PEG沉淀法-病毒提纯方法

1. Viruses such as baculovirus can be concentrated by polyethylene glycol precipitation. 2. Adjust the pH of the virus-containing supernatant to 7.2-7.5. Polyethylene glycol (PEG, MW 6,000) is added to a final concentration of 8% (w/v). 3. Stir at 4℃for 2 hours. 4. Centrifuge at 10,000 x g for 2 hours. 5. Resuspend the pellet in a small volume of appropriate buffer ( e.g., RNase-free ddH2 for virus RNA prep). 沉淀法-病毒提纯方法 主要是从稀的悬浮液中浓缩病毒，有中性盐沉淀法、聚乙二醇(PEG)沉淀法、有机溶剂沉淀法、等电点沉淀法、皂土法和鱼精蛋白沉淀法等。 1.中性盐沉淀法：病毒一般在45%以上饱和度的硫酸铵溶液中沉淀，且保持其感染性。在含有病毒的组织培养液中加入等体积的饱和硫酸铵，可以很容易地沉淀某些病毒如狂犬病毒、鸡新城疫病毒等。　 2.聚乙二醇沉淀法：聚乙二醇(PEG)为水溶性非离子型聚合物，具有各种不同的分子量，用于病毒沉淀的主要是分子量为2 000～6000的PEG。将PEG配成50%左右的溶液，或直接将固体PEG加于病毒悬液中，使其达到所需浓度，通常在4℃搅拌过夜，然后离心使病毒沉淀。Tanncock(1985年) 成功地用PEG浓缩了禽脑脊髓炎病毒。 3.有机溶剂沉淀法：甲醇、氯仿、正丁醇、氟碳化合物等都可用于提纯病毒，但乙醚、氯仿等脂溶剂对于具有脂质囊膜的病毒具有破坏和灭活作用，故不适于这类病毒的浓缩提纯。 4.等电点沉淀法：病毒粒子在等电点时，所携带的正电荷与负电荷相互中和，因而失去相互排斥的作用而发生沉淀。多数病毒的等电点在pH4.5～5.5之间，因此在pH3～6范围内均可沉淀，由于一部分细胞成份在等电点时亦发生沉淀，此法效果不太理想，但从感染的组织培养液中浓缩病毒，可以获得较好结果。应用酸性范围的等电点沉淀或分级沉淀病毒时，必须注意pH对病毒活性的影响及病毒粒子电荷与组织蛋白电荷的差异。 5.皂土法：Girin(1989年)应用皂土在酸性条件下(pH4～4.5)吸附轮状病毒SA-11，再在碱性条件下（pH8.5），又使其洗脱下来，从而达到纯化目的。 6.鱼精蛋白沉淀法：鱼精蛋白为碱性蛋白，具有携带其它蛋白质共沉淀的作用，能和直径大于50nm的病毒共同沉淀而不影响病毒的感染力。当向这种沉淀物加入1mol/LNaCl时，病毒又重新释放到悬液中，而鱼精蛋白仍然沉淀。直径小于50nm的小型病毒则不与鱼精蛋白共同沉淀。因此，可利用鱼精蛋白去除病毒材料中直径大于50nm的异种蛋白质。 聚乙二醇HOCH2(CH2OCH2)nCH2OH(n＞4)( Polyethylene Glycol 简写为 PEG)，它的亲水性强，溶于水和许多有机溶剂，对热稳定，有广泛围的分子量，在生物大分子制备中，用的较多的是分子量为6000～20000的 PEG。 PEG 的沉淀效果主要与其本身的浓度和分子量有关，同时还受离子强度、溶液pH 和温度等因素的影响。在一定的pH 值下，盐浓度越高，所需PEG 的浓度越低，溶液的pH 越接近目的物的等电点，沉淀所需PEG 的浓度越低。在一定范围内，高分子量和高浓度的PEG 沉淀的效率高。以上这些现象的理论解释还都仅仅是假设，未得到充分的证实，其解释主要有：①认为沉淀作用是聚合物与生物大分子发生共沉淀作用。②由于聚合物有较强的亲水性，使生物大分子脱水而发生沉淀。③聚合物与生物大分子之间以氢键相互作用形成复合物，在重力作用下形成沉淀析出。④通过空间位置排斥，使液体中生物大分子被迫挤聚在一起而发生沉淀。 有机聚合物沉淀的优点是：①操作条件温和，不易引起生物大分子变性；②沉淀效能高，使用很少量的PEG 即可以沉淀相当多的生物大分子；③沉淀后有机聚合物容易去除。 水溶性非离子型聚合物沉淀法常用的聚合物为聚乙二醇（PEG）及硫酸葡聚糖。水溶性聚合物沉淀蛋白质的机制尚不清楚，大致有如下解释：①聚合物与蛋白质形成共沉物；①聚合物与蛋白质之间发生水的重分配；①聚合物与蛋白质形成复合物。此法受许多因素影响，主要是pH、离子强度、蛋白质浓度和PEG的分子量等。分子量为 2000～6000的PEG皆适宜于做蛋白沉淀用。如若使用得当，效果甚为满意。一般认为，PEG浓度在3％～4％时沉淀免疫复合物，6％～7％可沉淀IgM，8％～12％可沉淀IgG，12％～15％可沉淀其他球蛋白，25％可沉淀白蛋白。最突出的应用是用3％～4％的PEG沉淀免疫复合物，未结合的抗原和抗体留在溶液中。按此原理设计了快速测定法和循环免疫复合物测定法 从网上搜索到得关于PEG沉淀提纯病毒的方法，先汇总至此贴，希望大家支持本版 1、用超声波或冻融的方法使细胞破碎释放出病毒； 2、慢慢搅动并加入NaCl终浓度是0.5mol/L,有助于病毒的沉淀，再等量加入10％PEG(一般使用的是PEG6000就可以了。如果对样品的纯度不是严格要求的话，可以建议使用Millpore公司的离心浓缩柱，Amicon系列的可以一次浓缩15ml样品。)； 3、4℃过夜或放置一段时间； 4、8000/min离心30分钟，收集病毒沉淀； 5、将病毒沉淀加入适量的pbs中，4℃过夜； 6、10000r/min离心1小时,沉淀即为浓缩的病毒。 还可以用梯度离心或其他方法进一步纯化。 PEG沉淀法提纯病毒 1、用超声波或冻融的方法使细胞破碎释放出病毒； 2、慢慢搅动并加入NaCl终浓度是0.5mol/L,有助于病毒的沉淀，再等量加入10％PEG(一般使用的是PEG6000就可以了。如果对样品的纯度不是严格要求的话，可以建议使用Millpore公司的离心浓缩柱，Amicon系列的可以一次浓缩15ml样品。)； 3、4℃过夜或放置一段时间； 4、8000/min离心30分钟，收集病毒沉淀； 5、将病毒沉淀加入适量的pbs中，4℃过夜； 6、10000r/min离心1小时,沉淀即为浓缩的病毒。 还可以用梯度离心或其他方法进一步纯化。 Concentrating virus (PEG6000) -------------------------------------------------------------------------------- 1. Viruses such as baculovirus can be concentrated by polyethylene glycol precipitation.  2. Adjust the pH of the virus-containing supernatant to 7.2-7.5. Polyethylene glycol (PEG, MW 6,000) is added to a final concentration of 8% (w/v).  3. Stir at 4 0Cfor 2 hours.  4. Centrifuge at 10,000 x g for 2 hours.  5. Resuspend the pellet in a small volume of appropriate buffer ( e.g., RNase-free ddH2 for virus RNA prep). PEG-it?慢病毒浓缩试剂 l 价  格： ￥3802.5 l 说  明： 欢迎询价详谈 l 货  号：LV810A-1 PEG-it?慢病毒浓缩试剂 原理 PEG是高分子聚合物，具有高亲水性，在溶液中会吸收大量水分，减少病毒之间的距离，使病毒与病毒能够很容易的聚合在一起，病毒的相对浓度提高，达到沉淀浓缩的目的。 PEG-it?中还含有特定的（SBI专属的）缓冲液，它能够保持病毒的活性。少量残留的PEG-it?还会提高感染效率，使病毒更稳定。 图1 使用简便快捷 只需将5倍的PEG-it?溶液与包含病毒颗粒的细胞培养基混合离心30分钟，即可得到10-100倍的病毒浓缩液 特点 快捷：全程只需30min 高效：能使病毒颗粒浓缩10-100倍 安全：对所有靶细胞，包括胚胎干细胞是无毒的 使用方便：无需使用特别的仪器，避免了昂贵的超高速离心机的使用，只需普通离心机，低速离心即可 无残留：没有细胞残片的残留，避免对细胞的毒性和免疫原性 提高转导效率：为动物转导提供高滴度的病毒 特别适合大体积的病毒浓缩，解除了超滤管小量的限制 产品信息 货号 产品名称 包装体积 价格（￥） 说明 LV810A-1 PEG-it? Virus Precipitation Solution (100 mL aliquot) 100 mL 3802.5 适用于400ml慢病毒细胞上清液浓缩 LV825A-1 PEG-it? Virus Precipitation Solution (250 mL aliquot) 250 mL 8287.5 适用于1L慢病毒细胞上清液浓缩           纯化病毒用终浓度10%PEG处理后8000g离心，溶解于PBS。这样的方法对吗？ PEG沉淀的原理是什么啊？ 是这样的，纯化病毒和噬菌体都可以，原理就是PEG8000是一种高度的网状聚合物，很粘稠，可以把病毒沉淀下来。 Catalog # Product Name+ Size Price Buy Now K904-200 PEG Virus Precipitation Kit 200 preparations $725.00 K904-50 PEG Virus Precipitation Kit 50 preparations $245.00             PEG Virus Precipitation Kit 中文名称 PEG病毒沉淀试剂盒(200次) 供应商 Biovision 产品货号 K904-200 产品报价 ￥11600/200次分析 背景 资料 新概念英语资料下载李居明饿命改运学pdf成本会计期末资料社会工作导论资料工程结算所需资料清单 包装出来的重组病毒常常含量很少，因此通常需要浓缩之后才能进行储存或其它应用。另外，在病毒包装过程中，可能会产生有毒的蛋白或生物分子杂质。因此需要一种快速、简单而便宜的方法来浓缩病毒，同时去除杂质。 产品描述 BioVision的PEG病毒沉淀试剂盒提供了一种简单方便省时的方法来浓缩病毒，无需超速离心。本试剂盒可用于小实验样品处理或者大规模高产出、高生物量病毒制备。本试剂盒可利用细胞培养液或者环境样品浓缩逆转录病毒、杆状病毒、慢病毒、噬菌体等。浓缩倍数可达100倍以上。试剂盒中还有一种优化的重悬溶液可最大化地进行病毒复苏，根据病毒类型和来源，复苏比例在40-100%不等。整个过程都使用无毒试剂，浓缩的病毒可用于感染实验、DNA或RNA纯化等。 产品特点 1、一种快速简单便宜的方法浓缩病毒去除杂质；2、简单方便省时的方法浓缩病毒，无需超速离心；3、病毒可浓缩100以上；4、整个过程都使用无毒试剂。 保存建议 请在接收到该Biovision品牌的PEG病毒沉淀试剂盒(200次)产品后，置于-20℃保存。           PEG Virus Precipitation Kit 中文名称 PEG病毒沉淀试剂盒(50次) 供应商 Biovision 产品货号 K904-50 产品报价 ￥3920/50次分析         超速离心法-病毒提纯方法 录入时间:2009-6-26 9:30:33 来源：青岛海博 病毒粒子经过初步浓缩之后，要进一步纯化，通常采用超速离心法，它是分离提纯不同大小的病毒的有效方法之一。在应用超速离心法沉淀病毒时，必须了解所用离心机的离心力。离心机由于转头的回转产生了强大的离心力，这种离心力是随转头的大小和离心管至转轴中心的距离而变化的。高速和超速离心机的离心条件，有的以每分钟速度(r/min)表示，有的则以离心力——重力加速度g(980cm/S 2)为单位来表示。离心沉淀时，沉降]速度与离心力有关。当运转角速度为ω，运转半径为R时，则： [JZ]离心力g=ω 2Rav，ω=(2πr/min)/60， [JZ]g=[SX(]4πr/min 2[]3]600×980[SX)]×Rav [HT5”SS][JZ]图13-2〓角转头的横剖面图 [JZ]表明从旋转中心到离心管顶部、中部及底部的距离。 [HT5SS] 上式中，Rav为离心管中心至转轴中心的平均距离(如图13-2)。从上式可以作]出r/min、R与g三者关系的贯线图(如图13-3)。三者中如知其二，就可推算另一数值。如转速超过7万，或R为英寸时，可参阅图13-4。 [HT5”SS][JZ]图13-3〓推算转头离心力的贯线图 [JZ]图13-4〓推算转头离心力的贯线图 由此图可以获得与半径相关的相对离心力的值。将尺放在图左侧表示离心头中的离心管距转轴中心的距离(即旋转半径的标尺)上，]然后使之与预选转速(即图右侧的离心速度标尺)成一直线，在图中央的标尺上即可读出相对]离心力之值。图中点线表示测量一个相对离心力的例子。 [HT5SS]离心机转速在4000r/min左右的称为低速(普通)离心机；转速至25]000r/min左右的]称为高速]离心机；转速25]000r/min以上的称为超速离心机。高速和超速离心机装有冷冻装置和抽]真空]装置，以保持离心腔中恒定的低温，并减少转头运转时空气的摩擦力。超速离心机有制备和]分析用两类，最近又生产出制备、分析及区带连续离心三用装置在一起的离心机，有的还带]扫描装置。 使用超速离心机的分离提纯方法有三种：(1)差速离心法；(2)速度区带离心法；(3)平衡密度梯度离心法(或等密度梯度离心法)。 1.差速离心法 这是应用较早的简单方法，建立在不同大小和比重的粒子在沉降速度上存在差别的基础上。具体做法是将被分离的样品交替进行低速离心与高速(或超速)离心。沉降速度差别在一个或几个数量级的粒子，可用本法分离提取。粒子大小、转速与离心沉淀时间的关系，如图13-5。 [HT5”SS][JZ]图13-5〓病毒粒子大小、转速及离心沉淀时间的关系图 [HT5SS]差速离心适用于从组织培养液、鸡胚尿囊液或经过红细胞吸附 释放的病毒]悬液中提纯病毒。在由感染细胞或组织匀浆中提取病毒时，由于与病毒大小相近的细胞亚单位及碎片的存在，提纯效果不理想。差速离心法的优点是能迅速处理大量样品，故常作为病毒精制的第一个阶段，或者用于病毒样品的浓缩和粗提。 以差速离心法分离提纯病毒时，经常以低速(2]000～3]000r/min，20～30分钟)及中]速(10]000r/min，20～30分钟)去除较大的宿主细胞碎片、污染的细菌及其他较大的杂质。]然后，选择在60分钟内能够沉淀80%以上的病毒粒子的较高速度，离心1～2小时，使病毒沉淀]。对中、大型病毒如流行性感冒病毒，在经红细胞吸附 释放后，于25]000r/min离心60分]钟，即可达到目的。小型病毒如脊髓灰质炎病毒、披膜病毒，则需以35]000～45]000r/min离心1～2小时。高速或超速离心沉淀物，可用研磨和超声波振荡等方法打碎后悬浮于缓冲]液中。对于非病毒杂质较多的样品进行差速离心，由于病毒对沉淀物的非特异性吸附而有较多损失。 　] 2.速度区带离心法 是根据被分离物质在强大离心力中沉降速度不同而进行的分离方法。该法使用的介质密度应该小于被分离物质的密度。介质可以为均一密度，也可以为梯度密度。当被分离的物质沉降到与介质密度相等的区域时就不再沉降。不同分子形成不同的区带，而称为速度区带。该法要求样品浓度为顶端浓度梯度的1/10，样品体积为离心管体积的5%。常用的介质有蔗糖、甘油、聚蔗糖等。在病毒纯化时，将病毒样品溶液层加于密度梯度层的顶部，借助病毒粒子或其亚单位成分本身的浮密度差别，在离心力作用下降到密度相等的介质层内，最后排列成带状停留不动。密度较小的粒子或成分停留在上面的几层内，密度较大的粒子或成分沉降于下面几层内。应用密度梯度法，可以获得相当纯净的病毒样品。病毒粒子或成分的沉降速度取决于其大小、形状及比重，也取决于离心力及悬液介质的密度和粘度。蔗糖是生物大分子粒子密度梯度分离时最常应用的材料，因其易溶于水，且对核酸及蛋白质呈化学惰性。常用的梯度范围从5%～20%：10%～60%。蔗糖浓度梯度离心后，蔗糖溶液的密度以折射法测定折射率，按如下公式计算： [JZ]ρ=2 7329η 20 -2 6425 蔗糖溶液的折射率如表13-2。 　除蔗糖浓度连续梯度离心外，近来有人在两层浓度梯度上层加病毒浓缩样品，]经超速离心后将病毒收集于两层界面处；也有人在单层蔗糖浓度溶液上层加病毒浓缩样品，]经超速离心，使病毒沉淀于蔗糖溶液底部。这两种方法比较简单，但浓缩提纯的效果远远不]如多层连续梯度法。 3.平衡密度梯度离心法 平衡密度梯度离心法是根据粒子的浮密度不同而加以分离。所谓浮密度就是物质的质量减去在一定介质中所受的浮力，亦称有效密度。 [JZ]浮密度(有效密度)=m-m(ρ 0/ρ) m为物质质量，ρ为物质密度，ρ 0为介质密度。常用的介质有氯化铯(CsCl)、氯化铷(Rb]Cl)、硫酸铯(Cs 2SO 4)、溴化钾(KBr)、酒石酸钾(K 2C 4H 4O 6)等无机或有机盐。]病毒离心时，病毒粒子ρ比介质密度ρ 0大，即ρ>ρ 0病毒沉淀，ρ<ρ 0时则上浮。]制备梯度的方法有两种：一种是在饱和的CsCI溶液上面层加病毒样品(容量比1∶4)；]另]一种是将病毒样品与CsCl浓溶液均匀地混合。一般用水平转头，经较长时间的超速离心，在]离心管中形成CsCl的浓度梯度，并由于离心力的作用，样品中的病毒粒子分布于相应密度的]区域内。这种方法在分析离心中是最常用的。应用本法时，离心转头的回转数越高，离心时]间越长，越能接近平衡状态。 平衡密度梯度离心法广泛应用于病毒和核酸的提纯上。用平衡密度梯度离心法提纯的动物病毒有多型瘤病毒、牛痘病毒、乙型脑炎病毒、狂犬病病毒和马传贫病毒等。有的病毒在这些无机盐类溶液中被破坏，可加入0 2%～0 5%牛血清白蛋白，或用0 5%～3 0%甲]醛先将病毒粒子固定，然后进行平衡密度梯度离心，常能较好地回收病毒。大多数病毒的浮密度在1 10～1 40范围内，见表13-3。所以制备密度范围为1 0～1 7的悬浮介质，便可满]足大多数病毒密度梯度离心的需要。用CsCl溶液进行平衡密度梯度离心时，以测定25℃时CsCl溶液的折射率(ｎ 25] D的方法)，按照下列公式求得各梯度分层液的密度： 密度范围为ρ＝1 00～1 38g/cm 3时，ρ 25 =10 2402ｎ 25 D-12 6423〓](式1) 密度范围为ρ=1 37～1 9g/cm 3时，ρ 25 =10 8601ｎ 25 D-13 4974〓(]式2) ｎ 25 D指各梯度分层液在25℃时的折射率，ρ 25 指各梯度分层液在25℃时的]密度。 例①〓以马传贫病毒在CsCl平衡密度梯度离心后提纯于第12分段部位中，此部分CsCl溶]液折射率为1 3510，求其密度： 将所得折射率代入式1中，则 [JZ]　ρ 25 =10 2402×1 3510-12 6423=1 1923 即马传贫病毒浮密度约为1 19。 例②〓急性传贫马血清中游离铁蛋白在CsCl平衡密度梯度离心后提纯于第18分段部位]，此部分CsCl溶液折射率为1 3811，求其密度： 将所得折射率代入式2中，则 [JZ]　ρ 25 =10 6801×1 3811-13 4974=1 5014 即铁蛋白浮密度约为1 50。 各种无机盐溶液的密度与折射率的关系，一般以下列公式表示： [JZ] ρ=a?n-b 如果知道各种盐类溶液的系数a和b，即可按测定折射率的方法简单地求得其密度。由折射率计算密度时，常用溶质的质数a和b值及其密度的适用范围如表13-5。 4.两种超离方法的比较 速度区带离心法和平衡密度梯度离心法各有特点，现将这两种超离方法加以比较，具体见表]13-6 [JZ][HT5”H]表13-6〓速度梯度离心法与平衡密度梯度离心法的特点 [HT6SS][]BG(!][BHDFG2，WK11，WK20ZQ，WK20ZQW][]速度区带离心法[]平衡密度梯度离心法][BHDG4]原理[]沉降与颗粒质量成正比，以物质沉降速度的不同进行分离[]沉降与颗粒的密度成]正比，以物质的浮密度不同进行分离[BHDG6]介质[]密度小，如蔗糖、甘油、聚蔗糖，蔗糖浓度10% 67%，密度1～1 3286预制梯度，]不连]续[]密度大，如CsCl,Cs 2SO 4，CsCl浓度0～1 355，密度为1～1 9025，自成连续梯]度[BHG4]离心力场[]强，离心速度高，使被分离物质易沉降[]稍强，速度相对低，使CsCl形成梯]度，建立沉降扩散平衡[BHG4]离心过程[]样品向离心管底沉降[]不论样品起始时在什么位置，离心中样品停留于介质]的等密度部位[BHG2]离心时间[]较短，一般为几小时到几十小时[]较长，十几小时到数天[BG)F] 5.密度梯度离心法的操作程序 　 (1)密度梯度的制备：制备密度梯度的方法有不连续的(即人工操作)和连续的(即机械操作)密度梯度两种。 不连续的或分层的密度梯度的制备 不连续的密度梯度是以人工操作法制备的，在一定温度下(一般在20℃或在25℃)配制一系列浓度差为5%的梯度溶液，例如蔗糖可配制成5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、]40%(W/V)等溶液(用蒸馏水或适宜的缓冲液配制)，用皮下注射器或微量吸管，小心地先吸取浓度最大的溶液注入离心管底，然后依次加入较低的各个浓度(40%→5%)，一层覆盖着一层地层加于离心管中，注意避免产生气泡。假如各层界面被冲动破坏，则应重新制备。也可]以将长针头插入管底，依次从浓度低到高加入各溶液。 连续的密度梯度的制备 为了产生一个连续的密度梯度，常用梯度混合装置来制备梯度。 [HT5”SS][JZ]图13-6〓简易的密度梯度溶液制备装置 [JZ]A、B为盛蔗糖溶液的玻璃管。 [JZ]1 活塞双通；2 搅拌棒；3 活塞；4 连接处；5 聚乙烯小管 [HT5SS]梯度混合装置如图13-6，由A和B管组成。两管之间用双通活塞联结。在活塞]关闭的状态下，向A管中加入低浓度蔗糖溶液，向B管中加入高浓度的蔗糖溶液，两管中容量要相等。在B管出口处用一根聚乙烯小管连接到离心管。在给B管充液时，可将聚乙烯小管的流出口向上转动，使之超过液体的水平面，从而阻止液体流出。充液后可将小管接到离心管中使之贴着管壁，然后开动小搅拌器，使搅拌棒转动，同时打开两管间活塞。这三个操作要同时进行，以保证梯度的连续性。当梯度液体自B管流出时不允许移动离心管，待离心管中所盛的梯度溶液的体积达到需要量之后，将离心管小心地静止于4℃1～2小时，以平衡之。 现在不少“制备用超速离心机”携带有“密度梯度制备自动装置”。按照这个方法制备的蔗糖浓度梯度，理论上按下式计算： [JZ]C=C A-(C A-C B)(1-V) -b/a A管和B管的横断面积各为a、b，其中所含蔗糖浓度分别为C A、C B，两液开始混合以]后流出Vml时流出液的浓度为C。A和B管的横断面积一般情况下相等，故a=b，这时获得的梯度为直线梯度。如果a≠b时，离心管中浓度梯度产生凸形和凹形梯度曲线。这些浓度梯度是根据样品和实验目的而专门选用的。一般使用的浓度梯度范围为20%→5%，40%→10%，或60%→10%等。 (2)加入样品：用如上所述注射器或微量吸管吸取悬浮于适宜缓冲液中的病毒或核酸样品(约梯度介质体积的1/10容量)，从液面上方1mm处，紧贴着离心管壁轻轻层加于梯度介质面上。 (3)高速或超速离心：将加入样品的离心管装入套管内，也可将离心管置于转头的套管内，以免在装进套管时震动液体。拧紧套管螺帽，将套管吊在水平转头上，置于离心机内。梯度离心一般用高速或超速离心机。离心速度和时间，根据所分离的样品选定。离心开始，样品中各种粒子逐渐分离，分布于相应的密度梯度层中成为带状(如为透明的聚碳酸酯离心管，则可以清楚地见到带状分离，并拍照)。离心时间到时，使离心机自然停止，不许制动，以免破坏梯度。 (4)梯度的分段收集(取样)：在离心完了以后，为了把已分离物质的各条带分开，必须取出梯度溶液。梯度溶液的分段收集方法有如下几种。 　 ①取代法：从离心管底部穿刺或将带长针头的注射器插入离心管底，使一种稠密]的介质，如60%～70%(W/V)蔗糖溶液，缓慢地注入于离心管底部。然后用一个注射器或移液管，从上面逐一移出各部分。或者在离心管的颈部加上一个塞子，这个塞子附着一根收集导管，通向一个部分收集器，收取各部分。 ②穿刺法：将离心管固定于特制的固定架上，在其底部装上一个垂直向上的空心针穿刺，使梯度溶液自由滴出，可用部分收集器或用小试管分段收集。超速离心机一般都带有此装置。此装置的缺点是离心管在用一次后即废弃。 　 ③虹吸法：此法的优点是不必穿刺离心管，离心管可反复使用。经多次试证实，此法简]便易行，对梯度密度无破坏。用一根大穿刺针截两段做虹吸管，以接上50～100ml玻璃注射器进行送气的方法，分段收集梯度溶液。 [HT5”SS][JZ]图13-7〓从分部密度梯度中的分部收集 [HT5”SS][GK4]从分部密度梯度中的分部收集A、B部分由有机玻璃制成，并利用螺帽C]紧密地装在一起，利用O形垫圈封起来。通过注入浓蔗糖溶液使管内成分缓缓向上挤入锥形]收集中而流出 [HK]　[HT5SS]　④注射器吸取法：用弯曲的针头(J状)接在注射器上，从梯度最上层开始向]下逐层小心吸取液体。 　 6.梯度各层液体的密度测定 　 (1)称重量法：用10ul微量注射器吸取样品，加入于已知重量的毛细管中，在1/10万分析天秤上称重，计算重量(g/ml)，即为梯度溶液的密度。 　 (2)测定折射率法：用阿贝氏折光仪测定各梯度层溶液的折射率(25℃)，然后按照前述的公式ρ 25 =a?ｎ 25 D-b　换算成密度(g/ml)。 (3)浮漂法：向已制备好的各种密度溶液中滴入一滴样品，找出相应的样品浮密度溶液，即为该梯度层的密度。 　 7.各梯度分层液中病毒分布的鉴定 (1)以紫外分光光度计测定蛋白质和核酸吸收峰。吸取各层梯度溶液，用蒸馏水或缓冲液适当稀释后，测定波长280和260nm的OD值。然后以各梯度层管号为横坐标，其OD值为纵坐标画曲线，即为各梯度层中蛋白质 病毒含量图，有些病毒260nm]OD值较高。 (2)以各种血清学方法测定各梯度层中病毒的抗原效价；或用组织培养法测定病毒滴度，证实病毒分布区域。 　 (3)用电子显微镜负染法观察病毒粒子及其纯度。将各梯度层样品装入透析袋中，置于适宜的溶液中透析去盐，然后取一滴样品用蒸馏水稀释，滴附于铜网膜上，用磷钨酸负染后电镜下观察病毒粒子。   1) （4 M KCl and 50 mM Tris-HCl, pH7.2）：（病毒悬液）=1：3； 2) 或者，直接加KCl到病毒悬液中，终浓度为1M； 3) 轻晃混匀，冰上放置15-30分钟 4) 离心12,000 g 10分钟4°C，收集上清 5) 分装-80保存