生理生化实验

(第10章  肠杆菌科 一、教学大纲要求 （1）肠杆菌科分类 （2）肠杆菌科细菌共同特性 （3）肠杆菌科各菌属特性 （4）肠杆菌科细菌临床意义 （5）肠杆菌科各菌属鉴别 （6）肠杆菌科实验室检查 二、教材内容精要 （一）肠杆菌科概述 1．分类 肠杆菌科是一大类生物学性状相似的革兰阴性杆菌。与临床医学密切相关的肠杆菌科细菌主要有14个菌属：埃希菌属、志贺菌属、爱德华菌属、沙门菌属、枸橼酸菌属、克雷伯菌属、肠杆菌属、哈夫尼亚菌属、多源菌属、沙雷菌属、变形杆菌属、摩根菌属、普罗威登斯菌属、耶尔森菌属。 2．肠杆菌科共同特性 （1）生物学特性：革兰阴性杆菌，无芽胞，有菌毛，多数有周身鞭毛。需氧或兼性厌氧，营养要求不高，生化反应活跃，氧化酶－，发酵葡萄糖产酸、产气或不产气，触酶＋，能还原硝酸盐为亚硝酸盐。 （2）抗原构造：肠杆菌科抗原构成主要有菌体抗原（O抗原）、鞭毛抗原（H抗原）、 表 关于同志近三年现实表现材料材料类招标技术评分表图表与交易pdf视力表打印pdf用图表说话 pdf 面抗原、菌毛抗原等。O抗原与H抗原为肠杆菌科血清学分群与分型的依据，但是O抗原与相应抗体之间的反应可被表面抗原和菌毛抗原阻断。 （3）毒力因子：主要有菌毛或菌毛样结构、荚膜或微荚膜、外膜蛋白、内毒素及外毒素等。 3．临床意义 肠杆菌科细菌多为肠道正常菌群，除沙门菌属、志贺菌属、埃希菌属部分菌种、耶尔森菌属有致病作用外，其余均为条件致病菌，可导致医院感染。 4．鉴定与鉴别 （1）科间鉴别：氧化酶阴性基本可将肠杆菌科与弧菌科、非发酵菌、巴斯德菌科区别开来。后3类菌均为阳性(表10-1)。 表10-1  肠杆菌科与其它革兰阴性杆菌区别 试 验 肠杆菌科 弧菌科 发酵菌 巴斯德菌科 葡萄糖氧化、发酵 发酵 发酵 氧化或不分解 发酵 氧化酶 － ＋ ＋* ＋ 形态 杆状 弧状、杆状 杆状 球杆状 鞭毛 周鞭毛或无 单鞭毛 单、丛、周鞭毛或无 无鞭毛 注：*不动杆菌、嗜麦芽窄食单胞菌除外           （2）分类鉴别：用苯丙氨酸脱氨酶试验和葡萄糖酸盐试验可将肠杆菌科分为三大类(表10-2)。 表10-2  肠杆菌科初步分类 苯丙氨酸脱氨酶 葡萄糖酸盐 菌属 － － 埃希菌属，志贺菌属，沙门菌属，枸橼酸菌属，爱德华菌属，耶尔森菌属 ＋ － 变形杆菌属，普罗威登斯菌属，摩根菌属 － ＋ 克雷伯菌属，肠杆菌属，沙雷菌属，哈夫尼亚菌属，耶尔森菌属       （3）属、种、群、型的区分：根据不同菌属的生物学特性、血清学特性等可将已分类的肠杆菌科细菌鉴定到属、种、群、型、株。 （二）埃希菌属 本属以大肠埃希菌为代表种。 1．细菌特性 大肠埃希菌为革兰阴性杆菌，直杆状，周鞭毛，能运动，有菌毛。 具有O抗原、H抗原、K抗原，其血清型别按O∶K∶H的顺序排列，以数字表示，如O111∶K58∶H2；O157∶H7等。 兼性厌氧，营养要求不高，菌落为灰白色、圆形，在肠道选择培养基上能发酵乳糖产酸形成不同颜色的菌落。 生化特征为：发酵多种糖类产酸产气，KIA：AA+-，脲酶-；IMViC++--。 2．临床意义 大肠埃希菌是临床最常见的革兰阴性杆菌，也是医院感染常见病原菌，可引起各种肠道外感染和肠道内感染。引起肠道内感染的亦称为致腹泻大肠埃希菌，分为五组： （1）肠产毒性大肠埃希菌（ETEC） ETEC致病机制主要通过产生LT和ST肠毒素导致腹泻和中毒症状，是旅游者腹泻和婴幼儿腹泻的常见病因，导致恶心、腹痛、低热和类似轻型霍乱的急性水样腹泻。 （2）肠致病性大肠埃希菌（EPEC） 是婴儿腹泻的重要病原菌，可导致发热、呕吐、严重水泻和粘液便，常引起婴儿脱水性酸中毒。 （3）肠侵袭性大肠埃希菌（EIEC） 与志贺菌有共同抗原，可引起类似志贺菌肠炎的症状，如发热、腹痛、水泻或典型菌痢的里急后重症状，并出现脓血粘液便。 （4）肠出血性大肠埃希菌（EHEC） 主要血清型为O157∶H7，引起出血性结肠炎（HC）。表现为腹痛、水泻、血性便。主要见于婴幼儿。以暴发流行为主。O157∶H7感染者中有少部分可发展成为溶血性尿毒综合征（HUS），出现溶血性贫血、血小板减少性紫癜和急性肾功能不全。 （5）肠凝聚性大肠埃希菌（EaggEC） 引起婴儿急性或慢性水样腹泻伴脱水，偶有腹痛、发热与血便。 3．微生物学检验 （1）标本采集  无菌方法采集各类感染标本及时送检；粪便标本宜采集新鲜、有脓血、粘液的部分。 （2）检验方法 1）显微镜检查  为革兰阴性杆菌。 2）分离培养  标本接种于BAP、SS、MAC/EMB培养基、或增菌培养基，置35℃孵育18～24h，观察菌落。尿液培养须作菌落计数。 3）鉴定与鉴别 ①肠道外大肠埃希菌：本菌因发酵乳糖产酸在MAC上为红色菌落，在EMB上为紫黑色菌落。生化特性如符合即可鉴定为大肠埃希菌。 ②肠道内大肠埃希菌：致腹泻大肠埃希菌的基本生物学特性与肠道外大肠埃希菌相似，但分别具有特殊的血清型、肠毒素或毒力因子。因此，须通过不同的方式来鉴定种、型。 ETEC：主要通过测定ST和LT肠毒素来鉴定。须用生物学方法（兔肠结扎试验，乳鼠灌胃试验、细胞培养等）、免疫学或分子生物学方法来检测。 EPEC：用EPEC分型血清作O∶H分型。 EIEC：用EIEC O∶H血清进行分型；毒力试验为豚鼠眼结膜试验。与志贺菌主要鉴别试验是醋酸钠、葡萄糖铵和黏质酸盐试验，EIEC均为阳性，而志贺菌均为阴性。 EHEC：可用EHEC O∶H血清进行分型。美国CDC已建议将O157∶H7血清型列为常规检测项目。 EaggEC：采用液体培养-凝集试验或DNA探针检测。 4．耐药性 大肠埃希菌的耐药性主要表现在产生超广谱-内酰胺酶（ESBL）。产ESBL细菌对青霉素类、第1、2、3代头孢菌素及单环菌素耐药，仅对头霉素类、碳青霉烯类及酶抑制剂（克拉维酸）敏感。 （三）沙门菌属 沙门菌属有多种血清型，95%以上沙门菌都属于A～F群。临床常见沙门菌为：伤寒、猪霍乱、甲、乙、丙型副伤寒沙门菌，鼠伤寒和肠炎沙门菌等。 沙门菌无芽胞，无荚膜，有周鞭毛。兼性厌氧，营养要求不高。在普通琼脂上为无色、半透明中等大小菌落。在肠道杆菌选择性培养基上为透明、半透明菌落，与志贺菌相似。大多数菌株能产生H2S，而在SS琼脂上形成黑色中心的菌落。 O抗原是沙门菌分群的依据。H抗原为沙门菌分型的依据。表面抗原以Vi抗原为代表：常存在于伤寒沙门菌、丙型副伤寒沙门菌，Vi抗原能阻断O抗原与相应抗体发生凝集，加热可将其破坏。 生化特性KIA：KA+/-+/-；IMViC-+--/+，动力、赖氨酸脱羧酶均+，尿素酶-。 沙门菌可引起以急性胃肠炎或食物中毒、菌血症（败血症）、伤寒、副伤寒。 目前沙门菌已出现耐药现象，以鼠伤寒沙门菌为主，应注意耐药监测。 疑为伤寒沙门菌感染可于第1周采血，第2、3周取粪便，第3周也可取尿液，全病程取骨髓做培养。将标本增菌或直接接种BAP、MAC、SS培养基。若SS、EMB或MAC培养基上生长出无色透明，或黑色中心菌落则进一步鉴定。常见沙门菌的主要生化反应(表10-3)。 表10-3  常见沙门菌的主要生化反应 试验 非伤寒沙门菌 伤寒 副伤寒A KIA KA++ KA-+ W KA+-/＋W 吲哚 － － － 枸橼酸盐 ＋ － － 脲酶 － － － 赖氨酸 ＋ ＋ － 鸟氨酸 ＋ － ＋ 动力 ＋ ＋ ＋ 注：K：产碱；A：产酸；A：产酸；＋：90%～100%菌株阳性；－：90%～100%菌株阴性；＋W：弱阳性         血清分型鉴定：首先用A～F多价O血清初步鉴定，再用单价O因子血清鉴定到群（A、B、C、D、E、F），接着用H因子血清第一相（特异相）定型，最后用H因子血清第二相（非特异相）辅助定型。若细菌生化反应符合沙门菌，而A～F多价O血清与细菌不产生凝集现象，应考虑是否有表面抗原（Vi）存在，应加热或传代去除Vi抗原后再进行A～F多价O血清凝集试验。 血清学诊断：常用肥达反应检测，判断 标准 excel标准偏差excel标准偏差函数exl标准差函数国标检验抽样标准表免费下载红头文件格式标准下载 如下： ①伤寒沙门菌O凝集效价≥1∶80，H效价≥1∶160，副伤寒A、B、C的H效价≥80有诊断意义； ②单次检测效价增高不能定论，应在病程中逐周动态复查，若效价递增或恢复期比初次效价≥4倍者有诊断意义； ③一般O、H均升高，伤寒可能性大；O不高而H高可能为预防接种的回忆反应；O高而H不高则可能为感染早期或与O抗原有交叉反应的其他沙门菌感染，可于一周后复查，如H升高则可诊断为伤寒。 （四）志贺菌属 伯杰细菌鉴定手册将志贺菌属分为A、B、C、D 4群和44个血清型。A群为痢疾志贺菌，B群为福氏志贺菌，C群为鲍氏志贺菌，D群为宋内志贺菌。志贺菌是细菌性痢疾的病原体。 志贺菌无芽胞，无荚膜，无鞭毛，多数有菌毛。兼性厌氧，营养要求不高，在肠道杆菌选择性培养基上呈无色菌落。 志贺菌属典型生化反应模式为KIA：KA――（宋内志贺菌个别菌株可迟缓发酵乳糖）。IMViC－/＋＋－－，脲酶－，动力－。 标本采集应在抗生素使用前采集新鲜粪便中脓、血、粘液部分，床边接种或立即送检，昏迷不能排便病人可用肛拭取样。将标本接种于肠道鉴别培养基MAC/EMB，选择培养基SS，如有无色半透明菌落生长，取可疑菌落进行鉴定。符合典型生化反应模式可进行血清学鉴定。血清学鉴定首先用志贺菌属4种多价血清作玻片凝集试验，如凝集再用A群、B群、C群、D群单价血清鉴定到种、型。实验中应注意K抗原的阻断作用，并应考虑是否为EIEC。 志贺菌属各群间的鉴别，见表10-4。志贺菌与EIEC鉴别可用葡萄糖铵、醋酸盐、黏质酸盐试验，前者均为阴性，后者均为阳性。志贺菌属与类志贺邻单胞菌鉴别可用氧化酶、动力试验，志贺菌为阴性，后者均为阳性。志贺菌属与伤寒沙门菌鉴别可用动力、H2S试验和O9抗原检测，前者均为阴性，后者均为阳性。 表10-4  志贺菌属各群间生化反应鉴别 生化反应 A群 B群 C群 D群 -半乳糖苷酶 － － － ＋ 鸟氨酸脱羧酶 － － － ＋ 甘露醇 － ＋ ＋ ＋ 吲哚 ＋/－ ＋/－ ＋/－ －           （五）克雷伯菌属 克雷伯菌属有5个种，即肺炎克雷伯菌、产酸（催娩）克雷伯菌、解鸟氨酸克雷伯菌、植生克雷伯菌和土生克雷伯菌。其中肺炎克雷伯菌又可分为3个亚种：肺炎克雷伯菌肺炎亚种、臭鼻亚种、鼻硬结亚种。克雷伯菌属中肺炎克雷伯菌是重要的条件致病菌之一，可引起典型的原发性肺炎，也可引起各种肺外感染。 肺炎克雷伯菌有荚膜，有菌毛，无芽胞，无鞭毛。兼性厌氧，在麦康凯平板上形成红色粘稠菌落。克雷伯菌属生化特性为：KIA：AA+-，IMViC－/＋－＋＋，脲酶多＋，动力-。种间鉴别见表10-5。