Ca2·CaM信使系统参与小麦抗叶锈病反应的分析

摘要 本文选用小麦抗叶锈病近等基因系 TcLrl5 不同叶锈菌生理小种配置亲和互作和 非亲和互作，结合钙调素 (CAM) 效应剂预处理和 CaM 基因表达 分析 定性数据统计分析pdf销售业绩分析模板建筑结构震害分析销售进度分析表京东商城竞争战略分析 ，对小麦与叶锈 菌亲和互作和非亲和互作过程中 CaM 与防卫反应相关酶活性的关系以及 CaM 及其不同 亚型基因表达的动态变化进行研究，探讨 Ca2+·CaM 信使系统对小麦抗叶锈病反应的 调控作用及其亚型特异性。实验结果如下： 1 ． Ca2+ 预处理明显提高亲和互作中过氧化物酶 (POD) 和苯丙氨酸酶 (PAL) 的活 性，接种后 48 h 时 POD 和 PAL 的活性分别提高了 44 ． 09 ％和 17 ． 89 ％； Ca2+ 预处理对 多酚氧化酶 (PPO) 和过氧化物酶 (CAT) 的活性无明显影响。 2 ． CaM 拮抗剂 · 三氟拉嗪 (TFP) 、 氯丙嗪 (CPZ) 和 N 一 (6-aminohexyl) 一 5 一 chloro 一卜 naphthalene sulfonamide) (W-7) 预处理均可以 抑制小麦一叶锈菌非亲和互作中的 POD 、 PAL 、 PPO 和 CAT 活性。 3 ． TFP 、 CPZ 和 W 一 7 浸种处理明显推迟由非亲和叶锈菌诱导的 POD 活性升高 的起始时间，并且在整个离体培养过程中 PoD 活性均比未处理对照的 POD 活性低。接 种 120 h 后 TFP 、 CPZ 和 W-7 预处理与未处理对照的相比，其 POD 活性分别降低了 35 ． 90 ％、 29 ． 69 ％和 41 ． 67 ％；其 PAL 活性分别下降了 26 ． 01 ％、 21 ． 98 ％和 19 ． 03 ％； TFP 、 CPZ 和 W-7 预处理后接种非亲和性菌 48 h 时与未处理接菌对照相比，其 PPO 活 性分别下降了 9 ． 42 ％、 8 ． 44 ％和 12 ． 18 ％； TFP 、 CPZ 预处理的 CAT 活性变化趋势和 幅度与未处理接菌对照相比无明显差异，只是在接种 72 h 时活性分别下降 22 ． 04 ％、 30 ． 22 ％和 28 ． 35 ％。 4 ．小麦接菌后在前 12 h 内 CaM 的四个亚型基因表达量与不接菌对照相比相差不 大。小麦接种非亲和叶锈菌后 48 h 、 72 h 、 96 h 时 CaM ． 5 卜 J 基因表达量比亲和 组合的分别高 24 ． 6 ％、 26 ． 6 ％、 38 ． 8 ％。小麦接非亲和叶锈菌后 24 h 、 48 h 时 CaM 。铲 --4 基因表达量就已经分别高出亲和组合的 26 ． 8 ％和 28 ． O ％。但在小麦接种非亲和 叶锈菌 24 h 到 96 h 这一过程中 CaM ．铲誓基因表达量均低于亲和组合中 CaM 跖鼍基 因表达量，而 CaM 研 Ⅺ 基因表达量与亲和组合中 CaM 甜 Ⅵ 基因表达量相差不大。 5 ．小麦接菌后在第 24 h 、第 48 h 时非亲和组合中 CaM 基因表达量要高于亲和 组合中 CaM 基因表达量，分别高出 18 ． 1 ％和 47 ． 9 ％，而在第 72 h 和第 96 h 时非亲 和组合中 CaY 基因表达量又低于亲和组合 CaM 基因表达量。 上述结果暗示，小麦中 Ca2+·CaM 信使系统可能参与了小麦抗叶锈病反应，并且具 有亚型特异性。小麦中＆川．妒 J 基因与 CaMSF-4 基因可能与小麦抗叶锈病相关。 CaM SF-2 基因可能与小麦感叶锈病相关，而 CaM SF-3 基因可能不参与小麦抗叶锈病反 应。 关键词： 小麦；叶锈菌； Ca2+·CaM ； CaM 拮抗剂；实时定量 PCR 优秀毕业论文 精品参考文献资料 Involvment of Ca2+-CaM Signaling in Resistance Response of Wheat to Its Leaf Rust Disease Author ：． Hno Jianfei Supervisors ： Professor Liu Daqun Professor Song Shuishan Major ： Plant Pathology Abstract The regulatory effects of Ca2+·C 州 signaling and the isoform specificity of C 心压 on the resistance response of wheat to its leaf rust disease were investigated by biochem—phamaceutical and molecular approach using the wheat isogeneic line and the suitable Puccinia triticica as materials ． The results were as followings ： 1 ． 111e activities of peroxidase(POD)and phenylalanine ammonialyase(PAL)in the detached wheat leaves were increased 44 ． 09 ％ and 1 7 ． 89 ％． respectively,by the pretreatment of seed of TcLrl 5 with 20 mmol ／ L CaCl2 at 48 h after the detached leaves were inoculated with virulent race 05—22—64① ， if compared to that of without Ca 十 pretreatment ． No difference in the activities of polyphenoloxidase(PPO)and catalase (CAT)Was found between treatment and untreatment ． 2 ． The activities of POD ， PAL ， PPO and CAT in the detached wheat 1eaves were all inhibited by the pretreatment of the seed of TcLrl 5 with CaM antagonists trifluoperazine (TFP) ， chlorpromazine(CPZ)and 【 (N-(6-aminohexyl)-5-chloro-1·naphathalene sulfonamide) 】 (W ． 7)after the detached leaves were inoculated with avirulent race 05 ． 5 ． 127③ ． 3 ． The induction of POD activity in the detached wheat leaves by the avirulent race was delayed by pretreatment with three kinds of CaM antagonists tested in this study and the activity of POD Was lower than the control during the incubation period ． At 1 20 h after inoculation,the POD activities were decreased by 35 ． 09 ％， 29 ． 69 ％， and 41 ． 79 ， respectively,by the pretreatment with TFP ， CPZ and W 一 7 if compared that of control ， while the PAL activities were decreased by 26 ． Ol ％， 21 ． 98 ％ and 19 ． 03 ％． At 48 h after inoculation,PPO activities in the detached wheat leaves were decreased bv 9 ． 42 ％、 8 ． 44 ％ and 1 2 ． 1 8 ％ by TFP ， CPZ and W·7 respectively if compared to that of without TFP ， CPZ and W 一 7 pretreatment ． 11 圮 C√ 盯 activities of detached wheat leaves pretreated with TFP and CPZ were decrease by 22 ． 04 ％ and 30 ． 22 ％ and 23 ． 2 ％， respectively,at 72 h after inoculation when compared to the contr01 ． 4 ． The level of CaM and four CaM isoforms gene expression in wheat TcLrl 5 was tested by real-time Fluorescent Quantitative PCR(real·time PCR)after inoculation wi 血 virulent race and avirulent race respectively ． No significant difference in the gene expression of CaM and its four isoforms was observed between the detached wheat leaves inoculated with virulent and without until 1 2 h after inoculation ． The gene expression of CaM sF ． 1 in wheat at 48 h 、 72 h and 96 h after inoculation with avirulent Face 05 ． 5 ． 127 (9 were increased by 24 ． 6 ％， 26 ． 6 ％ and 38 。 8 ％ compared with that of inoculation with virulent race 05-22—64① ． The gene expression of CaM 肛 4 at 24 h 48 h after inoculation with avirulent race 05-5—127( 蓼 were increased by 26 ． 8 ％ and 28 ． 0 ％ if compared to that of inoculation with virulent race 05-22—64① ． The gene expression of CaM ． SF 一 2 in the incompatible interaction Was lOWer than that of compatible interaction control from 24 h to 96 h after inoculation ． No obvious difference in gene expression level of CaM ．舛 3 between compatible and incompatible interaction Was found ． 5 ． The gene expression of CaM in wheat after inoculation with avirulent race 05 ． 5 ． 1 27 ( 蓼 at the 24 h and 48 h were increased by 18 。 1 ％ and 47 。 9 ％ if compared to that of inoculation with virulent race 05—22-64① ， however,the gene expressive quantity of C 洲 in wheat at 72 h and 96 h after inoculation with avirulent race 05 ． 5 ． 1 27(9 iS lOWer thall mat of inoculation with virulent race 05 ． 22 ． 64① ． Taken together,these data implied that Ca p·CaM signaling might be involved in the regulation on wheat resistance against its leaf rust disease ． More OVer,there exist a CaM isofoFin specificity for the involving in wheat defense against the infection of Puccinia triticina 。 The CaM sF ． 1 and CaM sF ． 4 genes may be related to wheat against the Infection of Puccinia triticina ． The CaM SF ． 2 may be related to wheat susceptible to the infection of Puccinia trt 娃 cina ． The CnM sF ． 39ene may be not related to wheat against the Infection of Puccinia triticina ． Keywords ： wheat ； Puccinia triticina ； Ca 2+"CaM ； CaM antagonists ； real ． time PCR 独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的 研究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其 他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得塑皇垦壅些盘堂或其他 教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任 何贡献均己在论文中作了明确的说明并表示谢意。 学位论文作者签名：锤建孓 签字日期： ≯ 叻方年彳月 f 日 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解塑皇垦壅些盘堂有关保留、使用学位论文的规 定，有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查 阅和借阅。本人授权塑皇堡盔些盘鲎可以将学位论文的全部或部分内容编入有关 数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。 ( 保密的学位论文在解密后适用本授权书 ) 学位论文作者签名： 窄建存 J 签字日期： a 稍年 f 月 I El 学位论文作者毕业后去向： 工作单位： 电话： 通讯地址： 邮编： Ca2+ ． CaM 信使系统参与小麦抗叶锈病反应的研究 1 引言 由小麦叶锈菌 (Puccinia triticina) 引起的小麦叶锈病是影响世界小麦稳产高产的重要病害之 一，也是影响我国小麦生产的重要因素。该病害在世界各产麦区均有发生【 l 捌，严重时可造成 40 ％ 的产量损失 [31 。所以，对小麦抗叶锈病研究至关重要，许多学者从不同角度对其研究，近年来， CaM 参与的信号转导途径己成为人们研究的热点，对小麦抗叶锈病过程中 CaM 进行研究，探讨 其可能的调控机制，对于合理利用小麦抗叶锈病基因，提高小麦的抗病性，确保小麦的高产、稳 产具有非常重要的意义。 研究表明，小麦受叶锈病菌侵染后会产生各种抗病反应，包括过氧化物酶 (POD) 、苯丙氨 酸解氨酶 (PAL) 活性的升高【 4’51 ，诱导多种病程相关蛋白的积累【 6 】，细胞组织结构的变化【 7 】，细 胞骨架的重组等。植物的抗病反应受复杂的信号转导网络的调控，许多信号转导途径和信号分子 参与植物的抗病反应。 Ca2+ 信号是植物细胞中广泛存在的主要胞内信使，大量研究结果表明， Caz+ 信号参与植物防卫素的合成，抗病相关基因的诱导和过敏反应【 8 】【 9 】，采用两种不同的植物．病原物 ／激发子互作系统研究发现，当病原物侵染时，植物细胞内 Ca2+ 浓度表现特异的双期 “Ca2+ 签名 ” ， 即 Ca2+ 浓度首先有一个非特异的 瞬时提高，而后维持在较高的水平 Ilo 】。 FlegoIll] 等报道，植物细 胞内 Ca2+ 浓度的升高与其对病原细菌．欧文氏菌的抗性提高之问存在正相关关系。一般认为， Ca2+ 信号是通过植物细胞内 Ca2+ 信号感应器或 Ca2+ 结合蛋白转导 Ca2+ 信号，激活下游感应器，调控各 种细胞内反应的。钙调素 (Calmodulin ， CaM) 是植物细胞内 Ca2+ 信号的主要受体，参与许多生 命活动的调节。植物中存在许多 CaM 基因，组成一个 CaM 大家族，不同的基因编码不同的 CaM 亚型。研究表明， CaM 参与植物的抗病反应，且不同的 CaM 亚型可能调控不同的抗病途径。但 是，对于 Ca”·CaM 信号系统是否参与和如何参与基因组复杂的小麦和叶锈病菌互作体系中小麦 抗叶锈病反应，国内外尚未见相关报道。 钙调素 (Calmodulin ， CaM) 是一种分布最广，功能最重要的钙依赖性调节蛋白。其译名 有钙调蛋白、钙媒介蛋白、钙依赖性调节蛋白、环磷酸二脂酶、激动蛋白、肌钙蛋白 “c” 样蛋白等。 它是 1964 年美籍华人张槐耀在研究细胞内 c ． A ． JVIP 的浓度变化中，环腺苷酸磷酸二脂酶 (PDE) 的调 节作用时，发现部分纯化的牛脑 (PDE) 活力竟低于粗提液。从而确证有某种 “ 激活物 ” 存在于粗提 液中。后经证实，此 “ 激活物 ” 为一种含钙蛋白。 grostinger 建议命名为 (Calmodulin ， caM) ，我国于 1987 年定为钙调素【 12 】。它广泛存在于真核细胞中，是一种以 Ca2+ 受体形式参与细胞中 20 多种酶 及许多钙依赖性生理过程调节的，能调节细胞生长、分化甚至转化的极为重要的多功能蛋白质 ll 引， 由它介导的 CE+ 功能远比枷广泛且在生物学上有着更重要的意义。 1 ． 1 关于 CaM 1 ． 1 ． 1 CaM 的结构 CaM 是由 19 种 148 个氨基酸组成的单链可溶性球蛋白，分子量 16700 ，有 4 个 EF 臂能结合 4 个 Ca2+ ，分别被称之为结合域 I ， II ， III ， Ⅳ 。 EF 臂是由一个中央螺旋连结两个球状结构所形成 河北农业大学硕士学位 ( 毕业 ) 论文 的螺旋．线．螺旋的结构，每两个 EF 臂由一条长的可自由伸展的 a 螺旋连结成一组【 14 儿 ”J 。 CaM 在 进化过程中具高度保守性，所有哺乳动物的钙调素有 90 ％的氨基酸序列相似性，植物钙调素与脊 椎动物和酵母的氨基酸序列相似性分别为 91 ％和 84 ％，与藻类的相似性为 840 ／ , ．． ,,100 ％。 CaM 具 热稳定性，酸性 ( 等电点 3 ． 94 ． 3) ，其中 l ／ 3 是带有侧链的谷氨酸和天冬氨酸具疏水性，与 Ca2+ 结 合后分子构象发生改变，由哑铃状变为球状， CaM 的疏水区呈激活态，与无活性依赖于 CaM 介 导的酶如 PDE 相互作用，其构象进一步发生改变，增加催化活性。 CaM 这些性质和特点可能是 CaM 拮抗剂的作用基础，如三氟拉嗪 (TFP) 年 n 苄基异喹啉类化合物【 1 6'171 。 CaM 是在晚 Gl 期合 成的【 l 町。 Lin 等认为 CaM 可能是在核糖体中合成，然后释放到细胞溶质中再与细胞器膜发生作 用【 191 。 Ca2+-CaM 是 CaM 活化形式，它能调节 20 多种酶的活性。 Ca2+-CaM 对靶酶的活化有下列 两种方式： (1) 直接与靶酶结合，如 PDE ， Ca2+ ． M92+_ATP 酶磷酸化激酶、环化酶等； (2) 通过依 赖 Ca2+-CaM 的蛋白激酶，使靶酶磷酸化产生生化效应。 1 ． 1 ． 2 CaM 的亚型 脊椎动物中有多种 CaM 基因，但它们编码的 CaM 蛋白具有完全一致的氨基酸序列，而在 植物中发现的多种 CaM 基因，它们编码相同或相似的蛋白，这些蛋白都具有 E F 一手型 Ca2+ 结 合结构域，都能够与 Ca2+ 结合，因此将这些 CaM 及其相似蛋白称为 CaM 亚型 (isform) 【 2 叩 11 。 这些 CaM 亚型在植物生长发育过程中以及对不同刺激信号的反应性中的基因表达状况不同。 CaM 亚型的氨基酸组成变化可能使其与不同的靶蛋白相互作用，从而完成不同的生物学功能。植 物中多种 CaM 亚型的存在进一步增强了 Ca2+ 信号介导的信号网络的多样性和复杂性。 到目前为止，在不同植物中已分别克隆到多种 CaM 基因，植物体中广泛存在 CaM 多基因家 族已是不容置疑的事实。拟南芥中 CaM 亚型是最早得到克隆的，目前至少已经克隆到 9 个 CaM 基吲 22 ， 23’24,25251 ；马铃薯口 61 、大豆【 271 、小麦闭中分别分离鉴定了 8 、 5 、 10 个 CaM 基因。另外， 在玉米【 291 、豌豆【蚓等中都克隆到了不同的 CaM 多基因家族。其中，以马铃薯和大豆的植物 CaM 多基因研究较为深入。 Take z awa 掣 25 】分析马铃薯中 8 个 CaM 基因 P c M 1 ． 8 的结构表明， PCMl 、 5 、 7 和 8 与通常的 CaM 基因一样，均含有 2 个外显子及 1 个内含子 (1 ． 5 ． 2 ． 7kb) ； 而 PCM2 、 3 、 4 和 6 则没有第一个外显子。比较 8 种基因的编码区表明，这些基因序列高度保守，而在 5’ 和 3’ 非 编码区则存在很大的差异。从比较根据基因推断出的蛋白序列来看， PCM5 、 6 、 7 、 8 的序列完 全相同，且和拟南芥的 ACAM ． 2 以及大麦 CaM ． 1 编码的蛋白十分相似； PCM ． 1 则含有特殊 的氨基酸序列，特别是在第四个 Ca"+ 结合区的氨基酸序列与其它几种不同，但与鸡 CaM 的第四 个 Ca2+ 结合区完全相同。 Lee 等【 2‘7 】用水稻的 CaM 基因为探针，从四天龄的大豆黄化苗下胚轴组 织制备的 c D N A 文库中克隆到 5 个 CaM 的 eDNA(SCaM 1 ． 5) ，比较推断的氨基酸序列表明 ( 图 1) ， sCaM ． 1 、 SCaM ． 3 编码相同的氨基酸序列； SCaM 1 、 SCaM ． 2 编码蛋白在 N 端 相差 2 个氨基酸； SCaM ． 4 、 SCaM ． 1 编码氨基酸相差 32 个； SCaM ． 5 、 SCaM ． 1 编码氨 基酸相差 33 个； S CaM ． 5 、 S CaM ． 4 编码氨基酸相差 15 个。可见 S CaM ． 4 和 S CaM ． 5 编码的 蛋白和 SCaM ． 1 编码蛋白相比具有很大的差异。 2 Ca2+ ． CaM 信使系统参与小麦抗叶锈病反应的研究 1 ． 1 ． 3 CaM 的分布 CaM 存在于一切真核细胞中。 CaM 与质膜，胞浆及细胞支架的成份有关。它定位于神经元 突起，核糖体，内质网，线粒体，纺锤体微丝微绒毛，小脑颗粒细胞，浦金野氏细胞，也存在于 胰岛基部和胃腺颈部细胞，小肠腺基部细剧引 J 以及精母细胞、精子细胞和精子的各部分及附睾中 [321 。在细胞内，它或游离于胞液中，或与膜和细胞器结合，其稳态浓度和种类视情况而定。 Ca M 分布因不同的细胞类型而有所改变。鸡胚成纤维细胞各部分均有 CaM ，其中以溶质部 分最岁 "J ：大鼠小脑 PurKinge 氏细胞和颗粒细胞 CaM 主要分布在核膜、内质网膜、质膜、线粒 体膜和突触后膜等内膜结构及游离和结合态的核糖体上；新生羊精子细胞中， CaM 定位在细胞核、 细胞质和发育着的顶体上，在精子发生和细胞成熟过程中， CaM 转移到细胞核周围，最后集中在 顶体后区域。表明 CaM 可能参与精子发生和成熟过程【 341 。 在细胞周期的不同时期， CaM 分布也不同，观察动物培养细胞时发现，在间期 CaM 主要分 布在细胞质的纤维结构上【 351 ，但在微管组织中心比较集中【 361 ；到了前期在细胞质中变为弥散状 分布，前中期时 CaM 主要分布在半纺锤体上，在中心粒周围区域；中及后期则转移到染色体与 纺锤体之间，末期则集聚在两个分裂细胞的细胞间桥末端。 CaM 可能参与了有丝分裂过程中对于 染色体运动的调节及对于细胞分裂过程中微管组装的调节。 一些刺激因子如激素、病毒、化学致癌物可使细胞内 CaM 水平持续升高 p 丌。如给大鼠注射 促肾上腺皮质激素后，细胞核中 CaM 萤光明显增强。 CaM 可能参与了激素作用下核过程的调节 例；促性腺激素释放激素可刺激 CaM 从细胞溶质向质膜再分布㈣； S 踟 'atosa 等通过部分切除大 鼠肝以诱发细胞增殖，结果肝细胞核中 CaM 水平增加了约三倍，同时细胞核中 CaM 分布也发生 了变化【柏 1 。 CaM 细胞外也存在 f41| 。 Crocker 等发现人白血病淋巴细胞的胞外 CaM 对其 DNA 合成和细胞 增殖起调节作用【 4 玉 431 。 1 ． 1 ． 4 CaM 与 ca2+ 的结合及钙调蛋白的作用原理 钙调素是植物细胞中胞内 Ca2+ 最重要的多功能受体蛋白。钙调素自身并没有酶活性，只有其 活化后进一步与其靶蛋自中的短肽序列结合，才能诱发其结构变化，从而调控植物细胞分裂、伸 长、生长、发育和抗逆等。 CaM 作用机理要点是： cE+ 与 CaM 结合而激活 CaM 活化了的 Ca2+-CaM 再与多种酶结合从而调节酶活力，最终引起生理生化反应，继而调控植物的细胞分裂、伸长、生 长、发育和抗逆等 [44’4s] 。 因此，同 Ca2+ 的结合是 CaM 活化的重要条件。普遍认为 CaM 的四个 Ca2+ 结合区中， N 端的 I 、 II 区为低亲和力区， C 端的 Ⅲ 、 Ⅳ 区为高亲和力区 ( 孙大业，郭艳林， 1991)t46J ，两者的半饱 和浓度分别是 l 1 ． 0 lunol ／ L 及 3 ． 01maol ／ L ， 高亲和力区结合 Ca2+ 会使低亲和力区对 Ca2+ 的亲和力增加。进一步研究表明两个成对的结合 区之间 ( 如 I 、 Ⅱ 区之间 ) 也存在协同作用 (Williams ， 1992)H 7 。。通过对 CaM 溶液的晶体学分析和 核磁共振研究可知道， CaM 分子一端的两个 Ca2+ 结合手形结构是相互关联的，在这两个结合区中， 相互对应的结合 Ca2+ 的环结构的肽段之间形成了反平行的 B ．片层结构，这样二者之间不可避免地 3 河北农业大学硕士学位 ( 毕业 ) 论文 表现对 Ca2+ 结合的协同性，即两个手形结构同时结合 Ca2+ 时对 Ca2+ 的亲和力要大大高于单独一个 手形结构对 Ca2+ 的亲和力。这种协同性可能和 CaM 结合 Ca2+ 的构象变化有关。 Yao 等【 481(1994) 用频域荧光光谱学方法分析 Y,b 麦茎 CaM 和 Ca2+ 结合后构象变化的具体细 节。用于检测构象变化的荧光来自于在 Ca2+ 结合区 Ⅳ 中 139 位的 Tyr 以及共价结合在 Ca2+ 结合区 I 中 27 位 Cys 上的 N ． 1(1 ．芘基 ) 顺丁烯乙酰亚胺 (PM) 或者 4 ．碘乙酰胺基水杨酸 (I ． ASA) 。结果表 明随着 Ca2+ 的结合， (1) 结合于 27 位 Cys 的 PM 和 IASA 以及 139 位 Tyr 的旋光性增加， (2) 整个 蛋白分子的旋光性降低， (3)27 位 Cys 和 139 位 Tyr 之间的分隔距离减小， (4) 中央螺旋构象的柔 韧性降低，因此 Ca2+ 结合后中央螺旋变得伸展而且有刚性。这种依赖 Ca2+ 的构象变化可使定位于 球状区域中的疏水结合位点暴露。 由于完整的 CaM 分子两端的 EF 手形结构对 Ca2+ 的亲和力不同，结合了 Ca2+ 的 CaM 分子 N 端 I 、 II 区中 Ca2+ 的解离速率比 C 端的 IⅡ 、 Ⅳ 区要快，所以被 Ca2+ 激活的完整的 CaM 分子很可 能通过 N 端 Ca2+ 的交换来敏感地反映环境中 Ca2+ 的浓度变化，进而调节整个 CaM 分子对 cE+ 的 结合状态，来完成激活向失活的转化。 CaM 分子的整体的构象变化是其执行生理功能的必要条件。 1 ． 1 ． 5 钙调蛋白的生理功能 CaM 生理功能的研究涉及面相当广泛，在酶活、性调节、细胞分裂与分化、细胞骨架与细胞 运动、光合作用、激素反应、核内酶系统及基因表达等生理过程中，都有参与 [461 。细胞内 Ca2+ 浓度的变化作为一种重要的调节信号，对多种细胞代谢活动均具调控作用。细胞自由 Ca” 的分布 与转移是形成 Ca2+ 信号的基础。当细胞接受环境刺激后，胞外钙离子的涌入和胞内钙库的释放会 使胞质自由 Ca2+ 浓度升高，升高后的 Ca2+ 会启动钙信号途径，激活 CaM ， CaM 会进一步激活依 赖的蛋白激酶 (CaMK) 或结合蛋白 (CaMBPs) ，蛋白激酶 的活化会导致代谢的关键酶或转录因子活 化，从而完成对细胞代谢活动或某些基因表达的调节 162 】。近年来关于 CaMK 和 CaMBPs 的研究也 业已成为钙信号系统研究的新的热点和焦点 1491 ． Gunther 等四】在对光敏素调控基因表达的研究中发现了光敏素信号传导系统中 Ca2+ 和 CaM 的 作用。他们巧妙利用细胞微注 A ． (microinj"ection) 技术，即用缺乏活性光敏素 (PhyA) 番茄突变做 aurea 做受体，将小麦 cab 基因 ( 编码 PS 的叶绿素 a ／ b 结合蛋白 ) 的启动子和 报告 软件系统测试报告下载sgs报告如何下载关于路面塌陷情况报告535n,sgs报告怎么下载竣工报告下载 基因 ( 编码 p 葡萄糖苷酶 ) 的融合基因注入，在注入燕麦 PhyA 时，可以观察到在红光照射下，． au rea 植株中有 cab-GUS 基 因的表达，而在瞬间红光之后给子远红光照射则 cab-GUS 不表达，这说明外源加入的 PhyA 可以 在转录水平上调控 cab 基因的表达。另外，他们将 cab-GUS 基因和有 C 矿结合的活性牛脑 CaM 注入 aurP ． a 植株，发现活性 CaM 也可使 cab-GUS 基因表达，而且这种表达只发生在 CaM 注入的 细胞中。而在临近细胞则不表达，用没有结合 Ca2+ 的非活性 CaM 注入细胞并不能启动 cab-GUS 基因的表达。同样用纯化的矮牵牛 CaM 也可有效地启动 cab-GUS 基因的表达。这说明 CaM 参 与了光敏素调控的基因表达过程。李红兵等刚发现胞外 CaM 有促进白芷悬浮细胞增殖的作用， 边艳青等【 5l 】发现外源 CaM 可促进白芷原生质体壁再生和第一次分裂。 GrangwaniIs2] 等发现 CaM 可激活从浮萍属植物中得到的环核苷酸磷酸二酯酶的活性， Preisigt53] 等发现在烟草的植物抗毒素 合成中也有 CaM 的参与，这些都表明了 CaM 的生理作用是一个广阔的研究领域。 Ca2+-CaM 信号系统在植物有性生殖过程中同样起着特别重要的作用。在植物生理学、发育 4 Ca2+ ． CaM 信使系统参与小麦抗叶锈病反应的研究 生物学、细胞生物学研究中，钙．钙调蛋白也一直热点。钙．钙调蛋白动态研究己涉及植物雌雄配 子形成【 541 、花粉管生长【 551 、生殖核分裂 ‘561 、藻类植物卵及合子极性建巧 71 、助细胞退化【 581 、幼胚 发育中的极性分布【 59J 及种子萌发 [60 】等各个方而。龚明等人对 CaM 在花粉萌发中的作用进行了一 系列的研究：他们从松树中纯化 CaM 并进行了序列分析，在氨基酸组成上同菠菜 CaM 有很高的 同源性。用 EGTA 、 A23187 、、肌 7 ， GPZ 等 Ca2+ 和 CaM 抑制剂研究松树花粉的萌发过程，结果 表明，花粉萌发过程中 Ca2+ 水平的升高和降低以及 CaM 活性的抑制导致花粉细胞总脂、中性脂、 极性脂、磷脂、自由脂肪酸正常代谢的抑制，并干扰正常萌发所导致的脂肪酸组成的改变，最终 抑制花粉萌发和花粉管生长【 61 】。他们还在利用 TFP ， CPZ ， W-7 等 CaM 的抑制剂以及一种 W ． 7 的类 似物 W-5 观察其对松树和烟草花粉萌发和花 粉管生长的效应时，发现 CaM 抑制剂可以抑制花粉 萌发和花粉管的生长。而外加牛脑 CaM 和玉米 CaM 可解除抑制作用，并指出外源 CaM 的作用 可能和花粉壁 ( 管 ) 有关。王立安 162] 等利用影响钙调素与钙调素依赖蛋白激酶作用位点的抑制剂 KN ． 93 研究钙信号途径参与了稻瘟病菌孢子萌发及疏水条件下附着胞形成过程的调控情况发现： 随着抑制剂浓度的增加抑制剂对孢子萌发和附着胞形成过程的抑制作用明显增强：同一浓度下， 抑制剂对附着胞形成过程的抑制作用大于孢子萌发过程：抑制剂影响孢子萌发和附着胞形成过程 在萌发早期 (1 ． 4h) 最有效；在完全被抑制、不能萌发的孢子内出现了许多颗粒状囊泡；抑制剂可 使附着孢形态明显变小甚至不能形成。 1 ． 1 ． 6 CaM 基因的表达 通过对 CaM 和 CaM 相关 (CaM—related) 基因的研究，可以直接或间接地说明 CaM 在生理过程 中的作用。不同的物理和化学信号可以诱导出对应于 CaM 和 CaM 相关 (CaM-related) 基因的不同 的 mRNA 。 Jena 掣的 J 用马铃薯 CaM cDNA 做探针，分别研究了在生长素敏感的草莓果实和光敏 感的玉米根部中生长素和光信号对 CaM 基因表达的影响。生长素处理过的草莓果实同对照相比 CaM mRNA 水平升高，而且将暗处生长的玉米根尖暴露至光下也使 CaM mRNA 水平有所增加。 B 功 am 【 64 】在对拟南芥菜的研究中发现，触摸、风、雨、伤害刺激可迅速 00--30 分钟内 ) 诱导出对应 于四种不同的 CaM cDNA(TCHl,TCH2 ， TCH3,TCH4 的 mRNA 。伤害同样可以诱导苹果 CaM 基因 的表达。另外的研究表明触摸和风信号能提高细胞质 Ca2+ 浓度，而且 C a_H 可以调控一些触摸基因 的表达。因此，触摸信号传导的可能过程首先是细胞质 Ca2+ 浓度升高，进而它可顺次地调控特定 基因的表达，当然也包括编码它的受体 ——CaM 的基因【 65 】。可见，至少在某些信号的传导过程 中，调幅机制和调敏机制 m 】是协同作用的，即首先由于细胞内 Ca2+ 增加而通过调幅机制起作用， 接着由于 Ca2+ 增加引起 CaM 基因的表达使 CaM 增加，调敏机制开始作用，从而完成一个信号传 导所产生的完整的生理变化。 有趣的是，这些对应于不同物理、化学信号的 CaM 基因的表达很可能并非是专一于某一种 信号的传导过程中。 Botella 和 Artcca[66J 用拟南芥菜的 TCH ． 1 做探针，从红豆 radiate lambdagtii 基因文库中分离出了两种不同的 CaM cDNA(MBCaM ． 1 和 MBCaM ． 2) ，它们所编码的多肽链只在 第 7 位和第 lO 位氨基酸有差别。 Southern 法分析表明它们由不同的基因所编码。它们对应于触 摸信号的表达也有差异， MBCaM ． 1 的 raRNA 水平在触摸反应中有一个明显的瞬时增加，而 MB CAM-2 的 mRNA 水平则表现一种比较小的但却是稳定的增加。这两种 CaM eDNA 同光信号的传 5 河北农业大学硕士学位 ( 毕业 ) 论文 导也有关系。当植株在完全黑暗下生长时， MBCaM ． 1 是不表达的， MBCaM ． 2 的表达水平也非常 低。将这样的黄化苗暴露至光下一小时后， MBCaM ． 2 的表达有所增加，而 MBCaM ． 1 没有变化； 在光下生长六小时后， MBCaM ． 1 和 MBCaM ． 2 的表达都有增加。当植株生长在 16 小时光期 8 小 时暗期的周期中时， MBCaM ． 1 的 mRNA 水平在光期比较低，但在暗期的开始有所增加，而 MBCaM02 则没有这种变化。这两种 CaM 基因还同盐份胁迫的信号传导有关。当植株处于盐份胁 迫状态下时， MBCaM ． 1 在处理 2 小时后表达增加，并在处理 4 小时后达到最大值，而 MBCaM ． 2 在整个时间过程中不发生变化。这些结果说明了 CaM 基因表达的调控并非是一种 CaM 基因对应 于一种信号那样简单，同时这也是 CaM 生理功能复杂性的一种表现。 转基因植物也被应用于 CaM 基因表达的研究。 Poovaiah 掣叫利用一种携带有水稻 CaM-2 的 启动子和 Ca2+T( 氯霉素乙酰转移酶 ) 受体的融合基因的转基因植物，对水稻 CaM 基因表达进行了 研究， CaM ． 2 启动子的活性可通过 “ 报告基因 ”Ca2+T 活性的分析测定来反映。这种 Ca2+T 受体基因 在所有被检测的营养器官和生殖器官中都可表达，说明 CaM ． 2 启动子在所有植物器官中都是有活 性的。但是它在茎、叶柄、叶脉组织中表达较高，而在叶片中则较低。同时，幼龄叶片的不同部 位和老龄叶片的对应部位相比，幼龄叶片中的 Ca2+T 活性较高。另外，在所有被检测的不同部位 中，花药具有最强的 Ca2+T 活性。这些都说明了在植物体的不同组织、器官中， CaM 基因表达的 调控机理不同，因而 CaM 基因的表达是有区别的，亦即不同组织、器官中 CaM 含量不同，这可 能和 CaM 执行不同的生理功能有关。 Poovaiah 等【 65 】还 设计 领导形象设计圆作业设计ao工艺污水处理厂设计附属工程施工组织设计清扫机器人结构设计 了其它一些转基因烟草，它们分别含有马铃薯 CaM eDNA 的表达链和 反义链，并由 CaM V35S 启动子所启动。同对照相比，含有表达链结构的转基因烟草中 CaM mRNA 水平提高了 50 倍，而含有反义链结构的转基因烟草中 CaM mRNA 水平普遍降低。同时， CaM 反 义链 mRNA 的稳定程度也要低于由 CaMV35S 启动子所启动的 CaM mRNA 。但是对 CaM 活性和 Western 印迹法的检测结果表明，这些转基因植物在 CaM 的蛋白总量上同对照相比并无明显区别。 Zielinski 等对携带有 CaM V 35S 启动子和大麦 CaM eDNA 表达链或反义链两种取向的融合基因 转基因植物进行了研究，得到的结果和 Poovaiah 的结果大致相同。因此，在植物细胞中除了 CaM 基因的表达外，很可能还存在有其它可在翻译或翻译后水平上调控 CaM 的存在数量的因子。 1 ． 1 ． 7 CaM 相关蛋白 Ca2 十 -CaM 信号途径要通过 CaM 相关蛋白来实现。植物中 CaM 由多个基因编码，不同器官、 不同细胞有不同的表达形式。同时不同的 CaM 异构体与不同的靶蛋白结创 67 】【明 J 。 Ca2 十与 CaM 的 结合引起异构体的改变暴露出疏水区域后与靶蛋白结合眇】 ‘ 捌，由于靶蛋白、 CaM 表达形式的不同 等产生了体内 ca2 十信号途径的多样性。这些靶蛋白可分为： (1) 蛋白酶类； (2) 钙泵； (3) 核作用因 子。那么分离和确定真核生物中 CaM 结合蛋 (Calmodulin-binding proteins ， CBPs) 对于理解 C—t -CaM 介导的信号转导无疑具有重大的意义。 CPBs 的 CaM 结合区域不具保守性。 BerridgeI 71J 、 Collins 等 [72 】主要运用蛋白质一蛋白质的相互作用生物化学和分子生物学的方法确定 CBPs 。用此 方法己确定了很多与植物形态建成，细胞分裂，细胞延长，离子运输，基因调控，细胞肾架形成， 胞质环流，花粉管伸长和胁迫诱导有关的一些 CBPs 。 6 Ca2+ ． CaM 信使系统参与小麦抗叶锈病反应的研究 1 ． 2 几种防卫反应酶 过氧化物酶 (POD) 诱导病原物在侵染点处木质素类物质的合成和其在细胞壁中的积累 17 引，并 催化杀菌物质的合成，也参与酚类物质在细胞壁及乳突中的积累，从而形成物理屏障，构成了植 物的一般抗病性和非专化抗病性 (Kent kerby and sha 吼 a Somerville ， 1989)I ． 74 】。并且它还是植物 在逆境条件下防御系统的关键酶之一，它与超氧化物歧化酶、过氧化氢酶相互协调配合，清除过 剩的自由基，使体内的自由基维持在一个正常的动态水平，以提高植物的抗逆性。由于过氧化物 酶活性受多种因素，如光、温度、机械伤害的影响，且植物的不同生育期及不同器官也不相同。 曹赐生等 (2001) 【 7 习在研究杂交稻不同抗性组合感染白叶枯病菌后 POD 活性的变化时，用 4 个 对白叶枯病具不同抗性级别的杂交稻组合研究了其 3 叶期幼苗感染白叶枯病菌后体内过氧化物酶 活性的变化。结果表明，各组合稻株的抗病性与 POD 活性呈一定的正相关，抗病组合的 POD 活 性变化幅度明显大于感病组合。可以认为杂交稻的抗白叶枯病特性与体内酚类物质代谢及防御酶 系活性密切相关。植物苯丙氨酸解氨酶 (PAL) 是植物次生代谢的关键酶之一。它催化 L 一苯丙氨 酸形成反式肉桂酸这一不可逆过程，是植物次生代谢产物特别是植保素和木质素合成途径中的定 速酶，它参与了植物次生抗病物质 ( 植保素、木质素和酚类物质 ) 的合成和积累。 PAL 活性与抗病 性相关：王敬文等 (1982)p6J 研究 PAL 在抗马铃薯晚疫病中的作用时发现，无论病原菌侵染还是用 病原菌毒素处理， PAL 活性大小与品种抗病性呈正相关。可以推测低浓病原菌粗毒素能激活 PAL ， 从而有利于木质素、植保素、酚类和酮类等抑菌物质的合成，有 利于限制病原菌侵入和扩展。从 而认为 PAL 与植物抗病性相关。过氧化氢酶 (Catalase 。 CAT) 是植物抗病性中研究较多的一个酶， 其功能是清除病原物侵染引起的活性氧 ( 主要是 H202) 积累，将 H202 降解为对植物无毒害的 H20 和 02 。自从植物病理学家联想到与活性氧代谢有关的 CAT 在植物与病原物相互关系中可能具有 的重要作用后，许多研究者对多种病害体系进行了研究，周晓剥丌】等所做甜瓜植株受蔓枯病菌侵 染后，抗病材料的 CAT 活性均高于感病材料。 POD 、 PAL 、 PPO 和 CAT 是植物抗病反应中重要 的防御酶。 1 ． 3 关于荧光实时定量 PCR 所谓实时荧光定量 PCR(real ． time quantitative PC-X) 技术，是指在 PCR 反应体系中加入荧光 基团，这个荧光基团所发出的信号会随着 PCR 的每一个循环发生变化，因此利用荧光信号的变 化可以实时监测整个 PCR 进程，最后通过 标准 excel标准偏差excel标准偏差函数exl标准差函数国标检验抽样标准表免费下载红头文件格式标准下载 曲线对未知模板进行定量分析的方法理论上 PCR 反应是一个指数增长的过程，但是实际上由于 PCR 反应体系内各种因素的限制导致 PCR 产物 的增加呈 S 形，即随着反应循环数的增加，由于 Taq 酶、矾 TP ，引物及模板等因素的限制， PCR 的效率会逐渐降低而产物的增加会逐渐减慢最后进入平台期。这也就是为何传统 PCR 最终 检测只能是定性而不能准确定量的原因。在 real ． time PCR 中，对整个 PCR 反应扩增过程进行 了实时的监测，连续地分析与扩增产物相关的荧光信号的变化。在 PCR 反应早期，由于产物生 成量少，其产生的荧光水平不能与背景明显地区别，而后随着扩增产物的增加，与之相关联的荧 光信号的产生进入指数增长期和最终的平台期。为了便于对所检测样本进行比较，因此在 real ． time PCR 反应的指数期，首先需设定一个荧光信号的阈值 (threshold) ，通常是以 PCR 反应 7 河北农业大学硕士学位 ( 毕业 ) 论文 的前 3 到 15 个循环的荧光信号作为荧光本底信号 (baseline) ，荧光阈值的缺省设置是 3"'15 个 循环荧光信号标准偏差的 10 倍。对每一个样本其达到这一阈值时所对应的循环数可能是不同 的，这一特定对应循环数被称作 Ct 值 (Cycle threshold) 或交点 (Crossing-point) 。通过严格的数学 公式 小学单位换算公式大全免费下载公式下载行测公式大全下载excel公式下载逻辑回归公式下载 推导可以证实，每个模板的 Ct 值与该模板的起始拷贝数的对数存在线性关系，起始拷贝数 越多， Ct 值越小。利用己知起始拷贝数的标准品可作出标准曲线，因此只要获得未知样品的 ct 值，即可从标准曲线上计算出该样品的起始拷贝数。荧光定量 PCR 技术己被证明是一种有效的 对初始模板中的目的基因 (DNA 和 RNA) 进行定量研究的有力工具【 78,79] 。目前模板定量主要有两 种策略：绝对定量和相对定量，绝对定量指的是用已知的标准曲线来推算未知的样本量，相对定 量指的是样本中靶基因相对于另一参照样本的量的变化。 绝对定量方法将预先己知的标准品稀释一系列浓度后再进行 PCR 反应，得到一标准曲线， 再由目的基因测得的荧光信号量通过标准曲线计算出未知样品中基因的量。在这里纯化的质粒 DNA 、体外转录的 RNA 、体外合成的单链 DNA 或包含目的基因的 cDNA 常作为绝对定量标 准品之用。标准品的量可根据 260 姗的吸光度值并用 DNA 或 RNA 的分子量来转换成其拷贝 数来确定。此方法定量的准确性要求作为标准品的 DNA 和 RNA 必须是单一的纯品，还需要准 确的稀释和良好的贮存以及精准的操作等，同时还必须保证标准品及目的基因的扩增效率一致。 上述定量准确性的基本要求若不能满足，哪怕是极小的差异最终对定量的结果都会有较大的影 响。 相对定量指的是样本中靶基因相对于另一参照样本的量的变化。又可以分为标准曲线法的相 对定量和比较 Ct 值的相对定量。在标准曲线法的相对定量中，由于量的变化是相对于某个参照 物的量而言的，因此其标准曲线就比较容易制备，对于所用的标准品只要知道其相对稀释度即可。 在整个实验中样本的靶序列的量来自于标准曲线，最终必须除以参照物的量，即参照物是 l 倍 的样本，其它的样本为参照物量的 Il 倍。 对于 mRNA 表达水平的定量，如果采用绝对定量的方法，通常需制备体外转录的 RNA ，则 涉及到构建 cDNA 质粒再体外转录，这一过程较复杂且制成的 RNA 其稳定性还是一个问题。 因此 mRNA 表达水平的定量，其标准品常常直接采用 cDNA 质粒，好处是可以一次制备供多 次使用。但对于反转录的效率是否一致，则很难控制。因此在实际定量中为了纠正这种效率的偏 差和标准化加入反应体系的 RNA 或 DNA 的量，往往在反应中同时扩增一内源控制基因，通过 内源控制基因的修正，正确反映出靶基因在样本和参照物中的变化。在基因表达研究中内源控制 基因往往选择管家基因 (house kccpinggcne) 。一个理想的用于实时定量 PCR 基因表达研究的管家 基因，必须在不同的生长发育阶段和不同的器官组织中均相对恒定地表达，且还需确保不受实验 中不同处理的影响【翮． 8¨ ，因此根据实验需求谨慎选择适合的管家基因对最终的实验结果会有很大 的影响。常用的管家基因均是那些与细胞的基本结构和功能有关的基因，如 pactiII ， 3 ．磷酸甘油 醛脱氢酶 (GAPDH) 、核糖体 RNA(rRNA) 、延伸因子 (EF ． 1 a) 等【救，娃 s4] 。 在相对定量中另外还有一种方法用于基因表达的相对定量，即比较 Ct 法的相对定量【 841 85,s6] 。 比较 Ct 法与标准曲线法的不同之处在于其运用了数学公式来计算相对量，前提是假设每个循环 增加一倍的产物数量，在 PCR 反应的指数期得到 Ct 值来反应起始模板的量，一个循环 (C 卢 1) 的 不同相当于起始模板数 2 倍的差异。但是此方法是以靶基因和内源控制物的扩增效率基本一致为 前提的，效率的偏移将影响实际拷贝数的估计。 8 Ca2+ ． CaM 信使系统参与小麦抗叶锈病反应的研究 1 ． 4 本实验研究目的及意义 本实验用 CaM 拮抗剂以及 CaCl2 预处理小麦种子后测小麦叶片接种叶锈菌后在不同时间点 的酶活性，探讨钙调蛋白与抗病相关物质之间的关系，并用实时定量 PCR 方法检测了小麦接种 亲和性菌、非亲和性菌后 CaM 以及 CaM 的四个亚型基因表达量，从生理生化水平以及分子水平 上探测 CaM 是否参与抗病反应。一般认为， cE+ 信号是通过植物细胞内 Ca2+ 信号感应器或 Ca2+ 结合蛋白转导 cE+ 信号，激活下游感应器，调控各种细胞内反应的。钙调素 (Calmodulin ， CaM) 是植物细胞内 cE+ 信号的主要受体，参与许多生命活动的调节。对小麦抗叶锈病过程中 CaM 进 行研究，探讨其可能的调控机制，对于合理利用小麦抗叶锈病基因，提高小麦的抗病性，确保小 麦的高产、稳产具有非常重要的意义。 9 河北农业大学硕士学位 ( 毕业 ) 论文 2 试验材料与方法 2 ． 1 主要仪器及供试试剂 2 ． 1 ． 1 仪器 T-gradient Thermal Cycler PCR 扩增仪 (Bio-metra) 、 JY5000 型电脑三恒多用电泳仪 ( 北京君意机 电 ) 、 WH ． 861 旋涡混合器 ( 太仓市科教器械厂 ) 、 WD ． 9403C 型紫外分析仪、 BECKMAN CS ． 15R 高速冷冻离心机、 EppendoffCentrifuge 5415D 高速台式离心机、水浴锅、 DYY-IIl3l—34 型琼脂 糖水平电泳槽、 BTS ． 20 ． M 型凝胶成像仪、 EppendorfBio photometer 分光光度计、 TU ． 1901 双光 束紫外可见分光光度计 ( 北京普析通用仪器有限责任公司 ) 、秒表、研钵、电子天平、 HANNApH21 1 型 pH 计、 ZPQ ． 280B 智能光照培养箱、 KQ5200DB 型数控超声波清洗器。 2 ． 1 ． 2 试剂 植物总 RNA 提取试剂购于天威时代有限公司， RevertAid M ． MuLv Reverse Transcriptase 、 DNase I(RNase Free) 、 tmlQ ． 10 柱式质粒小量抽提试剂盒、 DNA fragment purification Kit 、 dNTP$ 、 Taq DNA 聚合酶、 RNasin Ribonuclease Inhibitor( 核酸核糖酶抑制剂 ) 、 SYBR Premix Ex TaqTM 、姗 20 、 DL2000 DNA Marker 、琼脂糖、 DEPC( 焦碳酸二乙酯 ) 等均产自上海生工生物 工程技术服务有限公司和大连宝生物公司。 三氟拉嗪 (TFP) 、氯丙嗪 (CPZ) 、 N-(6 一 aminohexyl)-5-chloro-l-naphthalene sulfonamide(W-7) 、 无水 CaCh 、聚乙烯吡咯烷酮 (P 、， P) 、 O ． 05mol ／ L 磷酸缓冲液 (PH=7 ． 8) 、 0 ． 05mol ／ L 硼酸缓冲液 (PH=8 ． 8) 、 2 ％过氧化氢、 0 ． 05moFL 愈创木酚、 0 ． Imol ／ L 邻苯二酚、 0 ． 02m01 ／ Lk 苯丙氨酸 (PH=8 ． 8 的硼酸缓冲液配 ) 、 0 ． 049 ／ L 6 一苄氨基嘌呤 (6-BA) 、 6mol ／ L 的浓盐酸、 20 ％三氯乙酸、 5mmol ／ L 巯基乙醇 (PH=8 ． 8 的硼酸缓冲液配 ) 、 2 ％ H202 ． 其中 TFP 、 CPZ 和 w 二 7 均为 Sigma 公司产品，其它试剂均为国产分析纯。 2 ． 2 供试材料 2 ． 2 ． 1 小麦材料 小麦抗叶锈病近等基因系 TeLrl5 的种子来自于河北农业大学锈病研究室。 2 ． 2 ． 2 菌种材料 叶锈菌： TeLrl5 亲和性叶锈菌 05 ． 22-64( 堇 )( 侵染型为 “4”) TeLrl5 非亲和性叶锈菌 05 ． 5 ． 127⑨( 侵染型为 “ ： ”) 10 Ca2+ ． CaM 信使系统参与小麦抗叶锈病反应的研究 以上材料均由河北农业大学小麦锈病研究中心提供。 2 ． 3 试验方法 2 ． 3 ． 1 小麦叶锈菌株的筛选 从河北农业大学锈病室保存的小麦叶锈菌中选择 30 株菌株进行筛选，从中选择适合本试验 的菌株： 将已催芽的小麦抗叶锈病近等基因系 TcLrl5 的种子各 10 粒种植于 30 个小花盆中，待小麦 苗长至一叶一心时，采用撒粉法分别将 30 株叶锈菌株接种于小麦叶片上。 在接菌前做叶锈菌孢子萌发实验，将含有叶锈菌夏孢子的孢子悬浮液低于带有凹槽的载玻片 上，将载玻片倒置形成悬浮液滴， 20℃ 黑暗放置 14 h ，镜检，计算孢子萌发率。测得其孢子萌发 率在 80 ％以上。 接种试验具体操作： 1) 按 1 ： 10 的比例在指型管中将孢子粉和滑石粉混合均匀，用三层纱布包住管 El 。 2) 在喷雾器中加入 0 ． 1 ％吐温 80 ，喷雾至小麦叶片表面形成一层水膜为止。 3) 在小麦叶片上均匀撒粉接种，同时作不接种对照。 4) 然后再在小麦上喷雾，置黑暗条件下保湿 14~16 h ，然后转入 180-25℃ 、光照时间 1 帖 14 h 的温室内培养，光照不足时用镝灯光补充。 5) 培养 12 ～ 14 d ，待对照充分发病时进行鉴定，侵染型采用 lhl 心 98,991 标准进行鉴定 ( 表 1) 。 表 l 小麦叶锈病侵染型 Table l Infection types ofwheat leafrust 对单个孢子堆侵染型的变化情况进一步描述如下：．．． ” 夏孢子堆大小处于较低限度； ‘o 夏孢子堆比正常的小 I‘q 一夏孢子堆比 正常的大 I‘‘ 抖 ” 夏孢子堆大小处于较高限度 I“C ，褪绿比正常的置； “hr' 枯死比正常的重．在同一叶片上，由一个菌株形成的不连 续的侵染型之问用。， ” 隔开，如 “4 ，； ” ．在同一叶片上，侵染型有变异幅度的情况下，把出现最多的侵染型写在前面，如 ‘ ． 23 。 I” ． 河北农业大学硕士学位 ( 毕业 ) 论文 2 ． 3 ． 2 小麦叶片的离体培养及 RNA 的提取 2 ． 3 ． 2 ． 1 小麦叶片的离体培养 种子经 0 ． 1 ％ gMn04 消毒后，分成 5 份。分别设 20 mmol·L1 CaCl2( 分析纯 ) 、 300 gmol·L1 W-7(Sigma 公司产品 ) 、 100 gmol·L‘TFP(Sigma 公司产品 ) 、 100 lunol·L1 CPZ(Sigma 公司产品 ) 和 去离子水 ( 对照 ) 浸种处理。浸种 12 h 后将种子排列于铺有滤纸的培养皿中， 25"(2 催芽 24h 。将 发芽整齐的种子分别播于 72 孔穴盘中，在人工气候箱中培育幼苗，光照时间 16 h ／ d ，黑暗时间 8 h ／ d ，温度为 18℃ ／ 22℃( 黑暗／光照 ) 。当麦苗一叶一心时剪下已经展开的第一片真叶，使叶正面 朝上平铺在直径为 15 锄的大培养皿中，皿底均匀地铺有一层被 40 mg ／ L 6- 苄氨基嘌呤 (6-BA ，起 保绿作用 ) 浸湿的脱脂棉【【 871 ，叶锈菌用蒸馏水配置成一定浓度后用毛笔向叶片正面均匀地涂抹， 然后继续放在人工气候箱中培养。 2 ． 3 ． 2 ． 2 小麦叶片 RNA 的提取 小麦抗叶锈病近等基因系 TcLrl5 的种子催芽，然后播种于花盆中栽培，培养至一叶一心期 后，用筛选得到的亲和性叶锈菌和非亲和性叶锈菌进行接种，以不接种叶锈菌为对照。接种后 0 h ， 6 h 、 12 h 、 24 h 、 48 h 、 72 h 、 96 h 分别剪取接种和不接种叶片，用于提取植物叶片组织中的总 RNA ，将剩余叶片用液氮速冻，然后将速冻的叶片放于． 80℃ 冰箱中保存，日后用以提取 RNA 。 2 ． 3 ． 3 防卫反应酶活性测定 2 ． 3 ． 3 ． 1 取样：用毛笔接菌后 0 h 、 24 h 、 48 h 、 72 h 、 96 h 、 120 h 、 144 h 、 168 h 取样，每次取叶 片 0 ． 5 g ，重复三次。 2 ． 3 ． 3 ． 2 过氧化物酶 (POD) 活性测定参照李合生【髓】等的方法，略作改动。 所用试剂： (1)0 ． 05 mol ／ L 磷酸缓冲液 (PH=7 ． 8) (2)0 ． 05 mol ／ L 愈创木酚 (3)2 ％过氧化氢 所用 2 ％过氧化氢现用现配，取 30 ％过氧化氢 2 mL ，然后加入 28 mL 蒸馏水制成 2 ％过氧化氢。 酶液的提取： 取培养的小麦叶片 0 ． 05 g ，放入研钵中，加入 0 ． 01 g PVP ，再加入 0 ． 05 mol ／ L 预冷的磷酸缓 冲液 (PH=7 ． 8)1 ． 2 lnJ ，分三次加入，每次 400 pl ，冰浴研磨成匀浆，将匀浆全部转入离心管中， 在 4℃12000 r ／ min 的冷冻离心机中离心 30 rain ，上清液即为酶粗提取液。 活性测定原理： 测定过氧化物酶最常用的方法：愈创木酚法，即在过氧化物酶催化下，过氧化氢将愈创木酚 氧化成茶褐色产物。此产物在 470 nIn 处有最大光吸收，故可通过测 470 nm 下的吸光度变化测定 过氧化物酶的活性。 酶活性测定： 酶活性测定的反应体系包括： 2 ． 9 ml PH--7 ． 8 磷酸缓冲液 +1 ． 0ml 2 ％过氧化氢 +1 ． 0ml 0 ． 05 mol ／ L 愈创木酚 +o ． 05 ml 酶液，反应体系加入酶液后立即开始计时，并测定 OD470 ，每 l min 读数 1 次， 12 Caz+ ． CaM 信使系统参与小麦抗叶锈病反应的研究 读 3 min 内的变化植，用磷酸缓冲液做对照，所加试剂和测定管相同。每次重复 3 次，以每分钟 内引起 OD470 变化 0 ． 0l 为一个酶活性单位。 POD 的活性 (U ／ g‘rain)=A ／ (0 ． 01xTxVlxW)×v2 其中 A ：样品吸光值 Vl ：酶液用量 T ：反应时间 (min) V2 ：酶液总量 (m1) W ：样重 (g) 2 ． 3 ． 3 ． 3 苯丙氨酸解氨酶 (PAL) 活性测定参照薛应龙【 89,901 的方法，略作改动。 所用试剂： (1)0 ． IM 硼酸缓冲液 (pH8 ． 8) A 液：称取硼酸 1 ． 24 g 溶于蒸馏水中并定容至 100 mL B 液：称取硼砂 1 ． 905 g 溶于蒸馏水中并定容至 100 mL 取 A 液 100 mL ， B 液 60 mL ，将 A 液和 B 液混合，再加蒸馏水定容至 400 mL 备用。 (2)0 ． 02M L ．苯丙氨酸 称取苯丙氨酸 O ． 33 g ，用 O ． 1 M 硼酸缓冲液 ((ph8 ． 8) 定容至 100 mL 备用。 (3)5 mM 巯基乙醇硼酸缓冲液 (pH8 ． 8) 取 0 ． 39 mL 巯基乙醇，加 0 ． 1 M 硼酸缓冲液 (ph8 ． 8) 定容至 100 mL 备用。 酶液的提取： 取培养的小麦叶片 O ． 05 g ，放入研钵中，加入 0 ． Ol g PVP' 再加入 0 ． 05 mol ／ L 预冷的 5 mmol ／ L 巯基乙醇 (PH=8 ． 8 的硼酸缓冲液配 )1 ． 2 ml ，分三次加入，每次 400 lal ，冰浴研磨成匀浆，将匀浆 全部转入离心管中，在 4℃12000 r ／ min 的冷冻离心机中离心 30 min ，上清液即为酶粗提取液。 活性测定原理： 苯丙氨酸解氨酶催化苯丙氨酸的脱氨反应，使氨气释放出来形成反式肉桂酸，此酶在植物体 内次生物质 ( 如木质素 ) 代谢中起重要作用。根据其产物反式肉桂酸在 290 nin 处吸光度的变化 可以测定该酶的活性。 酶活性测定与计算： 参照曾永三【 9¨ 的方法测定酶活性。向 3 nll 反应介质 (2 ml 的硼酸缓冲液和 1 m10 ． 02mol ／ L 的 L 苯丙氨酸 ) 中，加入 0 ． 6 ml 的酶液，对照加入 2 ． 6 ml 的硼酸缓冲液和 lml 的 L 苯丙氨酸，放在 30℃ 恒温水浴锅中保温 45 min ，取出立即加入 6 tool·L-1 的盐酸终止反应，倒入比色皿中测定 290 n111 的光吸收，每处理重复 3 次，以每小时 OD290 变化 0 ． 01 为一个酶活性单位。 PAL 的活性 (U ／ g ． h)=A ／ (0 ． 01 xTxVl× 聊 ×v2 其中 A ：样品吸光值 Vl ：酶液用量 T ：反应时间 (min) v2 ：酶液总量 (IIll) W ：样重 (g) 2 ． 3 ． 3 ． 4 多酚氧化酶 (PPO) 活性测定 参照汪红【吲等的方法，略作改动。 所用试剂： (1)0 ． 05 mol ／ L 磷酸缓冲液 (PH=7 ． 8) (2)0 ． 1 mol ／ L 邻苯二酚 酶液的提取： 取培养的小麦叶片 O ． 05 g ，放入研钵中，加入 O ． 01 g P 、化再加入 O ． 05 mol ／ L 预冷的磷酸缓冲 液 (PH=7 ． 8)1 ． 2 ml ，分三次加入，每次 400 lal ，冰浴研磨成匀浆，将匀浆全部转入离心管中， 13 河北农业大学硕士学位 ( 毕业 ) 论文 在 4℃12000 r ／ rain 的冷冻离心机中离心 30 rain ，上清液即为酶粗提取液。 活性测定原理： 多酚氧化酶能将邻苯二酚氧化为醌，该醌在 420 nm 处有最大吸光值，根据其产物在 420 nil] 处吸光度的变化可以测定该酶的活性。 活性测定： 酶活性测定的反应体系包括： 2 ． 0 ml PH=7 ． 8 磷酸缓冲液 +0 ． 1 molmol ／ L 邻苯二酚 l mL+0 ． 5 mL 酶液，反应体系加入酶液后在 37℃ 恒温水浴锅中保温 l h ，取出立即加入 20 ％的三氯乙酸终止反 应，倒入比色皿中测定 420 nlTl 的光吸收，每处理重复 3 次，以每小时 OD420 变化 0 ． 01 为一个酶 活性单位。 用磷酸缓冲液做对照，所加试剂和测定管相同。每次重复 3 次，以每分钟内引起 OD420 变化 0 ． Ol 为一个酶活性单位。 PPO 的活性 (U ／ g ． h)=A ／ (0 ． 01xTxVixW)×v2 其中 A ：样品吸光值 VI ：酶液用量 T ：反应时间 (rain) v2 ：酶液总量 (m1) W ：样重 (g) 2 ． 3 ． 3 ． 5 过氧化氢酶 (CAT) 活性测定 参照宋凤吲 931 等的方法，略作改动。 所用试剂： (1)0 ． 05mol L 磷酸缓冲液 (PH=7 ． 8) (2)2 ％过氧化氢 酶液的提取： 取培养的小麦叶片 0 ． 05 g ，放入研钵中，加入 0 ． 01 g PVP ，再加入 0 ． 05 tool ／ L 预冷的磷酸缓冲 液 (PH=7 ． 8)1 ． 2ml ，分三次加入，每次 400 pl ，冰浴研磨成匀浆，将匀浆全部转入离心管中，在 4℃12000 r ／ min 的冷冻离心机中离心 30 min ，上清液即为酶粗提取液。 活性测定原理 在过氧化氢酶的作用下，过氧化氢酶催化 H202 ，分解为 H20 和 02 ， H202 在 240 nnl 处有最大 吸光，根据其产物在 240 衄处吸光度的变化可以测定该酶的活性。 活性测定 酶活性测定的反应体系包括： 2 ． 0 ml PH=7 ． 8 磷酸缓冲液 +o ． 08 ml 2 ％过氧化氢 +o ． 05 ml 酶液， 反应体系加入酶液后立即开始计时，并测定 OD2 柏，每 lOs 读数 1 次，读 l min 内的变化植，用 磷酸缓冲液做对照，所加试剂和测定管相同。每次重复 3 次，以每分钟内引起 OD2 加变化 0 ． 01 为 一个酶活性单位。 CAT 的活性 (U ／ g·s)=A ／ (0 ． 01 xTxVtxW)xV2 其中 A ：样品吸光值 Vl ：酶液用量 T ：反应时间 (s) V2 ：酶液总量 (m1) W ：样重 (g) 2 ． 3 ． 4 小麦叶片总 RNA 的提取 2 ． 3 ． 4 ． 1 创造无菌、无 RNase 的环境条件： 所有离心管、枪头都要用 0 ． 1 ％ ,-0 ． 2 ％的 DEPC(Diethypyrocarbonate) 溶液处理， 37"C 14 Ca2+ ． CaM 信使系统参与小麦抗叶锈病反应的研究 保温 12h 以上，然后高压灭菌，灭活 DEPC ；研钵、研棒、药匙、玻璃器皿等需在 160℃ 干烘 4 h 以上；溶液都需用经 DEPC 处理过的水配置；电泳槽、胶板及梳子等也用 DEPC 处理过夜，然后 用 ddH20 冲洗干净晾干备用。 2 ． 3 ． 4 ． 2 RNA 的提取 用植物 RNA 提取试剂提取总 RNA 。提前准备以下用品及试剂：液氮、研钵、无 RNase 离 心管、氯仿、异丙醇、无 RNase 水，并配制 5 MNaCl 、 75 ％乙醇。 1) 取 0 ． 1 g 新鲜的幼嫩小麦叶片在研钵中用液氮迅速研磨成均匀的粉末。 2) 取不多于 0 ． 1 g 冷冻的研磨过的植物组织，加 0 ． 5mL 提取试剂 (4℃) ，振荡至彻底混匀。 3) 室温放置 5 mill 。注意：平放离心管，使表面积最大。 4)4℃ ， 12000 rpm 离心 2min ，上清转入新的无 RNase 离心管。 5) 加 0 ． 1 mL5MNaCl ，温和混匀。再加 0 ． 3 mL 氯仿，上下颠倒混匀。 6)4℃ ， 12000 rpm 离心 10min ，上清转入新的无 RNase 离心管。 7) 加入所得水相等体积的异丙醇，混匀，室温放置 10 rain 。 8)4℃ ， 12000 rpm 离心 10 min 。弃掉上清，注意不要倒出沉淀。加 1 mL75 ％乙醇。 ( 沉 淀可能很难看见，应小心操作。 ) 9)4℃ ， 12000 rpm 离心 1 rain 。倒出液体，注意不要倒出沉淀。剩余的少量液体可再次 离心收集，然后用枪头吸出。 10) 加 10--30 皿无 RNase 水，吹打几次以溶解 RNA 。如有絮状物，可室温 12000 rpm 离 心 l min ，取上清转入干净的无 RNase 离心管中，． 80℃ 保存。 2 ． 3 ． 5 总 RNA 中基因组 DNA 的去除 (1) 在微量离心管中加入下列反应液： 总 RNA 20"50ttg 10xDNase I Buffer 5 山 DNase I(RNase-free ， 5W),1) 2 山 RNase Inhibitor(40U ／山 )0 ． 5 Ill DEPC 处理水 补足至 50 山 (2)37℃ 反应 20"-30 min ，加入 50 山的 DEPC 处理水； (3) 加入 100 山的苯酚／氯仿／异戊醇 (25 ： 24 ： 1) ，充分混匀， 12 000xg 离心 20 min ， 取上层水相转移至另一微量离心管中： (4) 重复步骤 (3) 一次； (5) 加入 10 山的 3 mol ／ LNaAC 0H 5 ． 2) 和 250 111 预冷的无水乙醇， -20℃ 静置 30--,60 mim 12 000xg 离心 20 rain ，回收沉淀； (6)70 ％的冷乙醇洗涤沉淀两次，弃去乙醇后，沉淀在超净工作台上干燥 10 min 左右， 用适量的 DEPC 处理水溶解沉淀，． 80℃ 贮存备用。 15 河北农业大学硕士学位 ( 毕业 ) 论文 2 ． 3 ． 6 小麦叶片总 RNA 的纯度、浓度及完整性检测 用 1 ． 2 ％非变性琼脂糖凝胶电泳检测总 RNA 的纯度、浓度和完整性，用紫外检测仪检测琼脂 糖凝胶电泳结果。 分光光度计直接检测纯度和浓度，测量 OD2∞ 和 OD2∞ 的值，以 OD2s ／ OD2∞ 的比值检测 RNA 纯度， OD2c,o ／ OD280 值应介于 1 ． 8 至 2 ． 0 之间符合要求，浓度按以下公式计算： RNA 样品浓度 (1ag- 止 1)=OD260×N( 样品稀释倍数 )×40 ／ 1000( 单链 RNA 1 ． 0 OD260=4099· 心 1) 。 2 ． 3 ． 7 小麦中 CaM 及其四个亚型基因的荧光定量检测 2 ． 3 ． 7 ． 1 引物的设计与合成 用 Primer3 ． 0 软件根据 NCBI 上的小麦 CaM 的各个亚型基因的 3q 乍编码区设计引物 引物由上海生物工程有限公司合成。 引物设计原则： A 引物与模板的序列要紧密互补； B 引物与引物之间避免形成稳定的二聚体或发夹结构； C 引物不能在模板的非目的位点引发 DNA 聚合反应 ( 即错配 ) ； D 引物长度通常在 17 ～ 25 bp ， Tm 值在 60"-'65℃ ， Gc 含量在 45"--55 ％，产物大 小在 80 ～ 150bp 之间； E 引物的 3’ 端避免使用碱基 A ，避免出现 3 个以上连续相同的碱基； F 为避免基因组的扩增，引物设计最好能跨越两个外显子。 所用引物序列： GAPDH F5’CTGC(1TGCTCGTCTI 、 G( 了 r ． A A ． 3’ R 5’-(1’rGATGGAAGGACCATCAAC ． 3 ， CaMSF-l F5’-ACTGACAGCACTCGGTACrACTI 了 rr ． 3’ R5’ ． CGA AATT( 丌 CAACATCCCTGAG ． 3’ CaM SF-2 F5’ 叫气 TCCAGGTGCCArrrrGTGAG ． 3’ R5’ ． 1TTGGAACGGAGGGA(m ～ TGA ． 3’ CaM SF ． 3 F5’-CCCAAGACAGGAGGAGA A 兀 ’G ． 3’ R5’ ． ACAI'AGCAGGA& 几 K 祀 GTCGT ． 3’ CaMSF4 F5’ ． 1AGTAAGGAATGCGGCTCTCG ． 3’ R5’-1’GACACACGGGAGAGAGACAA ． 3’ CaM F5’-CCGTGTGrITGACAAGGATCA ． 3’ lb’CACCATCAAC—Ⅱ℃AGCCTI ： AC ． 3’ 2 ． 3 ． 7 ． 2 GAPDH 内参照基因的制备 以 GAPDH 为内参照基因，所用引物为： GAPDH F5’_(1' GCCrrl3‘ 刀 rCGTCrr‘ 文 1’AA ． 3’ 16 Ca2+ ． CaM 信使系统参与小麦抗叶锈病反应的研究 R5’-(1TGATGGAAGGACCATCAAC ． 3’ 2 ． 3 ． 7 ． 3 第一链 cDNA 的合成 (1) 在无核酸酶的微量离心管中加入下列成分： 2 山 Oligo(dT)25 2 烬 总 RNA 加 DEPC 处理水补足至 11 Ill 。 (2)70℃ ， 5 min 加热混合物，然后迅速放在冰上冷却，短暂离心，加入 4 山 M-MLV 5xReaction Buffer 2 山 dNTPmix( 各 10mtool ／ L) 0 ． 5 山 RNasin inhibitor(40 U ／山 ) l 山 M-MLV Reverse Transcriptase 用无酶的水补足至 19 山。 (3) 温和混匀， 42℃ 孵育 l h ， 70℃ 加热 10mill ，使酶失活。 合成的第一链 eDNA 放于． 20℃ 储存备用。 2 ． 3 ． 7 ． 4 QRT-PCR QRT-PCR 反应体系： SYBRPremixExTaqTM(2x) 8 ． 5 pL eDNA 模版 1 ． 0¨L PCR 上游引物 0 ． 25 ttL PCR 下游引物 0 ． 25|IL 总共 10“L PCR 反应管用离心机轻离心后，放入 PCR 仪中，应用两步法 PCR 扩增程序，扩增标准程 序为： Stage l ：预变性 95℃ 5 min Stage2 ： PCR 反应 95℃ 10 S 62℃ 20 S · 72℃ 18 S 44times 72℃ 10min 2 ． 3 ． 7 ． 5 标准曲线的制作 本试验采用双标准曲线法，即以内参基因的表达情况消除模板量及反转录效率的差异，再根 据各基因的 Ct 值在相应标准曲线上得出其在不同样品中的相对表达量。 PCR 产物纯化后进行定量，依次将其稀释到 10 倍、 102 倍、 103 倍、 104 倍、 105 倍、用于标 准曲线的制作。 PCR 结束后，仪器自动生成标准曲线。制作标准曲线时，每个稀释梯度设三次重 17 河北农业大学硕士学位 ( 毕业 ) 论文 复，以无菌水代替模板为整个实验过程的阴性对照。 2 ． 3 ． 7 ． 6 样品荧光定量检测 将接种叶锈病菌后各时间点小麦叶片的总 RNA 反转录成 eDNA ，以各样品 eDNA 为模板进 行荧光定量检测，每个时间点重复 3 次，以无菌水代替 eDNA 模板为实验中的阴性对照。根据 样品 Ct 值从标准曲线上求出相应基因的表达量。为消除各时间点样品量的差异及反转录效率的 影响，以小麦 GAFDH 为内参，对各时间点样品进行初始定量。 18 Ca” ． CaM 信使系统参与小麦抗叶锈病反应的研究 3 结果与分析 3 ． 1 小麦叶锈菌株的筛选 所选取的小麦叶锈菌株经过鉴定，最后选择编号为 05-5-127③ 和 05-22-64@ 的菌株作为供 试菌株，所选取的小麦叶锈菌株 05—5-127③ 经过鉴定，对 TcLrl5 表现为非亲和性反应，侵染型 为 ( ； ) ；菌株 05—22—64① 经过鉴定对 TcLrl5 表现为亲和性反应，侵染型为 (4) ；结果见图 l 。 豳 黪缀缀褫缀黪黟 黧瓣 图 l TcLrl 5 对小麦叶锈菌的侵染反应型 1 ：非亲和； 2 ：亲和 Fig ． 1 Infection types ofTcLrl 5 l ： avirulent race ； 2 ： virulent 撇 3 ． 2 防卫反应酶活性测定 3 ． 2 ． 1 TFP 预处理对小麦叶片接种非亲和性叶锈菌后四种防御酶的影响 正常生长条件下， TFP 预处理对小麦叶片的 POD 、 PAL 、 PPO 和 CAT 活性无明显影响 ( 图 2) 。 经 TFP 预处理后接种 TcLrl5 非亲和性叶锈菌 05 ． 5 ． 127③ 的叶片与未经 TFP 预处理接种非亲和性 叶锈菌 05-5 ． 127③ 的叶片相比试验检测的与抗病相关的酶类物质活性均受到抑制作用。其中， POD 活性在各时间点均呈下降趋势，在前 48 h 内下降幅度较小，从第 72 h 开始其下降幅度增大，且 在第 72 h 时下降幅度达到最大，下降了 35 ． 90 ％ 1 其 PAL 活性在各时间点也同样呈下降趋势，在 第 120 h 时下降的幅度最大，达到了 26 ． 01 ％，之后下降幅度逐渐减小；其 PPO 活性除在第 144 h 时略有上升外在其它时间点均呈下降趋势，其中在第 48h 和第 96h 时下降幅度较大，分别为 9 ． 42 ％ 和 9 ． 15 ％，从第 120 h 开始下降幅度逐渐减小；其 CAT 活性在前 72 h 内随着时间的延长其下降幅 度逐渐增大，且在第 72 h 时下降的幅度最大，达到了 22 ． 04 ％，第 72 h 之后的各时间点 CAT 活性 19 北农业大学硕士学位 ( 毕业 ) 论文 也都是下降的 ( 图 2) 。 6 4 2 O 8 hp 州 } 州 -o∞ 一《 L 6 趟 4 烬 帖 ∞ 拍 ∞ 拍加临 m J 《 暑 I^= ： ooL 掣蜉口 o‘ 2 0 咖㈣咖咖咖哪咖咖 o 0 0 24 48 72 96 120 144 168 0 24 48 72 96 120 144 168 时间 time(h) 时间 time(h) A TFP 预处理对小麦叶片接种非亲和性菌后 POD 活性的影响 B TFP 预处理对小麦叶片接种非亲和性菌后 PAL 活性的影响 Effect of TFP pretreat●ent of seeds OB POD Effect of TFP pretreat-ent of seeds on PAL acti vities in wheat leaves after iBOCUlation actjvitiea in wheat leaves after iUOCulatin 1400 8000 7000 1200 6000 1000 jI^= 口 d 奄 5000 t 800 量 4000 兰 600 、， 3000 400 2000 odL 掣烬 odd 200 hu 一，～ ¨Q∞ 卜《 u 州掣蜒卜《 u 1000 0 0 0 24 48 72 96 120 144 168 0 24 48 72 96 120 144 168 时间 time(h) 时间 time(h) C TFP 预处理对小麦叶片接种非亲和性菌后 PPO 活性的 I D TFP 预处理对小麦叶片接种非亲和性菌后 CAT 活性的影响 Effect of TFP pretreatment of seedings oe P Effect of TFP pretreataent of seedi on CAT ngs actjvities in wheat leaves after ieoculatio activities in wheat leaves after inoculation × 对照： ◆TFP+ 非亲和性组合： ▲ 非亲和性组合： |TFP 预处理 ×CK ； ◆TFP+avi ruIent rage ； ▲InocuIate with avi ruIent rage ； IITFP pretreatment 图 2 TFP 预处理对小麦叶片接种非亲和性叶锈菌后四种防御酶的影响 F i g ． 2 Effect of TFP pretreatment of seeds on four defense enzyme activities in detached wheat leaves after inoculation with avirulent race∞+127③to ToLrl5 3 ． 2 ． 2 CPZ 预处理对小麦叶片接种非亲和性叶锈菌后四种防御酶的影响 正常生长条件下， CPZ 预处理对小麦叶片的 POD 、 P 札、 PPO 和 CAT 活性无明显影响 ( 图 3) 。经 CPZ 预处理后接种 TcLrl5 非亲和性叶锈菌 05 ． 5 ． 127③ 的叶片与未经 CPZ 预处理接种 Tchl5 非亲和性叶锈菌 05-5-127③ 的叶片相比， POD 、 PAL 、 PPO 和 CAT 活性在测试的各时间点均表现 出降低的趋势。其中， POD 活性在各时间点均呈下降趋势，在前 120h 内随着接菌时间的延长其 下降幅度不断加大，且在第 120 h 时下降幅度最大达到了 35 ． 90 ％，之后下降幅度逐渐减小： PAL 活性在第 120 h 时下降的幅度最大，达到了 21 ． 98 ％： PPO 活性在第 48 h 和第 96 h 时下降幅度较 大，分别为 8 ． 44 ％和 8 ． 45 ％，从第 120 h 开始下降幅度逐渐减小；其 CAT 活性在前 72 h 内随着接 菌时间的延长其下降幅度逐渐增大，且在第 72 h 时下降的幅度最大，下降了 30 ． 22 ％，之后的各 时间点 CAT 活性下降幅度逐渐减小 ( 图 3) ． Ca2+ ． CaM 信使系统参与小麦抗叶锈病反应的研究 16000 14000 12000 -c 10000 ： 2 ‘8000 主喜 己 6000 趟 4000 烬 驺们孙 ∞ 拈 ∞ 屿 m =!^= 譬 oo‘ 掣蚂 ooL 2000 0 O 0 O 24 48 72 96 120 144 168 0 24 48 72 96 120 144 168 时问 ti-e(h) 时间 tiBe(h) A CPZ 预处理对小麦叶片接种非亲和性菌后 POD 活性的影响 B CPZ 预处理对小麦叶片接种非亲和性菌后 PAL 活性的影响 Effect of CPZ pretreatment of seeds 011 POD Effect of CPZ pretreatment of seeds OD PAL actiVities in wheat leaves after inoculation activities in wheat leaves after iDOCUlatiOD 1400 8000 暑 1200 7000 6000 =1000 口 5000 8 O O ． I 【 _ 一 } 叫 po∞ 卜 ‘u -T 4000 o 母。山山 ^ 专 ∞ ／ n— 6O O 掣 掣 3000 蜉 400 !lg 卜 2000 o 山 200 U lOOO 0 0 0 24 48 72 96 120 144 168 0 24 48 72 96 120 144 168 时问 ttme(h) 时间 time(h) C CPZ 预处理对小麦叶片接种非亲和性菌后 PPO 活性的影 l D CPZ 预处理对小麦叶片接种非亲和性苗后 CAT 活性的影响 Effect of CPZ pretreatment of seedings OD CAT Effect of CPZ pretreat-ent of seedings OD PH activities in wheat leaves after inoculatiOB actiVi tiea in wheat leaves after iIlOCUlatiOD × 对照； tcPz+ 非亲和性组合； ▲ 非亲和性组合； mCPZ 预处理 xCK ； @CPZ+avirulent race ； ▲Inoculate 、 )Iri 廿 1 avirulcnt race ； -CPZ pretreatment 图 3 CPZ 预处理对小麦叶片接种非亲和性叶锈菌后四种防御酶的影响 Fig ． 3 Effect of CPZ 脚 tmcnt of seeds 伽 four defense enzyme activities in de 吐 ached wheat leaves after inoculation with avirulent 玎 I∞05 ． 5 ． 127@tO TcLrl5 3 ． 2 ． 3 w 二 7 预处理对小麦叶片接种非亲和性叶锈菌后四种防御酶的影响 正常生长条件下， W-7 预处理对小麦叶片的 POD 、 PAL 、 PPO 和 CAT 活性无明显影响 ( 图 3) 。 经 w 二 7 预处理后接种 TcLrl5 非亲和性叶锈菌 05 ． 5 ． 127③ 的叶片与未经 w 二 7 预处理接种 TcLrl5 非 亲和性叶锈菌 05 ． 5 ． 127⑨ 的叶片相比，其 POD 活性在前 96 h 内下降幅度较小，从第 120 h 开始 下降幅度明显增大，且在第 120 h 时下降幅度最大达到了 41 ． 67 ％；其 PAL 活性除在第 72 h 活性 接近外，在其余各时间点都低于未处理接菌对照，且在第 120 h 时 PAL 活性下降幅度最大，下降 了 19 ． 03 ％；其 PPO 活性在各时间点也呈下降趋势，其中在第 48 h 时下降幅度较大，下降了 12 ． 18 ％； 其 CAT 活性在各个时间点也同样呈下降趋势，在第一天下降幅度最大，达到了 28 ． 35 ％，在第三 天下降幅度为 25 ． 86 ％ ( 图 4) 。 21 河北农业大学硕士学位 ( 毕业 ) 论文 h ，、 _ ： = = ' 三 U ．： U 日 母 J a 《 o k 山 越 掣 蜒 !ig J 帖如拍 ∞ 拈曲坫 m 口 《 。 ∞ 们加 ∞∞∞ 们 { 寻 L 5 ∞∞∞∞∞∞∞∞0 O O 24 {8 72 96 120 144 168 0 24 48 72 96 120 144 168 时间 tim(h) 时间 tine(h) A--7 预处理对小麦叶片接种非亲和性菌后 P∞ 活性的影响 B|-7 预处理对小麦叶片接种非亲和性菌后 PAL 活性的影响 Effect of■ 一 7 pret reatment of seeds on POD Effect of W-7 pretreatment of seeds On PAL actjVjtiea in wheat leaves after in∞uIation activi ties in wheat]eaves after inoculation 4 O O 8000 2 OO 7000 6000 0 O0 5 O 0 O 8 0O 4 O 0 O 2 ．暑／ nv 6 OO ^s ． ∞ ／ nv 3O O O 4 00 2 0 O O h= 三 po∞odcl“ ； l 烬 od‘ 2 0O o 日 _tu“v 烬 J ． ‘u l O O O O O O 2JI 48 72 96 lZO 144 168 0 24 48 72 96 120 144 168 时问 time(h) 时间 time(h) C W-7 预处理对小麦叶片接种非亲和性菌后 PP0 活性的影响 D W-7 预处理对小麦叶片接种非亲和性菌后 CAT 活性的影响 Effect of W 一 7 pretreatment of seedings Oit PP0 Effect of 冒一 7 pretreatment of seedings on CAT ectiVitieS in wheat leaves after iItOCUlatiOn actiVities in wheat leaves after inoculatiOIt x 对照； #w-7+zlE 亲和性组合； ▲ 非亲和性组合； roW-7 预处理 xCK ； @W-7+avirulent race ； ▲Inoculate with avirulent race ； roW-7 pretreatmcnt 图 4 W-7 预处理对小麦叶片接种非亲和性叶锈菌后四种防御酶的影响 Fig ． 4 Effect ofW-7 prctrcatmcnt ofseeds On four dcl 把 nsc enzyme activitiesindetachedwheatleavesaRcrinoculationⅥritll aviruleatrac 宅 05 ． 5 ． 127③toTcLrl5 3 ． 2 ． 4 CaCl2 预处理对小麦叶片接种亲和性叶锈菌后四种防御酶的影响 正常生长条件下， CaCl2 预处理对小麦叶片的 POD 活性有一定影响，除在第 24 h 时低于对照 外，其余各时间点都高于对照，其中在第 72 h 时 POD 活性上升的幅度最大，与对照相比增加了 76 ． 38 ％， CaCl2 预处理的接种 TeLrl5 亲和性叶锈菌 05 ． 22-64( 至 ) 与未处理接同一菌株的 POD 活性 相比，其 POD 活性在各个时间点都高于未处理的 POD 活性，其中在第 48 h 时 POD 活性增加的 幅度最大，达到了 44 ． 09 ％； CaCl2 预处理对小麦叶片的 PAL 活性有所影响，除在第 96 h 时的 PAL 活性略低于对照外，其余各时间点都略高于对照， CaCl2 预处理接种 TeLrl5 亲和性叶锈菌 05 ． 22-640 后与未处理接种同一菌株的 PAL 活性相比，其 PAJL 活性在各时间点都高于接菌对照， 且在第 72 h 时 PAL 活性上升的幅度最大，上升了 17 ． 89 ％ ( 图 5) ；然而， CaCl2 预处理对小麦叶 片的 PPO 活性无明显影响， CaCl2 预处理的接种亲和性叶锈菌 05-22-64(!) 与未处理接种同一菌株 22 Ca” ． CaM 信使系统参与小麦抗叶锈病反应的研究 的 PPO 活性相比，除第一天外其 PPO 活性在各个时间点都略高于未处理的 PPO 活性，其中在第 120 h PPO 活性增加的幅度较大，但仅仅为 7 ． 20 ％； CaCl2 预处理对小麦叶片的 CAT 活性同样无 明显影响，小麦叶片接种亲和性叶锈菌后其 CAT 活性先是上升在第 48 h 时达到一峰值，然后活 性逐渐下降。而经 CaCl2 预处理后长成的小麦叶片接种亲和性叶锈菌 05 ． 22 ． 64① 后其 CAIT 活性在 第 48 h 时达到一峰值，然后下降之后再上升到第 120 h 时又达到一峰值，之后再逐渐下降，其 CAT 活性在各时间点都高于未经 CaCl2 预处理的接菌叶片的酶活性，且在第 120 h 时 CA ： r 活性上 升的幅度最大为 71 ． 1l ％ ( 图 5) 。 h ^ p ‘ 一 = ' ‘__ } _ ．： U U ∞ 日 凸 J o 《 a_ L 掣 趟 烬 赡 ∞ 弘 ∞ 特 ∞ 坫 m 凸 J 。 《 0 actiVjties in wheat Ieaves after inocuIatio“ 毫 二勰 ¨ 愁一 O 时间 ti 帕 (h) ^CaCI 2 预处理对小麦叶片接种亲和性菌后 P00 活性的影响 孔黧 Effect of CsC 2 pretreatment of seeds on POD 。墓耋一 4 O O 7 O O O 1 ^ 皇 2 0 0 ．： = 6 O 0 O ' 兰 O O 0 = 5 O 0 O U 譬 田 8 O O 卜 4 O 0 O 星 《 U 6 O O ^∞ 面／ n— 3 O O O 一 q ． ∞ ＼ n) 趟 蹇 4 0 0 !}g 2 O O O 卜 《 星 2 0 0 l O O O O O 0 24 48 72 96 120 144 168 0 24 48 72 96 120 144 168 时间 time(h) 时间 tilie(h) C CaCl2 预处理对小麦叶片接种亲和性菌后 PPO 活性的曼 D CaCl2 预处理对小麦叶片接种亲和性菌后 CAT 活性的影响 Effect of CaCH pretreatment of seedings 01]P Effect of CaCl2 pretreat-ent of seedings on CAT activitiee in wheat leaves after inoculatiol 8Ctivities i11 wheat leaves after inoculation × 对照： ◆CaCl=+ 亲和性组合： ▲ 亲和性组合： ■GaGI ：预处理 ×CK ： ◆CaCI—Vi ruIent race ： ▲InocuIate with Vi ruIent race ； lCaOI 2 pretreatment 图 5 CaCl 。预处理对小麦叶片接种亲和性叶锈菌后四种防御酶的影响 Fig ． 5 Effect of CaCI 2 pretreatment of seeds∞four defense enzyme actiVitiea in detached wheat Ieaves after inoculation with Virulent race 05-22-64①to TcLrl5 3 ． 3 小麦总 PJqA 的提取 研究发现，分离纯净、完整的 RNA 是进行基因表达分析的基础。本研究采用植物 RHA 提取 试剂提取小麦总 P-J 叮 A ，该方法适用于提取植物的 RNA ，得到的 RNA 质量较高，且基因组 DNA 23 北农业大学硕士学位 ( 毕业 ) 论文 的污染较少，在 1 ． 0 ％琼脂糖凝胶电泳上检测所提取的 RNA 。小麦样品部分总 RNA 的电泳检测结 果如图 2 所示。琼脂糖凝胶电泳结果表明，所提取的总 RNA 中 28S RNA 与 18S RNA 的亮度基 本相等，符合试验要求，能够进行下一步试验。 4---28s ： 一 3 ． 4 CaM 不同亚型基因的表达情况 3 ． 4 ． 1 小麦 GAPDH 的标准曲线制作及表达量分析 以小麦的 GAPDH 为内参照，消除反转录效率及模板量的差异。首先制作小麦 GAPDH 的 标准曲线，见图 7 ，由图可见，各稀释梯度 PCR 反应很好，重复性很高。相关系数为 R2=0 ． 998 ， Y=-0 ． 3295X+7 ． 28 ，说明所制作的标准曲线线性关系良好，斜率为． 0 ． 3295 ，在斜率要求范围 -0 ． 2 ～ ． O ． 33 之间，说明标准曲线的可信度较高。 k 薹 ’’_ 二 ’’’ 矗 ’’ 厶 ’’’ 矗 ’ 二二产 ’’’ 二 ’ 。 ’ 五 ’’’’ ．． o’’ 一 · 图 7 小麦 GAPDH 的标准曲线图 F i g ． 7 Standard curve of wheat GAPDH 以接种叶锈菌后各时间点样品的反转录 eDNA 为模板，以 GAPDH 的引物和 SYBR 进行荧 光定量检测。结果见图 8 ，由于反转录效率及模板量的差异，各时间点样品中 GAPDH 表达丰度 并不完全一致，由此可见，用内参照基因对各样品进行标准化处理是非常必要的。 24 Ca2+ ． CaM 信使系统参与小麦抗叶锈病反应的研究 图 8 小麦在接种后各时间点样品中 GAPDH 的表达情况 Fig ． 8 Expression ofGAPDH at the intervals after inoculation in wheat 诵 th Puccinia triticina 3 ． 4 ． 2 小麦 CaM SF ． 1 的标准曲线制作及表达量分析 根据 CaM SF-1 在样品中的表达量将标准曲线稀释梯度设为 o ． 005n## ～ 500 ng 似，标准曲 线相关系数为 0 ． 991 ，斜率为 -0 ． 2818 ，说明标准曲线的线性关系和可信度均达到要求，样品的表 达量正好落在标准曲线范围内 ( 图 9) 。 图 9 CaM SF ． 1 在接种后各时间点样品中的表达情况 Fig ． 9 Expression ofCaM SF-I at the intervals after inoculati011 with Puccinia triticina 从 0 h 到 24 h 亲和组合、非亲和组合与不接菌对照相比 CaM SF ． 1 基因表达量变化不大，从 24 h 开始亲和组合、非亲和组合 CaM SF ． 1 基因表达量上升且到 48 h 达最大值，在第 48 h 时非亲 和组合 CaM SF·l 基因表达量比对照增加 232 ． 9 ％，比亲和组合增加 24 ． 6 ％，之后表达量下降，但 仍高于对照和亲和组合 ( 图 10) 。 河北农业大学硕士学位 ( 毕业 ) 论文 2 5 2 删 蚓 1 5 撰 靛 罂 1 0 5 O 0 6 12 24 48 72 96 时间 time(h) 图 10 白 ∥SF-I 基因表达情况 Fig ． 10 express of Ca■sF 一 1 gene 3 ． 4 ． 3 小麦 CaM SF ． 2 的标准曲线制作及表达量分析 根据 CaM SF-2 在样品中的表达量将标准曲线稀释梯度设为 0 ． 005 ng ／ Ill ～ 500 ng ／ gl ，标准曲 线相关系数为 0 ． 994 ，斜率为 -0 ． 3288 ，说明标准曲线的线性关系和可信度均达到要求，样品的表 达量正好落在标准曲线范围内 ( 图 11) 。 虻 ! ： 。厶 ’7’ 二 ’ 盎 五 ’ 。。．． o 。 ’ 矗 ’ 。。 ’ ．． o 。 ’j 巨固 图 1I CaM SF-2 在授种后各时间点样品中的表达情况 Fig ． 1 l Expression of CaM SF-2 at the intervals after inoculation with Puccinia triticina 从 0 h 到 12 h 亲和组合、非亲和组合与不接菌对照相比 CaM SF ． 2 基因表达量变化不大，从 12 h 开始亲和、非亲和组合 CaM SF-2 基因表达量上升且到第 48 h 达到峰值，在这一过程中亲和 组合 CaM SF-2 基因表达量上升的幅度要大于非亲和组合，在第 48 h 时亲和组合 CaM SF ． 2 基因 表达量比对照增加 1018 ％，比非亲和组合增加 79 ％，之后表达量下降，但仍高于对照和非亲和 组合 ( 图 12) 。 Ca'+ ． ca^I 信使系统参与小麦抗叶锈病反应的研究 12 10 咖 { 趔 懈 智 罂 0 6 12 24 48 72 96 时间 t{RIP ．仆 1 图 12 CaM$F-2 基因表达情况 Fig ． 12 express of CaM 5P 口 gene 3 ． 4 ． 4 小麦 CaM SF ． 3 的标准曲线制作及表达量分析 根据 CaM SF-3 在样品中的表达量将标准曲线稀释梯度设为 0 ． 005 ng ／ p 1"500 n∥la l ，标准 曲线相关系数为 O ． 99 ，斜率为． 0 ． 2464 ，说明标准曲线的线性关系和可信度均达到要求，样品的表 达量正好落在标准曲线范围内 ( 图 13) 。 ／ i-"71-I" ， - 卜 一 。： ’ 。 ’ 矗 立 ’ 盎 五。。。。二 ’’ 。 ’ 矗 ’’ 。。矗。 ’- ． 昏亘目 图 13 CaM SF-3 在接种后各时间点样品中的表达情况 Fig ． 13 Expression of CaM SF 一 3 at the int ． ervaIs after inocuIation with Puccinia triticina 从 0 h 到 12 h 亲和组合、非亲和组合与不接菌对照相比 CaM SF-3 基因 mRNA 表达量变化不 大．从第 12 h 开始亲和组合、非亲和组合中 CaM SF-3 基因表达量上升到 24 h 达到峰值，之后 CaM CaM SF-3 基因表达量下降，在第 24 h 时亲和组合与非亲和组合中 CaM SF-3 基因表达量相差 不大，比对照分别高出 16 ． 3 ％和 19 ． 8 ％：在第 48 h 时亲和组合与非亲和组合中 CaM SF-3 基因 表达量相差不大，比对照分别高出 27 ． 3 ％和 22 ． 1 ％；在第 72 h 时亲和组合与非亲和组合的 CaM SF 一 3 基因表达量又低于对照，在第 96 h 时三者的 CaM SF-3 基因表达量相差不大 ( 图 14) 。 北农业大学硕士学位 ( 毕业 ) 论文 l 2 亲和性组合 非亲和性组合 l 对照 蛔 I 0 8 蝈 僻 O 6 按 罢 O 4 O 2 0 0 6 12 24 48 72 96 时间 time(h) 图 14CaM SF-3 基因表达情况 Fig ． 14 express of Calf 洲 gene 3 ． 4 ． 5 小麦 CaM SF ． 4 的标准曲线制作及表达量分析 根据 CaM SF-4 在样品中的表达量将标准曲线稀释梯度设为 0 ． 005 ng ／ u 1 ～ 500 ng ／． 1 ，标准 曲线相关系数为 0 ． 99 ，斜率为． 0 ． 3442 ，说明标准曲线的线性关系和可信度均达到要求，样品的表 达量正好落在标准曲线范围内 ( 图 15) 。 蚕。。，． { ： JL O’- ： 品备 ’ 二 ’ 五 ’ 二 · 图 15 CaM 跖 _ 在接种后各时间点样品中的表达情况 Fig ． 15 Expression of CaM 刮 14 at the intervaIs after inoculation-ith Puccinia triticina 从 0 h 到 12 h 亲和组合、非亲和组合中 CaM SFJ, 基因表达量与对照相比变化不大，从第 12 h 开始 CaM SF_4 基因表达量上升，在第 24 h 时非亲和以及亲和组合中 CaM SF4 基因表达量达 一峰值，此时非亲和组合中 CaM SFJ, 基因表达量比对照高出 97 ． 8 ％，比亲和组合高出 26 ． 8 ％， 之后表达量下降，从 72 h 到 96 h 非亲和组合中 CaM SFJ, 基因表达量接近对照，但亲和组合中 CaM SF_4 基因表达量却高于对照和非亲和组合 ( 图 16) 。 Ca2+ ． CaM 信使系统参与小麦抗叶锈病反应的研究 2 ． 5 器 2 ∞ ■ △ 删蔷，。 划 ∞l-b 僻．三 靛 = 罂石 1 ■ m 暑 0 ． 5 0 0 6 12 24 48 72 96 时间 time(h) 图 16 CaM SF'-4 基因表达情况 Fig ． 16 express of CaM 洲 gene 3 ． 4 ． 6 小麦 CaM 的标准曲线制作及表达量分析 根据 CaM 在样品中的表达量将标准曲线稀释梯度设为 0 ． 005ng ／山～ 500ng ／ Ill ，标准曲线相关 系数为 0 ． 995 ，斜率为 _o ． 3295 ，说明标准曲线的线性关系和可信度均达到要求，样品的表达量正 好落在标准曲线范围内 ( 图 17) 。 k! 。．二。 ’ 厶 厶 t ； 厶。 厶。。 7’ 矗 ’’ 厶 。 j 唇蕃习 图 17 CaM 在接种后各时间点样品中的表达情况 Fig ． 1 7 Expression of CaM SF-4 at the intervals attcr inoculation with Puccinia triticina 从 0 h 到 6 h 亲和组合、非亲和组合以及对照中 CaM 基因表达量都是下降的，从第 6 h 开始 对照中 CaM 基因表达量变化不大，而亲和组合中 CaM 基因表达量从第 6 h 开始上升到第 12 h 达到峰值，之后表达量下降，而非亲和组合中 CaM 基因表达量从第 6 h 开始上升到第 24 h 达到 峰值，之后表达量下降，在第 24 h 非亲和组合中 CaM 基因表达量比对照高出 89 ． 5 ％，比亲和组 合高出 18 ． 1 ％：在第 48 h 非亲和组合中 CaM 基因表达量比对照高出 157 ． 1 ％，比亲和组合高出 47 ． 9 ％ ( 图 18) 。 29 河北农业大学硕士学位 ( 毕业 ) 论文 2 ． 5 2 1 ． 5 捌图僻霞日 {f l ∞∞o ． Ia 】 co∞ 》一 p∞ ． ro■ocp 0 ． 5 0 O 6 12 24 48 72 时间 time(h) 图 18CAM 基因表达情况 Fig ． 18 express of CaM gene Ca2+ ． CaM 信使系统参与小麦抗叶锈病反应的研究 4 讨论 4 ． 1 关于小麦叶片总 RNA 的提取 小麦是禾谷类作物中基因组最大的粮食作物，不但基因组大，而且其 RNA 的组成也很复杂， 由于叶绿体 16S RNA 和 9S RNA 的大量存在，使得到的小麦叶片的总 RNA 比动物及菌类多出 2 条带，因此，小麦叶片的总 RNA 的完整性评定方法与传统方法存在一定差异。本试验采用植物 RNA 提取试剂来提取小麦叶片的总 RNA ，能够在较短时间内完成 RNA 的提取，降低了内源 RNase 对 RNA 的降解作用，琼脂糖凝胶电泳结果表明 28S RNA 与 18S RNA 的亮度基本相等，符合试 验要求，能够进行下一步试验。 4 ． 2 CaM 拮抗剂与 Ca2+ 对防卫反应酶活性的影响 本实验测定了小麦叶片接种亲和性以及非亲和性叶锈菌后 POD 、 PAL 、 PPO 和 CAT 活性的 变化，结果与前人所做的结果基本一致，即非亲和组合的酶活性高于亲和组合。另外，本实验还 测定了药剂预处理以及药剂预处理再接菌的小麦叶片的酶活性，结果表明： TFP 、 CPZ 和 W-7 预 处理对小麦叶片的 POD 、 PAL 、 PPO 和 CAT 活性无明显影响， CaCl2 预处理对小麦叶片的 PPO 和 CAT 活性也无明显影响，而 CaCl2 预处理使小麦叶片的 POD 和 PAJL 活性增强，其中 POD 活 性增加的幅度较大，可能是由于 CaM 本身能与 POD 、 PAL 结合，而在 Ca2+ 存在的情况下，将 POD 和 PAL 激活。 小麦叶片接种非亲和性叶锈菌后， TFP 、 CPZ 和 w ． 7 浸种处理抑制了 POD 、 PAL 、 PPO 和 CAT 活性的上升，其中对 POD 活性抑制的幅度最大，对 PPO 活性抑制的幅度最小，可能是因为 POD 本身就对小麦叶锈菌的诱导比较敏感，而 PPO 活性对小麦叶锈菌的诱导不很敏感的缘故： 小麦叶片接种亲和性叶锈菌后， CaCl2 预处理加剧了 POD 、 PAL 、 PPO 和 CAT 活性的上升。由于 TFP 、 CPZ 和 W-7 预处理可阻碍 Ca2+ ． CaM 信使系统传导，从而阻碍其调节相应的抗性过程。因 此，病原菌侵染小麦幼苗后很可能启动了 Ca2+ ． CaM 信使系统来调节 POD 、 P ： AJL 、 PPO 和 CAT 的 活性增强植物对病原菌的抗性。而 Ca2+ ． CaM 信使系统传导的阻碍，使酶活性的增强受阻，从而 降低了植物的适应性。另外，笔者还观察了小麦种子用 CaM 拮抗剂 (TFP 、 CPZ 和 W-7) 预处理 后接种非亲和性叶锈菌后的表型，并没有观察到有明显变化 ( 即由抗病变为感病 ) ，同样， CaCl2 预处理接种亲和性叶锈菌后的表型也没有明显变化 ( 即由感病变为抗病 ) 。虽然 TFP 、 CPZ 和 W-7 浸种处理抑制了小麦叶片接种非亲和性叶锈菌后 POD 、 PAL 、 PPO 和 CAT 活性的上升，但并不 能使小麦由抗病变为感病；而 CaCl2 预处理也加剧了小麦叶片接种亲和性叶锈菌后 POD 、 PAL 、 PPO 和 CAT 活性的上升，但并不能使小麦由感病 变为抗病。推测 CaM 在小麦抗叶锈病信号转导 中起作用但并不是抗病信号转导的唯一途径，即使 CaM 活性被抑制依然有其他途径可以传递抗 病信号，至于有哪些途径传递抗病信号还有待于更深一步研究。 3l 河北农业大学硕士学位 ( 毕业 ) 论文 4 ． 3 关于荧光实时定量 PCR 技术 荧光实时定量 PCR 技术自 1996 年诞生以来，由于它显著的优越性，已在分子生物学各个研究 领域得到广泛的应用。实时荧光 PCR 技术已广泛应用于临床及生命科学研究的各个领域中。在科 研方面可定量分析各种基因的表达分析，基因突变和多态性分析，单核苷酸多态 SNP 测定及易位 基因的检测；在医疗方面可用于免疫组化分析、临床疾病早期诊断、病原体检测、耐药性分析、 肿瘤微小残留病变研究等【 2 丌。近几年在植物转基因成分检测、有害病原微生物检测及基因表达 情况分析等方面应用的报道也越来越多。其中，荧光染料的方法不需要使用特异性荧光标记的探 针，相对简便，其特异性完全由 PCR 的引物所决定，同时也降低了检测的成本。本研究采用以 SYBR Grin I 为染料的荧光实时定量 PCR 技术对小麦接菌后 CaM 基因以 及 CaM 四个亚型基因的表达情 况进行了精确定量，以明确其与抗病性的关系。荧光定量检测由于是采用双标准曲线法，即用内 参基因来消除样品量误差及反转录效率的影响，而且是在完全封闭的系统内对扩增的线性期进行 检测，与终点法定量相比，得到的结果更为准确，可信度更高。 4 ． 4 小麦与叶锈菌不同互作组合中 CaM 不同亚型基因的表达差异 小麦接菌后在前 12h 内 CaM 的四个亚型基因表达量与不接菌对照相比相差不大。小麦接菌 后在第 48h 、第 7211 、第 96h 时非亲和组合中 CaM SF-1 基因表达量要高于亲和组合的 CaM SF-1 基因表达量，分别高出 24 ． 6 ％、 26 ． 6 ％、 38 ． 8 ％。小麦接菌后在第 24h 、第 48h 时非亲和组合中 CaM SF-4 基因表达量要高于亲和组合中 CaM SF-4 基因表达量，分别高出 26 ． 8 ％、 28 ． O ％，而在第 72h 、 第 96h 时非亲和组合中 CaM SF-4 基因表达量又低于亲和组合中 CaM SF-4 基因表达量。可以看 出，小麦中 CaM SF-I 基因与 CaM SF-4 基因可能与小麦抗叶锈病相关。小麦接菌后从第 24h 到 第 96h 这一过程中亲和组合中 CaM SF-2 基因表达量都高于非亲和组合中 CaM SF-2 基因表达量， 说明小麦中 CaM SF ． 2 基因可能与小麦感叶锈病相关。小麦接菌后从第 24h 到第 96h 这一过程中 亲和组合中 CaM SF-3 基因表达量与非亲和组合中 CaM SF ． 3 基因表达量相差不大，说明小麦中 CaM SF 一 3 可能与小麦抗叶锈病无关。小麦接菌后在第 24h 、第 48h 时非亲和组合中 CaM 基因表 达量要高于亲和组合中 CaM 基因表达量，分别高出 18 ． 1 ％和 47 ． 9 ％，而在第 72h 和第 96h 时非 亲和组合中 CaM 基因表达量又低于亲和组合中 CaM 基因表达量，这说明 CaM 基因在参与小麦 抗叶锈病过程中第 24 h 和第 48 h 是小麦表现抗病性的关键时间点。 32 Ca2+ ． CaM 信使系统参与小麦抗叶锈病反应的研究 5 结论 1 ．小麦叶片接种非亲和性叶锈菌后， TFP 、 CPZ 和、 n7 浸种处理抑制了过氧化物酶 (POD) 、丙氨 酸解氨酶 (PAL) 、多酚氧化酶 (PPO) 和过氧化氢酶 (CAT) 活性的上升；小麦叶片接种亲和性叶锈菌 后， CaCh 预处理加剧了过氧化物酶 (POD) 、丙氨酸解氨酶 (PAL) 、多酚氧化酶 (PPO) 和过氧化氢 酶 (CAT) 活性的上升。 2 ．用实时定量 PCR 的方法检测了小麦接菌后 CaM 四个亚型 CaM SF-I ， CaM SF-2 ， CaM SF ． 3 ， CaM SF-4 以及 CaM 基因的表达，发现 CaM SF ． 1 ， CaM SF ． 2 ， C 蝴 SF ． 3 ， CaM SF-4 在接种后不 同时间点的表达量差异很大。这说明 ca ． CaM 信使系统可能在小麦抗叶锈病过程中起着重要作 用，并且不同的 CaM 亚型可能调控不同的抗病途径。 3 ． CAM 拮抗剂 (TFP 、 CPZ 和 W-7) 预处理小麦种子，幼苗接种非亲和性叶锈菌后表型没有明显 变化 ( 即由抗病变为感病 ) ，同样， CaCl2 预处理小麦种子，幼苗接种亲和性叶锈菌后的表型也没 有明显变化 ( 即由感病变为抗病 ) ，但发病时间延迟 2~3 天。 33 参考文献 【 1]Komer JA ． Genetics ofresistance to wheat leafrust[J] ． Annual Review ofPhytopathology,1996 ， 34 ： 435-455 ． 【 2]Kloppers F J ， Pretorius Z A ． Effects of combinations amongst genes Lrl 3 ， Lr34 and Lr37 on components ofresistance in wheat to leafrust[J] ． Plant Pathology,1997 ， 46(5) ： 737-750 ． 【 3]Knott D ＆ The wheat rust breeding for resistance 【 J 】． Theoretical and Applied Genetics ， 1 989 ， 191-198 ． 【 4 】刘娟，王智圻，汪宜萱，等．小麦在叶锈菌侵染过程中过氧化物酶及多酚氧化酶活性的变化【 J 】． 河北农业大学学报， 1989 ， 12(3) ： 4l~45 ． 【 5]t 庆梅，陈珈．感染叶锈菌的小麦细胞间隙中激发子的定性及初步分离【 J 】．植物生理报， 2000 ， 26(5) ： 427432 ． 【 6]Pohringer R ． Infection-related proteins in intercellular washing fluids from stern rust-affected leaves ： Race-associated protein differences revealed by PAGE and Con A 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19Na2EDTA-2H20 溶于 800mL 水中，用固体 NaOH 调 pH 值至 8 ． 0 ，定容至 1000mL ，高 温灭菌，室温保存。 3 ． 10xTBE buffer ： Tris base 2169 Boric acid( 硼酸 ) l 109 0 ． 5M EDTA(pH8 ． 0) 74 ． 5mL 搅拌溶化，定容至 2000mL ，室温保存。 4 ． NaCI 5mol ／ L ： 292 克 NaCI 加 H20 至儿。 5 ． 3M NaAC(250mL) ： 1029 NaAC ，溶于 200mL 蒸馏水中，用冰乙酸调 pH 至 5 ． 2 定容至 250mL 。 6 ． EB ： lgEa 溶于 100mL 水中，配成 10mg ／ mL 贮存液，置于棕色瓶中，室温保存。 7 ． PH=7 ． 8 磷酸缓冲液：称取 Na2HP04 8 ． 95359 ，加 500 mL 蒸馏水，配成溶液 A ；称取 Nail2P043 ． 909 ，加入 500mL 蒸馏水，配成溶液 B ，将 A 与 B 混合 ( 用 PH 计调 PH 值 ) 配成 PH=7 ． 8 的磷酸缓冲液。 附录 B 小麦抗叶锈病基因目录 39 LrlO IAS 普通小麦 1 ．￡ e ／ 6’Thatcher ； Concho Lrl l 2A 普通小麦 Hussar,Hart ； Thatcher’6 ／ Hussar Lrl2 4BS 普通小麦 Exchange ／ 6" Thatcher ； Opal Lrl3 2BS 普通小麦 Tc’7 ／ Frontana ； Hustler Lrl4a 7BL 普通小麦 Spica ； Aotea ； Selkirk ／ 6’Thatcher Lrl4b 7BL 普通小麦 Maria Escobar ／ 6’Thatcher Lrl4ab 7BL 普通小麦 Lrl4a ／ 6’Thatcher ／／ Lrl4b ／ 6’Thatcher Lrl5 2DS 普通小麦 Thatcher"6 ／ Kenya W1483 Lrl 6 2BS 普通小麦 Exchange ／ 6’Thatcher ； , Lrl7a 2AS 普通小麦 l(1eiIl Lucero ／ 6’Thatcher ； ,EAP26127 Lrl 7b 2AS 普通小麦 Harrier Lrl 8 5BL 普通小麦 Africa 43 ／ 7’Thatcher ； ,Sabikei 12 Lrl 9 7DL 长穗偃麦草 Agropyron dongatum ； Agrus Lr20 7AL 普通小麦 Axminster ； Birdproof ； Bonus Lr21 IDL 方穗山羊草 Thatcher" 6 ／ Tetra Lr22a 2DS 方穗山羊草 Thatcher"3 ／ Tewa Lr22b 2D 方穗山羊草 Canthatch ； Thatcher Lr23 2BS 普通小麦 Lee FL 310 ／ 6’Thatcher ； Crim ； Lr24 3DL 长穗偃麦草 Ag ． elongatum ； Cody ； Osage Lr25 4BS 黑麦 Secale eereale ； Transfed ； Lr26 1BL 黑麦 Seeale eereale ； Iris ； Sabina Lr27 3BS 普通小麦 Gatcher ； CS’6 ／ Ciano 3B Lr28 4BL 拟斯卑尔脱山羊草 CS 2A ／ 2M 4 ／ 2 ； CS 2D ／ 2M 3 ／ 8 Lr29 7DS 长穗偃麦草 Ag ． elongatum ； Sears 。 7D ／ Ag#ll Lr30 4AL 普通小麦 Terenzio ； Thatcher’6 ／ Terenzio Lr 3 1 4BS 普通小麦 Chinese spring Lr32 3DS 粗山羊草 RL 5713 Lr33 IBL 普通小麦 PI 58548 ； RL 6057 Lr34 7D 顶芒山羊草 Line897 ； Line 920 ； Tc’6 ／ P158458 Lr35 2B 斯卑尔脱山羊草 RL571l Lr36 6BS 斯卑尔脱山羊草 Line 2-9-2 ； Line E84018 Lr37 2AS 偏凸山羊草 Tc' ／ VPMl ； Hyak ； Madsen Lr38 2AL 中间偃麦草 l 也 6097 Lr39 2DS 方穗山羊草 Aegilops squarrosa Lr40 1DS 方穗山羊草 Ae ． squarrosa Lr41 2DS 方穗山羊草 KS90WGRCl0 Lr42 ID 方穗山羊草 KS91WGRCl 1 Lr43 7D 方穗山羊草 KS92WGRC16 Lr44 lBL 拟斯卑尔脱山羊草 Ae. 句时toides Lr45 2AS 黑麦 Secale cereale Lr46 lBL 普通小麦 Pavon76 Lr47 7AS 斯卑尔脱山羊草 Speltoid臼 Lr50 2BL 普通小麦 T.也nophee说i Lr51 IS/1B 斯卑尔脱山羊草 T.speltoid臼 Lr52 Lr53 5BS 6BS 普通小麦 二粒小麦 AE Watk.ins; RL6107 T.di∞∞oid臼 Lr54 2DL 柯氏山羊草 A.kotschyi Lr55 1B 粗碱披碱草 E.回.chycaulis Lr56 6AL 沙仑山羊草 Line03524 Lr57 5D 卵穗山羊草 T5DL.5DS-5M(g)S 41 在读期间发表的学术论文 【 1 】霍建飞，宋水山，李星，等． Ca2+ ． CaM 信使系统参与小麦抗叶锈病反应的初步研究 [J 】．华北农学报， 2008 ， 23 ． 【 2]Huo JE Song SH S ， Li Xing ， et a1 ． Research on the Involvement of Ca2+ ． CaM in the Resistance ofWheat against Puccinia triticina ． ( 待发 ) 稿件录用通知 凌豢零黪 ? 黪辫糍翰鬓澄黜露犊嬲溺燃 黪 - ：。 + ， j 簇避飞网卷： i i o-i ，，．．． 1 一 裙步冁辩》经垮核，襁裔零刊鼹臻，拟宠在《黪北纛学缀 ≯ 麴赡 j 簪 麓辔溺剽麓袭， ] 请勿俺援；梅糍谴明， j? 一 翩蓬 42 作者简介 姓 名：霍建飞 性 别：男 出生年月： 1981 年 11 月 政治面貌：共青团员 籍 贯：河北省宽城县 毕业院校：河北农业大学 学习经历： 2000 ． 9-2004 ． 7 ： 河北农业大学植物保护学院植物保护专业攻读本科，获农学学士 学位： 2005 ． 9 ． 2008 ． 7 ： 河北农业大学植物保护学院植物病理学专业攻读硕士学位。 43 致谢 本论文是在我的导师刘大群教授、宋水山研究员的悉心指导下完成的，从论文的选题、设计、 实施到成文，无不凝聚着两位导师的辛勤汗水和心血。他们严谨的科学态度、无私忘我的工作精 神、渊博的知识和诲人不倦的育人精神，使学生在学术研究中、生活中、社交中学到了许多宝贵 经验，将使学生毕生受益。在此，我真诚感谢两位恩师三年来对我的谆谆教导和无微不至的关怀。 衷心感谢张汀老师在实验和生活中给予的无私帮助，同时感谢河北农业大学植物保护学院生 物防治实验室各位老师为试验的顺利进行给予的无私指导和帮助。 由衷感谢杨文香教授、蒋继志教授和李亚宁副教授对论文修改提出的宝贵意见。 感谢李星博士、张娜博士、张占全硕士、付胜杰硕士、张利军硕士、冯丽娜硕士、高士刚硕 士、高倩硕士、程志峰硕士、张英春硕士、李爱霞硕士、赵小丽硕士、张萌硕士、王璇硕士、郝 春英硕士、温晓蕾硕士等在试验过程中给予的 大力支持和帮助。 最后，真诚感谢理解、关怀和支持我完成学业的父母、亲人和朋友 ! 霍建飞 2008 年 6 月