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首页 -第十二章色谱法引论

-第十二章色谱法引论.pdf

-第十二章色谱法引论

仙人指路
2019-03-02 0人阅读 举报 0 0 暂无简介

简介:本文档为《-第十二章色谱法引论pdf》,可适用于初中教育领域

色谱法引论Introductiontochromatography一概述色谱法的发展)年俄国植物学家TswettMikhailS最先发明。他采用填充有固体CaCO细颗粒的玻璃柱将植物色素的提取物加于柱顶端然后以石油醚做溶剂进行淋洗被分离的组份在柱中显示了不同的色带他称之为色谱。(希腊语中“chroma”=color“graphein”=write)。)世纪到年代出现了柱分配和纸色谱。)年,马丁(MartinArcherJP)和辛格(SyngeRichhardLM)提出用气体代替液体的可能性,发表了第一篇气相色谱论文,还提出了著名的塔板理论,并于年获得了诺贝尔奖。)年瑞典科学家Tiselins因电泳和吸附的研究而获得了诺贝尔奖。)世纪年代,范第姆特(VanDeameter)提出速率理论同时代出现了气质联用技术年代高效液相色谱飞速发展之后,产生了超临界流体色谱、毛细管电色谱等等。年有个Nobel奖是有关色谱研究的!分类方法固定相平衡类型气液色谱液体吸附于固体气液间分配气固色谱固体吸附剂吸附气相色谱气相键合色谱有机组份键合于固体表面液体和键合体表面间的分配液液色谱液体吸附于固体不相溶液体间的分配液固(吸附)色谱固体吸附剂吸附液相键合色谱有机组份键合于固体表面液体和键合体表面间的分配离子交换色谱离子交换树脂离子交换液相色谱凝胶渗透(尺寸排阻)色谱液体附于多孔聚合物分配筛析超临界流体有机组份键合于固体表面超临界流体和键合相间分配色谱法的分类)按两相状态分类)按分离机理分类A)吸附色谱法:利用吸附剂(固定相一般是固体)表面对不同组分吸附能力的差别进行分离的方法B)分配色谱法:利用组分在固定液(固定相)中溶解度不同而达到分离的方法C)离子交换色谱法:利用组分在离子交换剂(固定相)上的亲和力大小不同而达到分离的方法D)凝胶色谱法或尺寸排阻色谱法:利用大小不同的分子在多孔固定相中的选择渗透而达到分离的方法E)亲和色谱法:利用不同组分与固定相(固定化学分子)的高专属性亲和力进行分离的技术常用于蛋白质的分离。)按固定相的外形分类柱色谱:填充柱、整体柱、毛细管或开管柱平面色谱:薄层色谱和纸色谱二色谱流出曲线及有关术语色谱流出曲线和色谱峰以检测器输出的信号对时间做图所得曲线称为色谱流出曲线曲线上的突起部分就是色谱峰。色谱流出曲线和色谱峰混合组分的分离过程及检测器对各组份在不同阶段的响应色谱术语:)基线:在实验条件下色谱柱后仅有纯流动相进入检测器时的流出曲线称为基线SN大的、稳定的基线为水平直线。)峰高:色谱峰顶点与基线的距离。utLu死时间柱长)保留值(Retentionvalue,R)a死时间(Deadtime,t):不与固定相作用的物质从进样到出现峰极大值时的时间它与色谱柱的空隙体积成正比。由于该物质不与固定相作用因此其流速与流动相的流速相近。据t可求出流动相平均流速b保留时间tr:试样从进样到出现峰极大值时的时间。它包括组份随流动相通过柱子的时间t和组份在固定相中滞留的时间。c调整保留时间:某组份的保留时间扣除死时间后的保留时间它是组份在固定相中的滞留时间。即由于时间为色谱定性依据。但同一组份的保留时间与流速有关因此有时需用保留体积来表示保留值。d死体积V:色谱柱管内固定相颗粒间空隙、色谱仪管路和连接头间空隙和检测器间隙的总和。忽略后两项可得到:其中Fco为柱出口的载气流速(mLmin)其值为:F检测器出口流速Tr室温Tc柱温p大气压pw室温时水蒸汽压。'rtr'rtttcoFtVwrccopppTTFFe保留体积Vr:指从进样到待测物在柱后出现浓度极大点时所通过的流动相的体积。f调整保留体积:某组份的保留体积扣除死体积后的体积。g相对保留值r,:组份的调整保留值与组份的调整保留值之比。注意:r,只与柱温和固定相性质有关而与柱内径、柱长L、填充情况及流动相流速无关因此在色谱分析中尤其是GC中广泛用于定性的依据!具体做法:固定一个色谱峰为标准s然后再求其它峰i对标准峰的相对保留值此时以表示:>,又称选择因子(Selectivityfactor)。corFtV'rVco'rr'rFtVVV'r'r'r'r,VVttr)s(t)i(t's'rh区域宽度:用于衡量柱效及反映色谱操作条件下的动力学因素。通常有三种表示方法:标准偏差:倍峰宽处的一半。半峰宽W:峰高一半处的峰宽。W=峰底宽W:色谱峰两侧拐点上切线与基线的交点间的距离。W=色谱流出曲线的意义:色谱峰数=样品中单组份的最少个数色谱保留值定性依据色谱峰高或面积定量依据色谱保留值或区域宽度色谱柱分离效能评价指标色谱峰间距固定相或流动相选择是否合适的依据。色谱分析的目的是将样品中各组分彼此分离。组分要达到完全分离两峰间的距离必须足够远这是由各组份在两相间的分配系数决定即由色谱过程的热力学性质决定。同时还要求每个组份峰宽足够小这样才能避免彼此重叠这是由组份在色谱柱中的传质和扩散决定即由色谱过程的动力学性质决定。因此研究、解释色谱分离行为应从热力学和动力学两方面进行。三色谱法基本原理(一)、描述分配过程的参数分配系数(Distributionconstant,K):描述组份在固定相和流动相间的分配过程或吸附脱附过程的参数称为分配系数。K只与固定相和温度有关与两相体积、柱管特性和所用仪器无关。msccK溶质在流动相中的浓度溶质在固定相中的浓度在一定条件下各种物质的K是不同的。K较小的组分在色谱分析中每次分配后在气相中的浓度较大因此较早流出色谱柱。K较大的组分每次分配后在气相中浓度较小因此较晚流出色谱柱。分配比(Retentionfactororcapacityfactor,k):在一定温度和压力下组份在两相间的分配达平衡时分配在固定相和流动相中的质量比称为分配比它反映了组分在柱中的迁移速率。又称保留因子或容量因子。其中VmVVs为固定相体积Vm为柱中流动相体积。分配比k的求算:)组分滞留因子:)又)因此mmssmsVcVcmmk组分在流动相中的质量组分在固定相中的质量kmmmuuRsmmss流动相线速度组分线速度rstLutLu''rtk)(VVttttkttrrrK与k的关系:称为相比率它也是反映色谱柱柱型特点的参数。对填充柱=~对毛细管柱=~。选择因子:色谱柱对A、B两组分的选择因子定义如下:A为先流出的组分B为后流出的组分。注意:K或k反映的是某一组分在两相间的分配而是反映两组分间的分离情况!当两组分K或k相同时=时两组分不能分开当两组分K或k相差越大时越大分离得越好。也就是说两组分在两相间的分配系数不同是色谱分离的先决条件。和k是计算色谱柱分离效能的重要参数!kVVkVmVmccKsmmmssmsABAB'r'rKKkk)A(t)B(t(二)、塔板理论(Platetheory)年Martin等人提出的塔板理论将一根色谱柱当作一个由许多塔板组成的精馏塔用塔板概念来描述组分在柱中的分配行为。塔板是从精馏中借用的是一种半经验理论但它成功地解释了色谱流出曲线呈正态分布。塔板理论假定:)塔板之间不连续)塔板之间无分子扩散)组分在各塔板内两相间的分配瞬间达至平衡达一次平衡所需柱长为理论塔板高度H)某组分在所有塔板上的分配系数相同)流动相以不连续方式加入即以一个一个的塔板体积加入。当塔板数n较少时组分在柱内达分配平衡的次数较少流出曲线呈峰形但不对称当塔板数n>时峰形接近正态分布。塔板号r载气体积进样mMmS△VmMmS△VmMmS△VmMmS例:为简单起见设色谱柱由决塔板(n=n为柱子的塔板数)组成并以r表示塔板编号。r=某组分的分配比k=。根据上述假定在色谱分离过程中。该组分的分布可计算如下:当n=时即个塔板体积的流动相进入柱中时组分就开始从柱口流出进入检测器产生信号。出现的峰形不对称这是由于塔板数太少的原因。当塔板数大于时峰形就是对称的。在实际色谱柱中n值很大(约为~)。所以色谱峰一般为正态分布。色谱流出曲线方程实际色谱柱N值很大为~因而洗出曲线一般趋近正态分布可近似地用正态分布函数描述溶质分布除以流动相体积即可导出浓度变化方程:当V=VR=nmax△Vm洗出色谱峰此时溶质最大浓度Cmax,其流动相体积为VR即为溶质保留体积:RVMNCmaxmaxRVVRVNeCCmaxRttRtNeCCRVVVNVMeNCRR理论塔板的计算公式令VR–V=△V当洗出溶质浓度C为最大浓度Cmax一半即CmaxC=时△V用△V表示:)(maxRVVNeCClnttVVVVNRRRWtNRNLH理论塔板的计算公式为了扣除死时间的影响引入以调整保留时间tR’计算的有效理论塔板数Neff和有效理论塔板高Heff的作为柱效指标。''tttttttNRRMReffeffeffNLHeffNkkNeffHkkH理论塔板数Neff越多、理论塔板高度H越小、色谱峰越窄则柱效越高。有关塔板理论的说明:)说明柱效时必须注明该柱效是针对何种物质、固定液种类及其含量、流动相种类及流速、操作条件等)应定期对柱效进行评价以防柱效下降、延长柱寿命。)塔板理论描述了组分在柱内的分配平衡和分离过程、导出流出曲线的数学模型、解释了流出曲线形状和位置、提出了计算和评价柱效的参数。但该理论是在理想情况下导出的未考虑分子扩散因素、其它动力学因素对柱内传质的影响。因此它不能解释:峰形为什么会扩张?影响柱效的动力学因素是什么?(三)、速率理论年荷兰化学工程师vanDeemter提出了色谱过程动力学速率理论:吸收了塔板理论中的板高H概念考虑了组分在两相间的扩散和传质过程从而给出了vanDeemter方程:u为流动相线速度ABC为常数其中A分别表示涡流扩散系数B分子扩散系数C传质阻力系数(包括液相和固相传质阻力系数)。该式从动力学角度很好地解释了影响板高(柱效)的各种因素!任何减少方程右边三项数值的方法都可降低H从而提高柱效。CuuBAH)涡流扩散项(Multipathterm,A)在填充柱中由于受到固定相颗粒的阻碍组份在迁移过程中随流动相不断改变方向形成紊乱的“涡流”:从图中可见因填充物颗粒大小及填充的不均匀性同一组分运行路线长短不同流出时间不同峰形展宽。展宽程度以A表示:A=dp其中dp填充物平均直径填充不规则因子。可见使用细粒的固定相并填充均匀可减小A提高柱效。对于空心毛细管柱无涡流扩散即A=。流动方向)分子扩散项(Longitudinaldiffusionterm,Bu)纵向分子扩散是由于浓度梯度引起的。当样品被注入色谱柱时它呈“塞子”状分布。随着流动相的推进“塞子”因浓度梯度而向前后自发地扩散使谱峰展宽。其大小为B=D称为弯曲因子它表示固定相几何形状对自由分子扩散的阻碍情况D组分在流动相中的扩散系数。组份为气体或液体时分别以Dg或Dm表示。)(流动相因为MDg球状颗粒大分子量流动相适当增加流速短柱低温。讨论:分子量大的组分Dg小即B小Dg随柱温升高而增加随柱压降低而减小流动相分子量大Dg小即B小u增加组份停留时间短纵向扩散小(Bu)对于液相色谱因Dm较小B项可忽略。)传质阻力项(Masstransferterm,Cu)因传质阻力的存在使分配不能“瞬间”达至平衡因此产生峰形展宽。气相色谱以气体为流动相液相色谱以液体为流动相二者传质过程不完全相同。下面分别作讨论。a)气液色谱:传质阻力项C包括气相传质阻力系数Cg和液相传质阻力系数Cl。Dd)k(kDd)k(kCCClfgplg流动相固液界面固定液组分分子ClCg讨论:减小填充颗粒直径dp采用分子量小的流动相使Dg增加减小液膜厚度dfCl下降。但此时k又减小。因此当保持固定液含量不变时可通过增加固定液载体的比表面来降低df。但比表面过大又会因吸附过强使峰拖尾。增加柱温可增加Dl但k值也减小为保持合适Cl值应控制柱温。b)液液色谱:传质阻力项C包括流动相传质阻力系数Cm和固定相传质阻力系数Cs。讨论:流动相传质阻力包括两方面:流动相中的传质阻力、滞留的流动相传质阻力。分别与填充物大小dp、扩散系数(Dm)、微孔大小及其数量等有关。因此降低流动相传质阻力的方法有:细颗粒固定相、增加组分在固定相和流动相中的扩散系数D、适当降低线速度、短柱。固定相传质阻力与液膜厚度df、保留因子k和扩散系数Ds等有关。因此降低固定相传质阻力的方法与气液色谱中的表述相同。sfsmpsmmsmDdDd)(CCCsm)流速u由vanDeemter方程H=ABuCu知道:当u一定时仅在A、B、C较小时H较小柱效较高反之则柱效较低色谱峰将展宽。以u对H作图可得Hu曲线(如图)从该曲线得到:CBBCA涡流扩散项A与流速u无关低流速区(u小)Bu大分子扩散项占主导此时选择分子量大的气体如N和Ar为载气可减小扩散提高柱效高流速区(u大)Cu大传质阻力项占主导时选择分子量小的气体如H和He为载气可增加扩散系数提高柱效曲线的最低点对应最佳线速uopt()下的最小板高Hmin()LC的Hmin和uopt均比GC的小一个数量级即在LC中较低流速可获得较大的柱效。板高H(cm)HminCmuCsuABu)固定相颗粒大小对板高的影响实验表明颗粒越细板高越小受线速影响越小。即在HPLC分析中采用细粒作固定相的理论根据!但颗粒细导致柱流速慢当采用高压技术才能实现HPLC的分析要求。上面分别介绍了影响色谱分离的基本原理以及影响柱效的各种因素但是如何从总体上定量描述色谱分离效能?如何将各种影响因素对分离的影响定量地表述出来呢?板高,H(cm)四分离度分离度(Resolution,R)同时反映色谱柱效能和选择性的一个综合指标。也称总分离效能指标或分辨率。其定义为:利用此式可直接从色谱流出曲线上求出分离度R。R越大相邻组分分离越好。当R=时分离程度可达因此R=通常用作是否分开的判据。W)tt(WW)tt()WW(ttRrrrrrrR=R=R=响应信号保留时间t,min)(nR)kk)((nReff或五色谱分离方程R的定义并未反映影响分离度的各种因素。也就是说R未与影响其大小的因素:柱效n、选择因子和保留因子k联系起来。对于相邻的难分离组分由于它们的分配系数K相差小可合理假设kk=kWW=W。因此可导出R与n(neff)、和k的关系:kknkknkkkkknktkktntttnRWWttRkttnWrrrrrr)()()()()(:)()(t)Wt(nrr并整理如下代入到将上式及因具体推导过程如下:)分离度与柱效的关系分离度R与理论塔板数n有关即R受热力学性质的影响。对具一定相对保留值的物质对R与有效塔板数neff有关说明neff可正确代表柱效能。由色谱方程可得:因此可通过增加柱长提高分离度。然而分析时间也相应增加且峰宽也展宽!为提高柱效用减小塔板高度H的方法比增加柱长更有效。LLnn)RR()分离度与选择因子的关系R正比于(α)α。α=R=两组分不可能分离α略大于两组分才可能分离α>~分离比较容易实现。α从增大到(α)α增加近倍。相比之下k从增大到k(k)从变化至接近于只增大一倍。显然α是影响R最敏感的因素。保持k在~的范围内提高α值可采取下述措施:改变流动相组成降低柱温改变固定相)分离度与容量因子的关系k增加分离度R增加但当k>则R的增加不明显。通常k在~之间。改变k的方法有:增加柱温(GC)、流动相性质和组成(LC)以及固定相含量。可以写成:则如果设))((R,))((kknnQkkQRCHOHHOCHOHHOCHOHHOCHOHHO溶剂(流动相)组成对色谱分离的影响:,蒽醌:甲基,蒽醌:乙基,蒽醌:,二甲基,蒽醌:特丁基甲基,蒽醌改变组成使k最佳)分离度与分析时间的关系分析时间通常指最后一个组分出峰的时间。由以下三式:得到可见分析时间与Rk、Hu等参数有关。R增加倍分析时间则是原来的倍。实际工作中即要能获得有效的分离又要在较短时间内完成分析。)()kk)((nR)(HLn)()k(uL)k(ttrrk)k()(uHRt色谱分离中的问题由于分析物组成复杂以某组成的流动相可能使部分待测物得到好的分离但同时出使其它待测物的分离不令人满意!实际工作中采用程序升温(GC)和梯度淋洗(LC)来解决这个问题。参数符号测定或计算死时间(迁移时间)不参与分配组分t色谱图保留时间组分和rrtt色谱图调整保留时间组分'rtr'rttt峰宽组分和WW色谱图柱长L直接测量流速Fco直接测量流(固)定相体积VmVs填充制备记录流(固)定相浓度cmcs分析和制备记录概念、表示方法及计算公式汇总表参数符号测定或计算线速tLu流动相体积comFtV保留因子rt)tt(kmsVKVk分配系数smVkVKmsccK选择因子rrttttKKkk分离度rrWW)tt(R)kk)((nR塔板数r)Wt(n)kk()(Rn板高NLH保留(分析)时间rk)k()(uHRt表

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