骨髓间充质干细胞的转染

第一大肠杆菌感受态的制备 转化是将外源DNA分子引入另一细胞品系,使受体细胞获得新的遗传形状的一种手段。受体细胞经过一些特殊 方法 快递客服问题件处理详细方法山木方法pdf计算方法pdf华与华方法下载八字理论方法下载 的处理后,细胞膜的通透性发生了暂时性的改变,成为能容许外源DNA分子进入的感受态细胞。 一,实验材料: 1,LB液体培养基:称取蛋白胨10g,酵母提取物5g,氯化钠10g,溶于800ml去离子水中,用NaOH调节PH到7.5,加去离子水定容至1L,高压灭菌20min. 2,LB平板培养基:LB液体培养基中按1.5%的浓度加入琼脂,加热溶解,进行高压灭菌。 取出后趁热在无菌条件下,倒入无菌的平皿中,每套平皿中加入12-15ml,凝固后倒置, 4℃冰箱保存备用。 3,0.1mol/lCaCL2溶液:称取1.1g 五水CaCL2用双蒸水溶解,定容到100ml.高压灭菌20min. 二,实验步骤: 1,从LB平板上挑取新活化的大肠杆菌单个菌落,接种到3-5mlLB液体培养基中,37℃震荡培养12h左右,直至对数生长期,然后将该菌液以1:100(1:50)接种到100mlLB液体培养基中,37℃震荡培养2-3h至OD600nm=0.5 2,培养液在冰上冷却10min,转入离心管中,4℃下,4000r/min离心10min. 3,弃去上清液,用预冷的0.1mol/l CaCL2溶液轻轻悬浮细胞,冰上放置15-30min. 4,4℃下,4000r/min离心10min. 5,弃去上清液,加入300μl预冷的0.1mol/l CaCL2溶液,轻轻悬浮细胞,冰上放置几分钟,即制成感受态细胞悬液。 6,以上制备好的细胞悬液可在冰上放置,24h内用于转化实验,或添加冷冻保护剂(15-20%)后超低温-70℃冷冻贮存。 第二,将带有目的基因的载体质粒转化到感受态大肠杆菌中。1,取200μl感受态细胞悬液(若是冷冻保存液,冰浴中使其解冻,解冻后立即进行下面操作)加入载体质粒溶液(含量不超过50ng,体积不超过2μl). 2,将含有混合液的离心管轻轻摇匀,冰上放置30min后,42℃水浴中热冲击2min,然后迅速置于冰上冷却3-5min. 3,向各管中加入100μl LB液体培养基,使总体积约为0.2ml,即制备成转化反应原液,混匀后37℃温浴15min以上,震荡培养。此时细菌回复正常生长状态,并使转化体产生抗药性。 第三,质粒菌落的准备 1,LB培养基的配制:称取胰化蛋白胨10g,酵母提取物5g,氯化钠10g.加入适量去离子水摇动容器至容器溶解,然后用5M(mol/l)氢氧化钠调节ph到7.0,然后用去离子水定容到1L,待上述溶液完全溶解后,向另一广口瓶中加入琼脂粉,每100ml LB培养基加入1.5g 琼脂粉。进行高压灭菌后,将融化的LB固体培养基在55℃水浴中,待培养基温度将至55℃即授课触摸,加入抗生素,每100ml LB培养基中加入1ml 100mg/ml的卡那霉素(1g/1000ml),充分摇匀。 2,LB培养板制作:将加入抗生素的LB培养基充分摇匀后倒入90x25mm2皿中10-20ml LB,倒板后打开盖子半盖状态,在紫外灯下10-15min.最后封口,4℃保存。 3,划板接种菌:用接种环取新鲜培养的菌落或甘油菌液,划板接种到卡那霉素(千分之一)的LB平板上,37℃温箱孵育16-18h(一般12h开始生长菌落,时间以菌落生长状态判断。),将平板应该反放,注意不可让菌落长太大。 4,摇菌: (1)首先将卡那霉素2ml,解冻,然后加于200ml高压灭菌后的LB液体培养基中, 摇匀,然后用5ml移液枪分装两个10ml离心管,每管5ml含卡那霉素的LB培 养基。然后立即对LB液体培养基的容量瓶封口,并酒精擦拭火焰消毒。在使 用5ml移液器过程中,枪头不可碰到容量瓶或离心管壁。 (2)其次,用10微升或0.5-1微升的抢吸取培养板上的单个菌落,然后将枪头在10ml 离心管中晃动数次,将枪头打入10ml离心管中。 (3)最后,对10ml离心管封口,用记号笔记下操作时间,操作质粒菌的名称,顺序。 (如:2011,8,17 a/b s3) (4)将接种取完的菌板封闭放于4℃,将含有卡那霉素的LB培养基放于4℃,将10ml 离心管管口封闭好,用报纸包扎放于塑料泡沫中,放入摇床,37摄氏度,200r, 摇16-18h(目的是使细菌快速生长,并 表 关于同志近三年现实表现材料材料类招标技术评分表图表与交易pdf视力表打印pdf用图表说话 pdf 达质粒编码的抗生素抗性标记基因。) 5,储备甘油菌: 制备10-15%甘油菌液,将高压灭菌好的甘油放于4℃保存,然后将摇过的菌取出,将甘油与菌液一同放入无菌操作台中,在灭菌条件下,用剪刀剪1ml枪头一个小斜口,然后吸取400微升甘油放于3ml菌液中,然后进行涡旋震荡,待甘油菌液混匀后,将甘油菌液封口,记下标记放于-20℃保存。 注意事项:1,卡那霉素使用时,首先应分装到ep管中以100mg/ml,每管3ml浓度放入5ml 管中,-20℃保存。 第四,质粒DNA分子的大量提取 1,准备材料:已经制备好的600ml菌液,TIANGEN(endofree plasmid kit,K9428无内毒素质粒大提取试剂盒),20个50ml离心管, 5ml枪头,200微升枪,枪头(用于吸取RnaseRNA),计时器,吸水纸,五水酒精,异丙醇,废液钢。 2,操作步骤: (1)取过夜培养的菌液加入50ml离心管中,配平(tem;21℃,prog:0, speed:8000rpm),time:3min。收集菌液尽量吸除上清,由于菌液较多可以通过几 次离心将菌体沉淀收集到一个离心管中,菌液量以能够充分裂解为佳,菌液过 多会导致裂解不充分从而降低质粒的提取效率。 (2)尽量吸除上清,为了确保上清液全部吸除,可以用干净的吸水纸吸去瓶壁上的 水滴。 (3)向溶液P1中,用200微升的枪吸取RnaseA加入其中,放置到圆周振荡器或移 液枪吹打,混匀。 (4)向留有菌体沉淀的离心管中加入7ml溶液P1(已经加入RnaseA),使用移液器 或涡旋振荡器彻底悬浮细菌细胞沉淀(使用5ml枪时,可以调3.5ml,即加两次 即可,以节约中间调枪时间),一定要彻底悬浮细菌沉淀,如果有未彻底混匀的 菌块会影响裂解效果,从而引起提取量和纯度低。 (5)向离心管中加入7ml溶液P2,立即温和的上下翻转6-8次,轻轻混匀,室温放 置5min,不要剧烈震荡,以免污染基因组DNA,此时菌液变的清亮粘稠,若未 变清亮,可能由于菌体过多,裂解不彻底,以后应减少菌液量。 (6)向离心管中加入7ml溶液P4,立即温和上下翻转6-8次充分混匀,此时出现白 色絮状沉淀,然后室温放置10min左右,800rpm,离心5-10min,然后将溶液倒入 过滤器CS中,在倒入过程中过滤口下面应放置50ml离心管,慢慢推动推柄过 滤,然后将滤液收集到自带的干净50ml离心管中,如果菌体过多(多于100ml), 建议延长离心时间20-30min. (7)柱平衡处理,在(6)离心过程中,向吸附柱CP5中(吸附柱放入50ml离心管 中)加入25ml的平衡液BL,8000rpm,(8228g)离心2min,倒掉离心管中废 液,将吸附柱重新放回收集管中(对于平衡处理过的柱子最好立即使用) (8)在(6)的滤液中加入0.3倍滤液体积的异丙醇(加入异丙醇过多易引起RNA污 染),上下颠倒混匀后转移到平衡后的含有50ml收集管的吸附柱CP5中。(吸 附柱CP5的最大容积是15ml,可以分2次过柱,称量调平,室温8000rpm,8228g), 离心2Min,倒掉收集管中的废液,将吸附柱重新放回收集管中。 注意:在进行分2次过柱,每次均按以上条件进行。 (9)向吸附柱中加入10ml漂洗液PW(使用前按照说明加入五水乙醇)8000rpm (8228g)离心2min,弃掉收集管中的废液,将吸附柱重新放回收集管中。 (10)重复步骤(9) (11)向吸附柱中加入3ml五水乙醇,目的除去杂质,室温8000rpm(8228g)离心2min, 倒掉废液。 (12)将吸附柱CP5重新放回收集管中8000rpm(8228g)离心5min,目的是将吸附柱中 残余漂洗液去除。 注意:漂洗液中乙醇的残留会影响后续的酶促反应(酶切,PCR等),为确保下 游实验不受残留乙醇的影响,建议将吸附柱CP5开盖,置于室温放置数分钟, 从而彻底晾干吸附柱材料中残留的漂洗液。 (13)将吸附柱CP5置于一个干净的50ml收集管中,向吸附膜的中间部位悬空滴加 1-2ml洗脱缓冲液TB,室温放置5min,然后室温8000rpm(8228g)离心2分钟, 将50ml离心管中的洗脱液全部移入一个干净的1.5ml离心管中,-20摄氏度保存。 注意:洗脱液用量大多少主要依据拷贝数以实验所需要的浓度来确定,洗脱缓冲 液体积不少于1ml,体积过小会影响回收效率。 第五,大量质粒DNA的产物纯化 实验材料: (1)TIANGEN大量DNA产物纯化试剂盒(规格50次) (2)酶切反应体系:灭菌蒸馏水55μl;x 20管即1100μl buffer(10x)10μl; x20管即200μl 质粒30μl, x 20管即600μl 酶(15μl/管)3-5μl,x20管即100μl 总体积2000μl 1μg质粒需要至少5IU酶进行消化(1μgλDNA=5iu酶),质粒浓度0.3μg/μl(30μl即9μg),30μl质粒即需要至少5IU酶,TAKARA的酶是1μl=10iu(150iu/瓶),酶切时酶的量为十倍量使用。但是酶的用量不应大于反应体系的十分之一。 (3)冰浴盒,1ml枪头(枪),200μl枪(枪头),5ml离心管,1.5ml离心管(20 个),0.5ml离心管20个,20μl枪(枪头),废液钢 (4)DNA线性化回收体系: 漂洗液PW(操作前先往15mlPW中加入60ml无水乙醇) 平衡液BL 结合液BL 洗脱缓冲液EB 吸附柱CB3 收集管(2ml) 调节水浴锅为37℃。 实验步骤: 1,酶切体系的配制: 将20管的酶切体系放于5ml离心管中,在冰浴上进行操作,吹打混匀,分装到20个管(100μl/管),短暂离心2-3s,取出置入到37℃水浴中,放置2h. 2,酶切DNA线性化处理 (1)柱的平衡:向吸附柱CB3中加入500μl平衡液BL, 12000rpm(13400g),1min,倒掉收集管中废液,将吸附柱重新放回收集管 中(当天使用) (2)向每管酶切反应体液(100μl)中,加入5倍体积(500μl)的结合 液PB,充分混匀。 (3)将(2)中混匀溶液加入吸附柱中(20个),(吸附柱CB3的容积为800 μl),室温放置2min,12000rpm离心30-60s,倒掉收集管中的废液,将 吸附柱CB3放入收集管中。 (4)向吸附柱CB3中加入600μl已事先加有五水乙醇的漂洗液PW,然后 室温静置2min,12000rpm30-60s,倒掉收集管中废液,将吸附柱CB3放 入收集管中。 (5)向吸附柱CB3中加入600μl漂洗液PW,12000rpm,离心30-60s,倒掉收 集管中的废液。 (6)将离心吸附柱CB3放回收集管中,12000rpm(1340g)离心2min,尽量去 除漂洗液,将吸附柱放入室温晾干。 (7)取出吸附柱CB3放入一个干净的离心管1.5ml中,向吸附膜中间位置 悬空滴加适量洗脱缓冲液EB,室温放置2min,1200rpm,收集DNA液 (加入洗脱液不少于50μl). (8)为了提高DNA回收量,可将离心得到的溶液重新加到离心吸附柱中, 重复步骤。 3,DNA浓度及纯度检测: OD260值为1相当于大约50μg/ml双链DNA或40μg/ml单链DNA. 回收5-6μl放入ep管中,用于检测浓度防止反复冻融。 (1)首先用超纯水冲洗比色皿,然后用五水乙醇冲洗,干燥后,用灭菌 水调零。比色皿最大容量300μl. (2)根据需要以适当比例加样。如取6μl线性化处理的DNA进行检测, 以1:50比例进行(2μl质粒+98ml高压灭菌的双蒸水)。读数时先调零, 用50μl灭菌水。稀释质粒先加水98μl,再加2μl质粒DNA(质粒浓度 的计算 公式 小学单位换算公式大全免费下载公式下载行测公式大全下载excel公式下载逻辑回归公式下载 x ng/μl=OD260x5000. (3)读数,首先“bank”调零,然后读数 记录 混凝土 养护记录下载土方回填监理旁站记录免费下载集备记录下载集备记录下载集备记录下载 3次。如下: OD260 <1>,<2>,<3> OD280 <1>,<2>,<3> OD260/OD280. 此比值在1.7-1.9为正常范围。 注意事项: (1)Buffer,酶在使用前必须要进行短暂离心,因为Buffer(500μl/管),酶(15 μl/管)会沾到瓶壁上引起浪费。 (2)酶只有在最后开始的加的时候才从-20℃冰箱中取出,因为酶中含有50%甘 油防冻液,因此从-20℃拿出不结冰。 (3)在短暂离心时间调至short,然后按青绿色按钮离心力为2000rpm松手。 (4)将分装后的20管酶切反应体系放于到水浴锅总,不可让水浸没离心管。 (5)质粒不能反复冻融,使用前要进行混匀,提取后分装-20℃保存。 第六,细胞转染 常规瞬时转染(以24孔板为例)方法一: 1,细胞准备:在转染前24h,在24孔板中,每孔接种500μl 2x105个/ml细胞。转染时细胞融合度为80-90%, 要求 对教师党员的评价套管和固井爆破片与爆破装置仓库管理基本要求三甲医院都需要复审吗 铺板时细胞要消化完全混匀,避免重叠生长。 2,转染样品的准备: (1) 转染前4h更换新的完全培养基10%FBS+L-DMEM. (1)用50μl无血清L-DMEM稀释0.8μg质粒DNA(质粒DNA初始浓度0.3 μg/μl),轻轻吹吸3-5次混匀。 (2)轻轻颠倒混匀转染试剂lipofectamine TM2000,用50μl 无血清L-DMEM稀 释2.0μl转染试剂lipofectamine TM2000,轻轻吹吸3-5次混匀,室温下静置 5min. (3)混合转染试剂和质粒DNA稀释液,轻轻吹吸3-5次混匀,室温下静置20min. (4)转染复合物加入到24孔板细胞板中,100μl/孔,前后轻摇细胞板混合均 匀。 (5)将细胞板置于37℃,5%CO2培养箱中培养18-48h,转染4-6h后可换新鲜培 养基。 方法二:(方法二效果不是很好) (1)待细胞80-90%融合时,在转染前4h更换新的完全培养基10%FBS+L-DMEM, 制备DNA-lipofectamine2000复合物(1:2.5),每孔含有0.8μg质粒+2μl lipofectamine2000,室温放置30min. (2) 吸去培养孔中原培养液,用PBS冲洗2次,每孔加入无血清的L-DMEM 100 μl/孔,每孔缓慢加入上述复合物(每孔含有0.8μg质粒+2μl lipofectamine2000)。 设立对照孔加入无血清的L-DMEM100μl, 4h后,小心吸去培养孔中培养液,用 PBS冲洗2次,每孔加入完全培养基0.5ml,转染24h后,倒置荧光显微镜下观察细 胞内绿色荧光蛋白表达。 3,注意事项: (1)凡是进行转染过程中不同细胞转染量要自己摸索。 (2)抗生素一般对于真核细胞无毒,但因为阳离子脂质体试剂增加了细胞的通 透性,使抗生素可以进入细胞,从而降低了细胞的活性,导致转染效率降 低,因此,在转染培养基中,在准备转染前进行细胞铺板时均应避免使用 抗生素。 (3)瞬时和稳定表达时,DNA转染后,转入基因的表达可以在1-4天内检测到, 仅有一部分转入细胞的DNA被转运到细胞核内进行转录并最终输出 mRNA到细胞内进行蛋白质合成,几天内,大部分外源DNA会被核酸酶 降解或随细胞分裂而稀释,一周后就检测不到其存在了。 (4)稳定转染细胞系的筛选,就是将带有药物抗性的筛选标记基因一起结合到 目的基因上建立稳定转染细胞系,如氨基糖苷磷酸转移酶基因(APH或 neor),可以合成APH酶,通过磷酸化使药物失活。从而使含有此抗性基因