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计数方法及细胞培养常见问题解答.doc

计数方法及细胞培养常见问题解答

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2018-09-10 0人阅读 举报 0 0 0 暂无简介

简介:本文档为《计数方法及细胞培养常见问题解答doc》,可适用于医药卫生领域

实验七微生物显微计数-血球计数板法  一、目的要求  .了解血球计数板的构造和使用方法。  .学会用血球计数板对酵母细胞进行计数。  二、基本原理  利用血球计数板在显微镜下直接计数是一种常用的微生物计数方法。此法的优点是直观、快速。将经过适当稀释的菌悬液(或孢子悬液)放在血球计数板载玻片与盖玻片之间的计数室中在显微镜下进行计数。由于计数室的容积是一定的(.mm)所以可以根据在显微镜下观察到的微生物数目来换算成单位体积内的微生物总数目。由于此法计得的是活菌体和死菌体的总和故又称为总菌计数法。  血球计数板通常是一块特制的载玻片其上由四条槽构成三个平台。中间的平台又被一短横槽隔成两半每一边的平台上各刻有一个方格网每个方格网共分九个大方格中间的大方格即为计数室微生物的计数就在计数室中进行。计数室的刻度一般有两种规格一种是一个大方格分成个中方格而每个中方格又分成个小方格另一种是一个大方格分成个中方格而每个中方格又分成个小方格。但无论是哪种规格的计数板每一个大方格中的小方格数都是相同的即×=小方格。  每一个大方格边长为mm则每一大方格的面积为mm盖上盖玻片后载玻片与盖玻片之间的高度为.mm所以计数室的容积为.mm。  在计数时通常数五个中方格的总菌数然后求得每个中方格的平均值再乘上或就得出一个大方格中的总菌数然后再换算成ml菌液中的总菌数。  下面以一个大方格有个中方格的计数板为例进行计算:设五个中方格中总菌数为A菌液稀释倍数为B那么一个大方格中的总菌数  因ml=cm=mm               =A·B(个)  同理如果是个中方格的计数板设五个中方格的总菌数为A'则       三、器材  酿酒酵母菌悬液血球计数板显微镜盖玻片无菌毛细管。  四、操作步骤  .稀释  将酿酒酵母菌悬液进行适当稀释菌液如不浓可不必稀释。  .镜检计数室  在加样前先对计数板的计数室进行镜检。若有污物则需清洗后才能进行计数。  .加样品  将清洁干燥的血球计数板盖上盖玻片再用无菌的细口滴管将稀释的酿酒酵母菌液由盖玻片边缘滴一小滴(不宜过多)让菌液沿缝隙靠毛细渗透作用自行进入计数室一般计数室均能充满菌液。注意不可有气泡产生。  .显微镜计数  静止分钟后将血球计数板置于显微镜载物台上先用低倍镜找到计数室所在位置然后换成高倍镜进行计数。在计数前若发现菌液太浓或太稀需重新调节稀释度后再计数。一般样品稀释度要求每小格内约有个菌体为宜。每个计数室选个中格(可选个角和中央的中格)中的菌体进行计数。位于格线上的菌体一般只数上方和右边线上的。如遇酵母出芽芽体大小达到母细胞的一半时即作两个菌体计数。计数一个样品要从两个计数室中计得的值来计算样品的含菌量。  .清洗血球计数板  使用完毕后将血球计数板在水笼头上用水柱冲洗切勿用硬物洗刷洗完后自行晾干或用吹风机吹干。镜检观察每小格内是否有残留菌体或其他沉淀物。若不干净则必须重复洗涤至干净为止。  五、实验报告  .结果  将结果记录于下表中。A表示五个中方格中的总菌数B表示菌液稀释倍数。  、如何选用特殊细胞系培养基?培养某一类型细胞没有固定的培养条件。在MEM中培养的细胞很可能在DMEM或M中同样很容易生长。总之首选MEM做粘附细胞培养、RPMI做悬浮细胞培养是一个好的开始。、何时须更换培养基?视细胞生长密度而定或遵照细胞株基本数据上之更换时间按时更换培养基即可。、可否使用与原先培养条件不同之培养基?不能。每一细胞株均有其特定使用且已适应之细胞培养基若骤然使用和原先提供之培养条件不同之培养基细胞大都无法立即适应造成细胞无法存活。、可否使用与原先培养条件不同之血清种类?不能。血清是细胞培养上一个极为重要的营养来源所以血清的种类和品质对于细胞的生长会产生极大的影响。来自不同物种的血清在一些物质或分子的量或内容物上都有所不同血清使用错误常会造成细胞无法存活。、何谓FBS,CS,HSFBS(fetalbovineserum)是指胎牛血清,CS(calfserum)则是指小牛血清。HS(horseserum)则是指马血清。、培养细胞时应使用或CO?或根本没有影响?一般培养基中大都使用HCOCOH作为pH的缓冲系统而培养基中NaHCO的含量将决定细胞培养时应使用的CO浓度。当培养基中NaHCO含量为每公升g时细胞培养时应使用CO当培养基中NaHCO为每公升g时则应使用CO培养细胞。、Hank's平衡盐溶液(HBS)要在空气中使用不需要CO培养箱。原因是什么?Hank's平衡盐溶液(HBS)和Earle's平衡盐溶液(EBS)有什么本质的功能差别?HBS和EBS的主要差别在于碳酸氢钠的水平,在Eagles(gL)中比在Hanks(gL)中高。碳酸氢钠需用高水平的CO平衡以维持溶液的PH值。Eagles液在空气水平的CO中溶液会变碱Hanks液在CO培养箱中会变酸。如果希望在CO培养箱中保存组织需要用Eagles液。如果仅仅是清洗将要在细胞培养基中储存的组织用Hanks液就可以了。、细胞之接种密度为何?依照细胞株基本数据上之接种密度或稀释分盘之比例接种即可。细胞数太少或稀释的太多亦是造成细胞无法生长之一重要原因。、悬浮性细胞应如何继代处理?一般仅需持续加入新鲜培养基于原培养角瓶中稀释细胞浓度即可若培养液太多时可将培养角瓶口端稍微抬高直到无法容纳为止。分瓶时取出一部份含细胞之培养液至另一新的培养角瓶加入新鲜培养基稀释至适当浓度重复前述步骤即可。、冷冻管应如何解冻?取出冷冻管后须立即放入°C水槽中快速解冻轻摇冷冻管使其在分钟内全部融化并注意水面不可超过冷冻管盖沿否则易发生污染情形。另冷冻管由液氮桶中取出解冻时必须注意安全预防冷冻管之爆裂。、细胞冷冻管解冻培养时是否应马上去除DMSO?除少数特别注明对DMSO敏感之细胞外绝大部分细胞株(包括悬浮性细胞)在解冻之后应直接放入含有ml新鲜培养基之培养角瓶中待隔天再置换新鲜培养基以去除DMSO即可如此可避免大部分解冻后细胞无法生长或贴附之问题。、附着性细胞继代时所使用之trypsinEDTA浓度?应如何处理?一般使用之trypsinEDTA浓度为trypsinmMEDTANa。第一次开瓶后应立即少量分装于无菌试管中保存于–°C避免反复冷冻解冻造成trypsin之活性降低并可减少污染之机会。、欲将一般动物细胞离心下来其离心速率应为多少转速?欲回收动物细胞其离心速率一般为xg(约,rpm)分钟过高之转速将造成细胞死亡。、细胞冷冻培养基之成份为何?动物细胞冷冻保存时最常使用的冷冻培养基是含DMSO(dimethylsulfoxide)和原来细胞生长用之新鲜培养基均匀混合之。注意:由于DMSO稀释时会放出大量热能故不可将DMSO直接加入细胞液中必须使用前先行配制完成。、DMSO之等级和无菌过滤之方式为何?冷冻保存使用之DMSO等级必须为Tissueculturegrade之DMSO(如SigmaD)其本身即为无菌状况第一次开瓶后应立即少量分装于无菌试管中保存于°C避免反复冷冻解冻造成DMSO之裂解而释出有害物质并可减少污染之机会。若要过滤DMSO则须使用耐DMSO之Nylon材质滤膜。、冷冻保存细胞之方法?冷冻保存方法一:冷冻管置于°C~分钟→(°C分钟*)→°C~小时(或隔夜)→液氮槽vaporphase长期储存。冷冻保存方法二:冷冻管置于已设定程序之可程序降温机中每分钟降°C至–°C以下再放入液氮槽vaporphase长期储存。*°C不可超过小时以防止冰晶过大造成细胞大量死亡亦可跳过此步骤直接放入°C冰箱中惟存活率稍微降低一些。、细胞欲冷冻保存时细胞冷冻管内应有多少细胞浓度?冷冻管内细胞数目一般为xcellsmlvial融合瘤细胞则以xcellsmlvial为宜。、培养基中是否须添加抗生素?除于特殊筛选系统中外一般正常培养状态下培养基中不应添加任何抗生素。、应如何避免细胞污染?细胞污染的种类可分成细菌、酵母菌、霉菌、病毒和霉浆菌。主要的污染原因为无菌操作技术不当、操作室环境不佳、污染之血清和污染之细胞等。严格之无菌操作技术、清洁的环境、与品质良好之细胞来源和培养基配制是减低污染之最好方法。、如果细胞发生微生物污染时应如何处理?原则上:直接灭菌后丢弃之。当重要的培养污染时研究者可能试图消除或控制污染。首先确定污染物是细菌、真菌、支原体或酵母把污染细胞与其它细胞系隔离开用实验室消毒剂消毒培养器皿和超净台检查HEPA过滤器。高浓度的抗生素和抗霉菌素可能对一些细胞系有毒性因而做剂量反应实验确定抗生素和抗霉菌素产生毒性的剂量水平。这点在使用抗生素如两性霉素B和抗霉菌素如泰乐菌素时尤其重要。下面是推荐的确定毒性水平和消除培养污染的实验步骤。()在无抗生素的培养基中消化、计数和稀释细胞稀释到常规细胞传代的浓度。()分散细胞悬液到多孔培养板中或几个小培养瓶中。在一个浓度梯度范围内把选择抗生素加入到每一个孔中。例如两性霉素B推荐下列浓度,mgml。()每天观测细胞毒性指标如脱落出现空泡汇合度下降和变圆。()确定抗生素毒性水平后使用低于毒性浓度~倍浓度的抗生素的培养液培养细胞~代。()在无抗生素的培养基中培养细胞一代。()重复步骤。()在无抗生素的培养基中培养~代确定污染是否以已被消除。、支原体(mycoplasma)污染的细胞是否能以肉眼观察出异状?不能。除极有经验之专家外大多数遭受支原体污染的细胞株无法以其外观分辨之。、支原体污染会对细胞培养有何影响?支原体污染几乎可影响所有细胞之生长参数代谢及研究之任一数据。故进行实验前必须确认细胞为mycoplasmafree实验结果之数据方有意义。、侦测出细胞株有支原体污染时该如何处理?直接灭菌后丢弃以避免污染其它细胞株。、CO培养箱之水盘如何保持清洁?定期(至少每两周一次)以无菌蒸馏水或无菌去离子水更换之。、为何培养基保存于°C冰箱中颜色会偏暗红色且pH值会越来越偏碱性?培养基保存于°C冰箱中培养基内之CO会逐渐溢出造成培养基越来越偏碱性。而培养基中之酸碱指示剂(通常为phenolred)的颜色也会随碱性增加而更偏暗红。培养基偏碱之结果将造成细胞生长停滞或死亡。若培养基偏碱时可以通入无菌过滤之CO以调整pH值。、各种细胞培养用的dishflask是否均相同?不同厂牌的dish或flask其所coating的polymer不同制造程序亦不同虽对大部分细胞没有太大之影响惟少数细胞则可能因使用厂牌不同之dish或flask而有显著之生长差异。、购买之细胞冷冻管经解冻后为何会发生细胞数目太少之情形?研究人员在冷冻细胞之培养时出现细胞数目太少大都是因为离心过程操作上的失误造成细胞的物理性损伤以及细胞流失。建议细胞解冻后不要立刻离心应待细胞生长隔夜后再更换培养基即可。、购买之细胞死亡或细胞存活率不佳可能原因?研究人员在细胞培养时出现存活率不佳常见原因可归纳为:培养基使用错误或培养基品质不佳。血清使用错误或血清的品质不佳。解冻过程错误。冷冻细胞解冻后加以洗涤细胞和离心。悬浮细胞误认为死细胞。培养温度使用错误。细胞置于–°C太久。、L谷氨酰胺在细胞培养中重要吗?它在溶液中不稳定吗?L谷氨酰胺在细胞培养时是重要的。脱掉氨基后L谷氨酰胺可作为培养细胞的能量来源、参与蛋白质的合成和核酸代谢。L谷氨酰胺在溶液中经过一段时间后会降解但是确切的降解率一直没有最终定论。L谷氨酰胺的降解导致氨的形成而氨对于一些细胞具有毒性。、GlutaMAXI是什么?培养细胞如何利用GlutaMAXI?这个二肽有多稳定?GlutaMAXI二肽是一个L谷氨酰胺的衍生物其不稳定的alpha氨基用L丙氨酸来保护。一种肽酶逐渐裂解二肽释放L谷氨酰胺供利用。GlutaMAXI二肽非常稳定即使在磅灭菌分钟GlutaMAXI二肽溶液有最小的降解如果在相同条件下L谷氨酰胺几乎完全降解。、什么培养基中可以省去加酚红?酚红在培养基中用作PH值的指示剂:中性时为红色酸性时为黄色碱性时为紫色。研究表明酚红可以模拟固醇类激素的作用(特别是雌激素)。为避免固醇类反应培养细胞尤其是哺乳类细胞时用不加酚红的培养基。由于酚红干扰检测一些研究人员在做流式细胞检测时不使用加有酚红的培养基。、如何用台盼兰计数活细胞?用无血清培养基把细胞悬液稀释到~个毫升在毫升细胞悬液中加毫升%的台盼兰溶液。轻轻混匀数分钟后用血球计数板计数细胞。活细胞排斥台盼兰因而染成蓝色细胞是死细胞。、培养基中丙酮酸钠的作用是什么?丙酮酸钠可以作为细胞培养中的替代碳源尽管细胞更倾向于以葡萄糖作为碳源但是如果没有葡萄糖的话细胞也可以代谢丙酮酸钠。、二价离子抑制胰蛋白酶活性吗?使用胰蛋白酶时加入EDTA的目的是什么?二价离子的确抑制胰蛋白酶活性。EDTA用来螯合游离的镁离子和钙离子以便保持抑制胰蛋白酶的活性。建议胰蛋白酶处理细胞前用EDTA清洗细胞以消除来自培养基中所有的二价离子。、室温下配制的TrisHCl溶液在℃使用时PH值是多少?缓冲液PH值随温度变化而变化。下表列出了mMTrisHC溶液在℃℃℃时不同PH值。mMTrisHC溶液在℃℃℃时不同PH值°C °C °C                                                                                                                                           、如何从T瓶中转移sf细胞?能用胰蛋白酶消化吗?我们推荐使用脱落细胞的方法此技术破坏性最小生活力最高。通过使用巴斯德吸液管让细胞上培养基流动。作为一种选择你也可以轻轻拍打培养瓶。只有在绝对必要的情况下才使用胰酶消化细胞。、胰酶消化一个T瓶的sf细胞:()去除培养基。()用mlxPBS(足以覆盖细胞表面)洗涤细胞去除PBS。()加入mlx胰酶EDTA(恰好覆盖细胞表面)。()℃孵育到分钟。在仪器下检测看到分钟后它们正在向上移动。()向细胞中加入ml细胞培养液移入锥形管用ml培养液洗瓶壁移入同一锥形管中。(培养基中的FBS终止了胰酶的活性。)()离心(rpm)沉淀细胞。去除培养基。()用新的培养基重新悬浮细胞。传代。、在Sf,Sf,和highFive细胞悬浮培养时肝素的使用量是多少?为了防止悬浮培养细胞聚集的形成使用肝素浓度为单位毫升细胞悬液。、在重新冻存sf细胞前它可以传多少代?随着传代的次数的增加它的感染能力会降低吗?通常情况当细胞经过次传代后应该返回冻存。无论什么时候计数时都应该检查细胞活力。如果超过%的细胞保持有活力和在大约小时左右加倍细胞仍然可以使用。如果活力和加倍时间下降它们的感染力将不在是有效的。、贮存在冰箱中的瓶口已开的培养基在放置几天后颜色变紫这主要是由于在暴露到周围的CO水平时碳酸氢纳导致了pH值的上升。您可以在使用前松开瓶口在CO培养箱孵育培养基分钟来校正溶液的pH值(确定松开瓶口以保证气体交换)。、细胞培养基偶然被冻可否继续使用?如果细胞培养基偶然被冻您应该熔化培养基并观察是否有沉淀产生。如果没有沉淀产生培养基可以正常使用如果出现沉淀只能丢弃这些培养基。、无血清培养与有血清培养使用的抗生素量一样吗?当在无血清培养基中添加抗生素时降低至少在有血清培养基中所使用浓度的。血清蛋白会结合和灭活一些抗生素。在无血清培养条件下抗生素不被灭活可能对于细胞达到毒性水平。、培养基中添加了血清和抗生素后可长期保存吗?一旦您在新鲜培养基中添加了血清和抗生素时您应该在两到三周内使用它。因为一些抗生素和血清中的基本成分在解冻后就开始降解。、培养基及其它添加物和试剂可反复冻融吗?大部分添加物和试剂最多可以冻融次如果次数更多都会在包含蛋白的溶液引起一定水平的降解和沉淀将会影响它的性能。、为什么要在溶解的一周内使用贮存在℃冰箱中的液体胰蛋白酶溶液胰蛋白酶在℃就可能开始降解如果在室温下放置超过分钟就会变得不稳定。、保存血清最好的方法我们建议血清应保存在℃至O℃。若存放于℃时请勿超过一个月。若一次无法用完一瓶建议无菌分装血清至恰当的灭菌容器内再放回冷冻。、如何解冻血清才不会使产品质量受损将血清从冷冻箱取出后先置于~℃冰箱使之融解然后在室温下使之全融。但必须注意的是融解过程中必须规则地摇晃均匀。、血清解冻后发现有絮状沉淀物出现该如何处理血清中沉淀物的出现有许多种原因但最普遍的原因是由于血清中脂蛋白的变性所造成而血纤维蛋白(形成凝血的蛋白之一)在血清解冻后也会存在于血清中亦是造成沉淀物的原因之一。但这些絮状沉淀物并不影响血清本身的质量。若欲去除这些絮状沉淀物可以将血清分装至无菌离心管内以g稍微离心,上清液即可接着加入培养基内一起过滤。最好不使用过滤的方法去除这些絮状沉淀物因为它可能会阻塞过滤膜。、为什么要热灭活血清加热可以灭活补体系统。激活的补体参与溶解细胞事件刺激平滑肌收缩细胞和血小板释放组胺激活淋巴细胞和巨噬细胞。在免疫学研究培养ES细胞、平滑肌细胞时推荐使用热灭活血清。、有必要做热灭活吗实验显示经过正确处理的热灭活血清对大多数的细胞而言是不需要的。经此处理过的血清对细胞的生长只有微小的促进或完全没有任何作用甚至通常因为高温处理影响了血清的质量而造成细胞生长速率的降低。而经过热处理的血清沉淀物的形成会显著的增多这些沉淀物在倒置显微镜下观察像是“小黑点”常常会让研究者误以为是血清遭受污染而把血清放在℃环境中又会使此沉淀物更增多使研究者误认为是微生物的分裂扩增。若非必须可以不需要做热处理这一步。不但节省时间更确保血清的质量!、为什么储存在冰箱中的胎牛血清会出现沉淀有些胎牛血清产品没有预老化储存在-℃时血清中的各种蛋白和脂蛋白(如冷凝集素、纤维蛋白原、玻粘连蛋白等)可能聚集而形成沉淀或可见的混浊。这应该不会影响血清的质量。推荐在-℃储存胎牛血清避免反复冻融。、如何避免沉淀物的产生我们建议您在使用血清的时候注意下列的操作:()解冻血清时请按照所建议的逐步解冻法(℃至℃至室温)若血清解冻时改变的温度太大(如℃至℃)非常容易产生沉淀物。()解冻血清时请随时将之摇晃均匀使温度及成分均一减少沉淀的发生。()请勿将血清置于℃太久。若在℃放置太久血清会变得混浊同时血清中许多较不稳定的成分也会因此受到损害而影响血清的质量。()血清的热灭活非常容易造成沉淀物的增多若非必要可以无须做此步骤。()若必须做血清的热灭活请遵守℃分钟的原则并且随时摇晃均匀。温度过高时间过久或摇晃不均匀都会造成沉淀物的增多

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