之伤害等。定期检测下列项目:CO钢瓶之CO压力CO培养箱之CO浓度、温度、及水盘是否有污染(水盘的水用无菌水每周更换)。无菌操作台内之airflow压力定期更换紫外线灯管及HEPA过滤膜预滤网(小时预滤网小时HEPA)。水槽可添加消毒剂(Zephrin:)定期更换水槽的水请问工作浓度的胰酶是不是应保存在-度?如果放在度冰箱可以保存多久呢?是不是几个小时就会失去活性?平时放在度分装在毫升螺口管用时拿一管放度用。认真按照操作规程进行实验一般不大会导致污染很多情况下是由于所用的试剂或培养基有污染而使实验失败粉末培养基配制好后(加了血清)一般在度尽量不要超过个月如在度存放时间可长一些但最好也不要超过个月可能对于永生化细胞株来说要求不是太高但我在过去的年里一直是作原代细胞培养的细胞娇弱经验表明放置时间不宜过长。关于实验用品的清洗与消毒我的经验是:用过的玻璃器皿先在清水中浸泡min以上然后加少许清洗剂以超声波洗涤min左右(如无超声波洗涤器可用软毛刷轻轻刷洗干净)捞出晾干再在铬酸洗液中浸泡h(或过夜)后自来水清洗遍双蒸水清洗遍晾干高压消毒后即可使用。许多塑料制品也可以高压消毒例如培养瓶盖胶塞吸头等。不能用于高压的一般均已制成一次性作用的商品了当然如果money有限如进口的培养板、皿等也可以重复使用次我当时使用方法是将其完全清洁后使用前在紫外灯下敞开照射h即可我做过多次没有出现问题。塑料培养瓶由于清洗消毒不便最好不要重复使用如一定要重复用可用环氧乙烷等消毒(消毒后一定要放置半年以上方可使用)在光镜下上皮细胞通常呈“铺路石”样排布细胞之间有拉丝现象(即距离较远的细胞可以通过细长的触手相连)细胞有成片生长的特性。而间质细胞通常呈梭形没有有成片生长的特性细胞之间的联系不紧密。但是细胞的形态特征会因为生长条件的改变而改变如HeLa细胞是上皮细胞但是在酸性培养条件下会变为梭形。上皮细胞之间都有特征性的紧密连接(桥粒)结构因此可以通过观察培养细胞的超微结构来判断细胞的类型如果有紧密连接就必然是上皮细胞。这是一锤定音的证据。注意不要把细胞消化下来做电镜要用细胞刮刮下来后做电镜。此外每一种上皮细胞都有其特征的细胞角蛋白的表达(cytokertin,CK),可以查一下子宫内膜腺上皮细胞表达的CK分子然后进行免疫细胞化学的鉴定。细胞在偏碱的情况下培养耐受能力会逐渐下降可能是产生脱壁现象的原因后来我重新测了一下培养基为左右我用灭菌的HCL调了一下培养基颜色变成淡红透亮再次培养发现细胞贴壁比较好了搏动效果也不错因此我以后每次培养前都要重新调好PH值我觉得很多因素是能影响PH值的血清质量不好影响了细胞生长。所以我认为以后养细胞用的血清浓度最好是每批次血清都摸一下不一定要以参考文献为准毕竟国产的血清质量差异比较大啊。细胞无菌操作是关键对于配制培养液时有些人为了让培养粉充分溶解搅拌小时或更长时间。其实这完全没有必要一般培养基的固体组分还是易溶于水的搅拌的时间长了会增加污染机会虽然后来滤过除菌了但细菌的代谢产物比如脂多糖谁能够把它滤掉?细菌的代谢是很快的甚至在常温下min就可以繁殖一代太可怕了。我的经验就是搅拌minmin就把它过滤。另外关于培养基的pH问题一般按照说明书操作加入所说的NaHCO量与预计的pH不会有什么距离也就是说基本上不用调pH如果相差大要考虑三蒸水的质量是否有所下降当然这时调pH也是不得已而为之。我配培养基时基本上不调pH只是用试纸检测一下pH观察一下培养基的颜色。()东西一定要用自己的。既不要借别人的也不要借给别人。可能大家觉得比较自私。实际上还是很有好处的。并不是每个人的操作都规范因此相互之间串着用很容易造成交叉污染。()我习惯口对口倒液体在倒前倒后都要在酒精灯上过一下。自己认为比起用吸管吸更能很好的防止污染。步骤越简单越能防止污染。而且还能节省很多吸管。()一次将所有的所需要试剂、工具放入工作台。不要做到半路又出工作间拿东西这样增加了污染的机会。()整个操作要快、动作要轻、而且不要干其他的事情。比如手机响了最好不要接。我一般操作的时候将手机关了手机声音响起好烦躁。()我一般开紫外线照射台的时候就将培养基、酶、DHANKS液那到室外让它自然升温。这样分钟后温度也升上来了。有很多人将他放到度水浴锅里加热。一定要注意水浴锅的卫生有的常年不清洗里面很脏容易在外面瓶身上吸附大量细菌。因此用它的也一定要勤换水。从水域锅那出后最好找个毛巾插干上面的水。()操作前要洗手用酒精搽手。用完操作台要打扫卫生。细胞要经常冻存我一般只要细胞状态好就将细胞冻存起来。细胞状态差了扔掉重新复苏。这是一个必须养成的习惯。毕竟很多情况下细胞并不是因为污染了才让你感到头痛。这样你不会担心没有种子了。我一般是不加双抗的只要注意不会污染。过滤时不要用枪吹细胞!!如果用力吹,筛网就像刀片一样,把你的细胞全部切碎!!刷玻璃器皿的过程:初洗、泡酸(一天)、自来水冲洗(遍)、纯化水冲洗(遍)、注射用水冲洗(遍)。感觉过于苛刻自来水只冲洗遍。被老师发现后一阵痛批才知道这是极其关键的一步残留的酸可能会抑制细胞生长甚至导致细胞死亡痛失辛苦得来的细胞心血付之东流。无知不能无畏一定不能大意。做好准备工作。不要急于投身到细胞培养中去要先设定计划:步骤工具试剂。特别是将细胞用于大规模生产时尤其如此。eg经过干热灭菌的容器一般认为可以在一周内保持无菌状态如果准备多了用不完的就得重新灭菌耗费能源、占用灭菌空间不值得干热灭菌需要一天的时间当器皿准备不足时只能干着急错过了最佳操作时间也许得很久才能将细胞状态再调整好。对于骄气的细胞我一般都是第一天处理完后加少量培基(够盖住瓶底部)第二天换液以免死细胞和碎片对活的产生不良影响。新配的培养基直接用很清亮但是在-度保存一段时间后再溶解就要出现很多杂质用度水孵育没有效果握在手里不停摇动非常有效。其实对于操作熟练的人来说污染并不是我们想像那样容易出现园子里很多人都问否污问题而培养基的PH值往往被忽略而且大多数人都习惯于一次配制升培养基分装成Xml用瓶另外瓶放在-度保存很容易出现结晶镜下看就是一些杆状的物资有时候晃动培养基肉眼就可以看到很多沉淀这就需要我们在用之前好好摇匀了。操作中的安全:a。我犯的一个巨经典的错误至今难忘刚做时酒精擦手擦镊子湿淋淋的就拿镊子过火结果。。。。火顺着镊子着到手上虽然不怎么热可是我手上的汗毛啊都被烧了。这个错误以后再也没犯。b。过完火的试管口一定不能摸时刻记着只拿试管的下。c。给酒精灯加酒精永远记住不要拿酒精灯口那个灯心管否则终身难忘。d。当酒精灯出现什么意外时一定要镇静先让他着一会可能没事不要慌乱中打坏别的东东。e。离心机尤其高转速时配平当然要牢记可是一定要检查一下离心机里还有没有其他东东(有一次我离东西着急放进去刚离一会我就觉得声音不对打开一看里面竟然有一根别人没有拿出来的小管子)。还有一次配完平就打开离心机盖准备离心结果吓个半死原来别人正在离心幸好管子没飞出来细胞冻存:当细胞状态好或者代数比较早一定要大量冻存不要吝惜暂时的大批使用血清当细胞状态不好长不起来的时候马上取出来复苏省时省力不要去尝试努力恢复状态不好的细胞费时间也费血清会令你痛苦不堪。另外冻存的细胞不要放到一个地方-度液氮(甚至不同的液氮罐)都放一点谁也不敢保证不出意外冰箱也可能有化的时候(我们-度冰箱就化过)都放在一块容易全军覆没。按照试剂的保存标准保存象血清、胰酶等没开封的℃开封后℃保存一般不超过天(用完它吧不然浪费了)、一定要弄清楚每个组分的作用特点比如NaHCO容易分解因此培养基在过滤除菌时pH会上升一般是所以在过滤之前要把培养基的pH调低。如果你不了解NaHCO容易分解的特点就不会做相应的处理那么培养基不符和要求细胞就长不好台盼蓝主要用来鉴定原代培养细胞时,细胞分离后的存活情况用台盼蓝直接染色分钟在显微镜下观察即可活细胞不被染色。方便易用因此在实验室中比较常用尤其在心肌细胞原代培养中。

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